Luận án tiến sĩ nghiên cứu đa dạng và phát triển nguồn gen một số loài lan hài paphiopedilum đặc hữu khu vực miền núi phía bắc việt nam

Luận án tiến sĩ nghiên cứu nghiên cứu đa dạng và phát triển nguồn gen một số loài lan hài paphiopedilum đặc hữu khu vực miền, phân tích chuyên sâu, xây dựng mô hình lý thuyết, đề

• Tác giả: Nguyễn Thà Tình
• Người hướng dẫn: GS.TS Ngô Xuân Bình
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Di truyền và chọn giống cây trồng
• Đề tài: Nghiên cứu đa dạng và phát triển nguồn gen lan hài Paphiopedilum tại miền núi phía Bắc Việt Nam
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ nông nghiệp
• Năm xuất bản: 2024
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• 1. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
• 1.1. Khái quát chung về lan hài
• 1.2. Phân loại lan hài
• 1.3. Sự phân bố của lan hài
• 1.4. Sự đa dạng của các loài lan hài
• 1.5. Nghiên cứu đa dạng di truyền lan hài trên thế giới và Việt Nam
• 1.5.1. Nghiên cứu đa dạng di truyền lan hài trên thế giới
• 1.5.2. Nghiên cứu đa dạng di truyền của lan hài ở Việt Nam
• 1.6. Đặc điểm sinh học lan hài
• 1.6.1. Đặc điểm hình thái của lan hài
• 1.6.2. Đặc điểm sinh thái lan hài
• 1.7. Tình hình sản xuất và tiêu thụ lan hài trên thế giới và ở Việt Nam
• 1.7.1. Tình hình sản xuất và tiêu thụ lan hài trên thế giới
• 1.7.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ lan hài ở Việt Nam
• 1.8. Nghiên cứu hiện trạng và các giải pháp nhằm mục đích bảo tồn lan hài trên thế giới và ở Việt Nam
• 1.8.1. Hiện trạng và các giải pháp bảo tồn lan hài trên thế giới
• 1.8.2. Hiện trạng và giải pháp bảo tồn lan hài ở Việt Nam
• 1.9. Nghiên cứu về khả năng nhân giống lan hài trên thế giới và ở Việt Nam
• 1.10. Các kết luận qua phân tích tổng quan
• 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu nghiên cứu
• 2.2. Phân bón, hóa chất, dụng cụ và thiết bị
• 2.3. Nội dung nghiên cứu
• 2.3.1. Đánh giá một số đặc điểm thực vật học của các loài lan hài thu thập ở khu vực miền núi phía Bắc
• 2.3.2. Đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen các loài hài của khu vực miền núi phía Bắc Việt Nam
• 2.3.3. Đánh giá khả năng lai tạo của một số tổ hợp có tiềm năng nhằm tạo ra dòng hài có triển vọng
• 2.3.4. Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống đối với một số loài hài có giá trị và đánh giá khả năng tái sinh của con lai
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4.1. Thu thập nguồn gen các loài lan hài được trồng và phân bố tại các khu vực miền núi phía Bắc
• 2.4.2. Phương pháp mô tả, đánh giá đặc điểm hình thái của các loài lan hài
• 2.4.3. Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền dựa vào kiểu hình
• 2.4.4. Phương pháp và kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền dựa vào chỉ thị phân tử
• 2.4.5. Phương pháp lai tạo lan hài
• 2.4.6. Thành phần dinh dưỡng các loại phân bón
• 2.4.7. Phương pháp nghiên cứu nhân giống in vitro đối với lan hài Việt Nam và sản phẩm lai
• 2.4.8. Phương pháp nghiên cứu nhân giống tách chồi lan hài Điểm Ngọc
• 2.4.9. Điều kiện thí nghiệm và các chỉ tiêu theo dõi
• 2.4.9.1. Điều kiện thí nghiệm
• 2.4.9.2. Các chỉ tiêu theo dõi
• 2.4.10. Phương pháp xử lý số liệu
• 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Thu thập, đánh giá thực trạng và giá trị của các loài lan hài khu vực miền núi phía Bắc
• 3.1.1. Thu thập và đánh giá đặc điểm sinh thái nguồn gen các loài lan hài khu vực miền núi phía Bắc
• 3.1.2. Tình hình khai thác, sử dụng và nuôi trồng. Khả năng bảo tồn và phát triển
• 3.2. Đặc điểm hình thái và đa dạng di truyền của các loài lan hài đã thu thập
• 3.2.1. Đặc điểm hình thái của các loài lan hài phân bố và trồng khu vực miền núi phía Bắc
• 3.2.2. Đa dạng di truyền nguồn gen các loài lan hài phân bố và nuôi trồng tại khu vực miền núi phía Bắc Việt Nam
• 3.3. Đánh giá, xác định một số loài lan hài có triển vọng, tiềm năng phát triển và đề xuất hướng bảo tồn và phát triển
• 3.4. Xác định nguồn gen ưu tú để thiết lập các cặp bố mẹ phục vụ công tác lai tạo
• 3.5. Đánh giá khả năng lai tạo của 9 cặp bố mẹ lan hài
• 3.6. Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống đối với một số loài lan hài có giá trị và một số sản phẩm lai
• 3.6.1. Nghiên cứu khả năng nhân giống bằng phương pháp nhân giống in vitro đối với hài Việt Nam và sản phẩm lai
• 3.6.2. Nghiên cứu khả năng tái sinh chồi của các sản phẩm lai
• 3.6.3. Kết quả nghiên cứu nhân giống hài Điểm Ngọc bằng phương pháp tách chồi
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tính cấp thiết của đề tài

Khu vực miền núi phía Bắc Việt Nam là nơi có sự đa dạng sinh học phong phú, đặc biệt là các loài lan hài Paphiopedilum. Tuy nhiên, sự khai thác quá mức và biến đổi khí hậu đã dẫn đến nguy cơ tuyệt chủng cho nhiều loài. Việc nghiên cứu đa dạng và phát triển nguồn gen của lan hài không chỉ giúp bảo tồn các loài này mà còn tạo ra cơ hội phát triển kinh tế bền vững cho cộng đồng địa phương. Đề tài này nhằm đánh giá tình hình hiện tại của các loài lan hài, từ đó đề xuất các biện pháp bảo tồn và phát triển nguồn gen hiệu quả.

II. Đặc điểm sinh học và phân loại lan hài

Lan hài Paphiopedilum được phân loại vào họ lan (Orchidaceae) và có khoảng 75 loài trên toàn thế giới. Đặc điểm nổi bật của lan hài là cấu trúc hoa hình túi, giúp chúng dễ dàng nhận diện. Sự đa dạng sinh học của lan hài không chỉ thể hiện ở số lượng loài mà còn ở các biến thể hình thái và sinh thái. Nghiên cứu về đặc điểm sinh học của lan hài sẽ cung cấp thông tin quan trọng cho việc bảo tồn và phát triển nguồn gen. Các loài lan hài tại miền núi phía Bắc Việt Nam có sự thích nghi cao với môi trường sống, điều này càng làm tăng giá trị của chúng trong nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn.

III. Tình hình khai thác và bảo tồn lan hài

Tình hình khai thác lan hài tại miền núi phía Bắc đang diễn ra mạnh mẽ, dẫn đến sự suy giảm số lượng cá thể trong tự nhiên. Nhiều loài đã được đưa vào danh sách đỏ và có nguy cơ tuyệt chủng. Việc bảo tồn nguồn gen lan hài là rất cần thiết để duy trì sự đa dạng sinh học và bảo vệ các loài quý hiếm. Các biện pháp bảo tồn như xây dựng khu bảo tồn, phát triển các chương trình nhân giống và giáo dục cộng đồng về giá trị của lan hài cần được triển khai. Nghiên cứu này sẽ cung cấp cơ sở khoa học cho các chính sách bảo tồn hiệu quả.

IV. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện thông qua việc thu thập mẫu lan hài từ các khu vực khác nhau tại miền núi phía Bắc. Các phương pháp phân tích hình thái và di truyền sẽ được áp dụng để đánh giá đa dạng di truyền của các loài. Kỹ thuật nhân giống in vitro cũng sẽ được sử dụng để phát triển các dòng giống mới có giá trị. Việc áp dụng các phương pháp hiện đại trong nghiên cứu sẽ giúp nâng cao hiệu quả bảo tồn và phát triển nguồn gen lan hài. Các kết quả thu được sẽ là cơ sở cho việc đề xuất các giải pháp bảo tồn và phát triển bền vững.

V. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy sự đa dạng di truyền cao của các loài lan hài tại miền núi phía Bắc. Nghiên cứu đã xác định được một số loài có tiềm năng phát triển và đề xuất các biện pháp bảo tồn hiệu quả. Các dòng giống mới được nhân giống thành công sẽ góp phần vào việc phát triển kinh tế địa phương thông qua du lịch sinh thái và thương mại hoa. Việc bảo tồn và phát triển nguồn gen lan hài không chỉ có ý nghĩa về mặt sinh học mà còn mang lại lợi ích kinh tế cho cộng đồng. Điều này khẳng định giá trị thực tiễn của nghiên cứu trong việc bảo tồn và phát triển bền vững nguồn gen lan hài.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Khu vực miền núi phía Bắc Việt Nam (gồm các tỉnh Đông Bắc và Tây Bắc như Quảng Ninh, Lạng Sơn, Thái Nguyên, Bắc Kạn, Cao Bằng, Hà Giang, Tuyên Quang, Lào Cai, Sơn La...) là trung tâm đa dạng sinh học có diện tích rừng, vườn quốc gia và khu bảo tồn thiên nhiên lớn. Chi lan hài (Paphiopedilum) tại Việt Nam ghi nhận sự hiện diện của 26 loài, chiếm khoảng 37% tổng số loài lan hài trên thế giới. Nhiều loài có giá trị thẩm mỹ, thương mại và giá trị khoa học cao nhờ sự biến thái đặc trưng của cánh môi dạng túi hình chiếc hài, sự đa dạng về màu sắc hoa, vân lá và hương thơm.

Tuy nhiên, áp lực khai thác thương mại tự nhiên quá mức cùng với sự suy thoái môi trường sống đã đẩy nhiều loài lan hài bản địa vào tình trạng nguy cấp. Về mặt sinh học, lan hài có khả năng tự nhân giống tự nhiên rất hạn chế do hạt không có nội nhũ, quá trình nảy mầm phụ thuộc hoàn toàn vào nấm cộng sinh; bộ rễ có lớp vỏ lụa biểu bì đặc thù nên dễ bị tổn thương, thối hỏng và khó phát sinh rễ mới khi di thực. Sách đỏ Việt Nam năm 2006 đã xếp 13 loài lan hài vào tình trạng nguy cấp và xếp loài hài Việt Nam (Paphiopedilum vietnamense) ở mức tuyệt chủng ngoài tự nhiên (EW). Đến năm 2019, Nghị định số 06/2019/NĐ-CP của Chính phủ đã bổ sung 9 loài vào nhóm IA, nâng tổng số loài lan hài nguy cấp cần bảo vệ nghiêm ngặt lên 22 loài và 1 loài tuyệt chủng ngoài tự nhiên.

Thực tế công tác nghiên cứu lan hài tại Việt Nam đối mặt với nhiều khó khăn: các loài có sự tương đồng lớn về hình thái thân lá khi không có hoa dẫn đến nhầm lẫn trong định danh; kỹ thuật nhân giống in vitro khó khăn do mẫu cấy khó khử trùng và tỷ lệ nảy mầm thấp; kỹ thuật nhân giống vô tính tách chồi chưa được chuẩn hóa theo từng loài cụ thể. Do đó, luận án "Nghiên cứu đa dạng và phát triển nguồn gen một số loài lan hài (Paphiopedilum) đặc hữu khu vực miền núi phía Bắc Việt Nam" được thực hiện nhằm giải quyết khoảng trống về đánh giá di truyền phân tử, phục hồi và phát triển các nguồn gen lan hài quý hiếm.

Mục tiêu nghiên cứu

Đánh giá đa dạng di truyền các loài hài của khu vực miền núi phía Bắc bằng chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử để xác định mối quan hệ di truyền các loài lan hài thu thập được làm cơ sở cho việc chọn tạo nguồn vật liệu di truyền tốt phục vụ cho nhân giống, bảo tồn và lai tạo, tạo tiền đề phát triển một số loài lan hài có giá trị phục vụ sản xuất và nhu cầu chơi hoa.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

• Đối tượng nghiên cứu: Các cá thể cây lan hài thu thập tại các tỉnh khu vực miền núi phía Bắc Việt Nam, bao gồm cây trưởng thành phục vụ đánh giá hình thái, mẫu lá phục vụ phân tích ADN, quả sau thụ phấn 8 tháng tuổi và thân bánh tẻ phục vụ nhân giống.
• Phạm vi không gian: Tập trung điều tra, thu thập nguồn gen lan hài phân bố tự nhiên và nuôi trồng tại các tỉnh miền núi phía Bắc (Thái Nguyên, Cao Bằng, Hà Giang, Tuyên Quang, Lai Châu, Bắc Kạn, Quảng Ninh).
• Phạm vi thời gian: Quá trình thu thập mẫu giống thực hiện từ tháng 6 dương lịch đến tháng 5/2022; các thí nghiệm phân tích hình thái, sinh học phân tử, lai tạo và nhân giống được theo dõi và đánh giá trong giai đoạn 2017 – 2023.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trước đây

1. Phân loại học và đa dạng hình thái:
   • E. Pfitzer (1886) lần đầu tiên mô tả các loài thuộc chi Paphiopedilum. Các nghiên cứu sau đó của Cribb (1987, 1998), Hoàng Thị Sản (2002), Nguyễn Tiến Bân (1990), Nguyễn Thiện Tịch (2001) và Averyanov cùng cộng sự (2004, 2008) đã hệ thống hóa phân loại chi Paphiopedilum gồm khoảng 75–80 loài trên thế giới.
   • De cùng cộng sự (2019), Tsiftsis (2016), Zhang cùng cộng sự (2016) phân tích cấu trúc hoa, dạng cánh môi, chiều rộng cánh hoa và hình thái lá làm khóa phân loại cổ điển.
2. Nghiên cứu đa dạng di truyền và chỉ thị phân tử (DNA Barcoding):
   • Trên thế giới: Hollingsworth cùng cộng sự (2009) đánh giá hiệu quả của hai đoạn gen lục lạp rbcL và matK. Yao cùng cộng sự (2010) sử dụng vùng ITS2 trên 85 loài Paphiopedilum. Parveen cùng cộng sự (2012) thử nghiệm 5 mã vạch (rpoB, rpoC1, rbcL, matK, ITS) trên các loài lan hài Ấn Độ và chứng minh matK cùng ITS có khả năng phân biệt loài cao.
   • Tại Việt Nam: Khuất Hữu Trung cùng cộng sự (2009, 2010) phân tích trình tự vùng gen nhân ITS-rDNA và kỹ thuật RAPD-PCR trên loài hài Gấm (P. concolor). Phan Kế Lộc cùng cộng sự (2009) xác định độ dài đoạn ITS-rDNA của 5 loài hài dao động 659–700 bp. Nguyễn Thị Mỹ Duyên cùng cộng sự (2010), Trần Duy Dương cùng cộng sự (2018) nghiên cứu chỉ thị ITS trên các loài phong lan. Huyen Trang Vu cùng cộng sự (2019, 2020) nghiên cứu giải trình tự bộ gen lục lạp của P. delenatii và sàng lọc 8 locus (ITS, LEAFY, ACO, matK, trnL, rpoB, rpoC1, trnH-psbA), kết luận tổ hợp ITS + matK định danh chính xác 17/22 loài lan hài Việt Nam. Nguyễn Thị Hải Yến cùng cộng sự (2020) ứng dụng gen rbcL định danh loài hài Hằng (P. hangianum).
3. Nghiên cứu nhân giống in vitro và tách chồi:
   • Kamemoto (2000), Chyuam-Yih Ng & Norihan Mohd (2011) nghiên cứu tạo protocorm thứ cấp trên môi trường 1/2 MS bổ sung Kinetin và nước dừa (CW). Vu Quoc Luan cùng cộng sự (2019) nhân giống P. delenatii trên môi trường SH bổ sung TDZ và tạo rễ trên nền NAA.
   • Tại Việt Nam: Đặng Như Xuyến (2006) nghiên cứu tách mầm hài Hằng. Trần Duy Quý cùng cộng sự (2005, 2007) nhân giống P. delenatii trên môi trường Knudson C và MS bổ sung TDZ, BA, Zeatin. Hoàng Thị Giang cùng cộng sự (2010) và Viện Sinh học Nông nghiệp nhân giống P. hangianum trên môi trường RE bổ sung dịch chiết chuối, nước dừa và NAA. Nguyễn Phúc Huy cùng cộng sự (2018) nhân giống Kim hài (P. villosum) từ đốt thân in vitro trên môi trường SH bổ sung TDZ 0,5 mg/L. Vũ Thị Lan cùng cộng sự (2019) nghiên cứu nảy mầm hạt hài Gấm trên môi trường MS có BAP 2 mg/L. Phạm Anh Tám cùng cộng sự (2019) bảo tồn hài Vân Bắc (P. purpuratum) và hài Lông (P. hirsutissimum) bằng phương pháp tách mầm và in vitro.

Khoảng trống nghiên cứu được luận án lựa chọn giải quyết

Mặc dù đã có các công trình nghiên cứu riêng lẻ về hình thái hoặc từng đoạn gen cụ thể, các nguồn gen lan hài đặc hữu tại khu vực miền núi phía Bắc vẫn chưa được đánh giá một cách đồng bộ từ kiểu hình đến kiểu gen. Thiếu hụt các nghiên cứu thực nghiệm bài bản về lai tạo có định hướng giữa các loài bản địa ưu tú, cũng như quy trình nhân giống hoàn chỉnh (in vitro và tách chồi) cho các loài đặc biệt nguy cấp như hài Việt Nam (P. vietnamense) và hài Điểm Ngọc (P. emersonii).

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

Luận án vận dụng lý thuyết phân loại thực vật học hình thái kết hợp phát sinh chủng loại phân tử; lý thuyết di truyền và chọn giống cây trồng; nguyên lý nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro (tính toàn năng của tế bào thực vật, tương tác giữa các nhóm chất điều hòa sinh trưởng Auxin và Cytokinin trong phân hóa chồi và tạo rễ).

Phương pháp nghiên cứu cụ thể

1. Phương pháp thu thập và bảo tồn nguồn gen

Thu thập theo quy chuẩn của Viện Tài nguyên Di truyền Thực vật Quốc tế (IPGRI, 2001 - nay là Bioversity International). Thu thập cây con giai đoạn 3–5 lá từ 3 khu vực, ưu tiên các cá thể khỏe mạnh, không sâu bệnh, bảo quản vận chuyển trong hộp xốp về trồng chăm sóc tại nhà lưới trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.

Danh mục 23 mẫu giống thuộc 20 loài lan hài thu thập tại khu vực miền núi phía Bắc:

Ký hiệu	Tên loài / Tên địa phương	Tên khoa học	Số lượng mẫu	Địa điểm thu thập
H1	Hài Vệ nữ	Paphiopedilum hirsutissimum	20	Lai Châu
H2	Kim hài	Paphiopedilum villosum	20	Lai Châu
H3	Hài Việt Nam (hộ dân)	Paphiopedilum vietnamense	20	Thái Nguyên
H4	Mác vàng	Paphiopedilum micranthum	20	Lai Châu
H5	Hài Hồng	Paphiopedilum delenatii	20	Bắc Kạn
H6	Hài Vân Nam	Paphiopedilum callosum	20	Tuyên Quang
H7	Hài Hằng	Paphiopedilum hangianum	50	Tuyên Quang
H8	Hài Táo	Paphiopedilum appletonianum	100	Thái Nguyên
H9	Hài Đuôi công	Paphiopedilum gratrixianum	30	Lai Châu
H10	Hài Lông	Paphiopedilum herrmannii	100	Cao Bằng
H11	Hài helen	Paphiopedilum helenae	100	Cao Bằng
H12	Hài Jacki	Paphiopedilum malipoense var. jackii	30	Cao Bằng
H13	Hài Henry	Paphiopedilum henryanum	30	Cao Bằng
H14	Hài Vân Nam	Paphiopedilum callosum	50	Thái Nguyên
H15	Hài Vân Bắc	Paphiopedilum purpuratum	50	Quảng Ninh
H16	Hài Xanh	Paphiopedilum malipoense	50	Tuyên Quang
H17	Hài Chân tím	Paphiopedilum tranlienianum	200	Thái Nguyên
H18	Hài Điểm Ngọc	Paphiopedilum emersonii	150	Tuyên Quang
H19	Hài Gấm	Paphiopedilum concolor	200	Bắc Kạn
H20	Hài Hồng	Paphiopedilum delenatii	100	Thái Nguyên
H21	Hài Râu	Paphiopedilum dianthum	150	Hà Giang
H22	Hài Việt Nam (tự nhiên)	Paphiopedilum vietnamense	10	Thái Nguyên
H23	Hài Mạng đỏ tía	Paphiopedilum micranthum	150	Tuyên Quang

2. Phương pháp mô tả, đánh giá đặc điểm hình thái

• Áp dụng phương pháp nghiên cứu thực vật học (Nguyễn Nghĩa Thìn, 2007; Dương Đức Huyền, 2007; Leonid Averyanov và cs, 2004) và hệ thống 42 chỉ tiêu mô tả theo quy phạm khảo nghiệm DUS/UPOV.
• Quan sát thực hiện trên 10 cá thể/bộ phận mẫu. Đánh giá tính đồng nhất ở mức chuẩn 1% với xác suất chấp nhận tối thiểu 95%.
• Đo đếm số lá, chiều cao lá, chiều cao cây, thời gian nở hoa, đường kính hoa (đo lúc 8–10h sáng ngày thứ 2 sau nở), kích thước đài lưng, cánh hoa, cánh môi và cột nhị nhụy. Đánh giá màu sắc dưới nguồn sáng chuẩn CIE D6,500 / BS 950 trên nền trắng.
• Xử lý số liệu hình thái và phân nhóm phát sinh bằng phần mềm NTSYS-pc 2.0.

3. Phương pháp sinh học phân tử đánh giá đa dạng di truyền

• Tách chiết ADN tổng số: Áp dụng phương pháp CTAB (Doyle & Doyle, 1990) cải tiến gồm 10 bước:
  1. Chuẩn bị dung dịch đệm chiết CTAB (Tris-base 100 mM, EDTA 20 mM, NaCl 1,4 M, CTAB 2%) ở 60°C.
  2. Nghiền 0,3 g mẫu lá bằng cối chày sứ trong nitơ lỏng thành bột mịn.
  3. Hòa tan mẫu nghiền trong 800 µl đệm CTAB và 60 µl SDS 10%.
  4. Ủ mẫu ở 65°C trong bể ổn nhiệt 60 phút.
  5. Bổ sung Chloroform, lắc nhẹ thành dạng nhũ tương, ly tâm 11.000 vòng/phút trong 30 phút ở 4°C, thu dịch nổi.
  6. Chiết lần 2 bằng Chloroform.
  7. Tủa ADN bằng Isopropanol lạnh.
  8. Ly tâm thu tủa 10.500 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C.
  9. Rửa tủa bằng Ethanol 70%, làm khô và hòa tan trong đệm TE.
  10. Loại ARN bằng RNase ở 37°C trong 1 giờ, sau đó lặp lại các bước tủa và rửa.
• Kiểm tra chất lượng ADN: Điện di trên gel Agarose 0,8% (pha trong TAE 1X, nhuộm Ethidium Bromide) ở điện thế 100V, cường độ 3A trong 15 phút; soi dưới đèn UV và kiểm tra độ tinh sạch qua tỷ số $OD_{260}/OD_{280} = 1,8 - 2,0$.
• Phản ứng PCR khuếch đại vùng gen ITS:
  • Cặp mồi: ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3', $Tm = 59^\circ\text{C}$) và ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3').
  • Phân tích trình tự nucleotide bằng công cụ BLAST trên cơ sở dữ liệu NCBI, so sánh với các trình tự tham chiếu trên GenBank để thiết lập ma trận tương đồng di truyền và cây phát sinh chủng loại.

4. Phương pháp lai tạo và nhân giống

• Kỹ thuật lai tạo: Thụ phấn nhân tạo trên 9 cặp bố mẹ lựa chọn. Theo dõi ảnh hưởng của thời gian nở hoa đến sức sống hạt phấn, thời điểm thụ phấn trong ngày đến tỷ lệ đậu quả, và liều lượng phân bón gốc đến sinh trưởng quả lai sau 7 tháng.
• Nhân giống in vitro: Sử dụng quả 8 tháng tuổi của loài P. vietnamense và các tổ hợp lai. Khử trùng bề mặt bằng cồn 70°, $H_2O_2$ và $HgCl_2$ 0,1%. Gieo hạt nảy mầm trên môi trường MS cơ bản. Thử nghiệm nhân nhanh chồi với Cytokinin (BAP 2–4 mg/L kết hợp Kinetin 0,4–0,6 mg/L) và kích thích ra rễ với Auxin ($\alpha\text{-NAA}$ 1,5 mg/L, IAA). Ra ngôi cây con trên các giá thể (rêu Chile, dớn) và chế độ dinh dưỡng vườn ươm.
• Nhân giống tách chồi: Thực hiện trên thân bánh tẻ loài P. emersonii. Đánh giá ảnh hưởng của chủng loại phân bón, nồng độ phân bón, thời điểm tách nhánh, thành phần và tỷ lệ phối trộn giá thể sau 60 ngày, 90 ngày và 3 tháng.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan các vấn đề nghiên cứu

• Hệ thống hóa vị trí phân loại học của chi lan hài (Paphiopedilum): thuộc phân họ Cypripedioideae, họ Orchidaceae. Chi có khoảng 75–80 loài phân bố chủ yếu tại vùng nhiệt đới châu Á.
• Phân tích sinh thái học: Lan hài Việt Nam chia thành 2 nhóm sinh thái rõ rệt:
  1. Nhóm núi đá vôi (độ cao 0–1600 m): P. vietnamense, P. concolor, P. hangianum, P. micranthum, P. helenae. Môi trường có độ dốc lớn, mùn giàu canxi, chịu hạn định kỳ.
  2. Nhóm đá axit silicat, đá phiến, cát kết (độ cao 700–2200 m): P. callosum, P. villosum, P. gratrixianum, sinh trưởng trong rừng hỗn giao, độ ẩm cao.
• Đánh giá hiện trạng suy giảm quần thể: Phân tích nguyên nhân suy thoái do thu hái tự nhiên phục vụ buôn bán trái phép và áp lực phá hủy sinh cảnh rừng. Khái quát các quy định bảo tồn (Sách đỏ Việt Nam 2006, 2007; Nghị định 06/2019/NĐ-CP; CITES Phụ lục I & II).
• Tổng quan thực nghiệm nhân giống: Tổng kết các hạn chế của việc nuôi cấy mô tế bào chi Paphiopedilum (mô cấy khó vô trùng, hạt không có nội nhũ, khả năng tạo mô sẹo kém) và các tiến bộ trong kỹ thuật cứu phôi từ hạt quả non, nuôi cấy đốt thân và tách mầm gốc.

Chương 2: Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu

• Mô tả chi tiết 23 mẫu giống lan hài thuộc 20 loài thu thập tại 7 tỉnh miền núi phía Bắc.
• Chuẩn hóa quy trình 42 chỉ tiêu hình thái DUS/UPOV áp dụng cho lan hài.
• Chi tiết hóa hóa chất, dụng cụ và thiết bị phục vụ sinh học phân tử và nuôi cấy mô.
• Xây dựng quy trình 10 bước tách chiết ADN bằng CTAB cải tiến và chu trình nhiệt PCR cho cặp mồi ITS1/ITS4.
• Bố trí các công thức thí nghiệm lai tạo 9 cặp bố mẹ, thí nghiệm nuôi cấy mô in vitro (giai đoạn vô trùng, nảy mầm, nhân chồi, ra rễ, thuần hóa vườn ươm) và thí nghiệm tách chồi vô tính theo khối ngẫu nhiên hoàn chỉnh (RCB).

Chương 3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận

• Đặc điểm hình thái và phân nhóm kiểu hình:
  • Xác định các tính trạng đặc trưng về thân, rễ, lá (dạng lá khảm hoặc lá xanh trơn, kích thước lá từ dưới 3 cm ở P. helenae đến 50 cm ở P. dianthum) và hoa (kích thước, màu sắc đài lưng, cánh bên, cánh môi hình túi).
  • Phân tích cụm 5 tính trạng hình thái chính bằng phần mềm NTSYS-pc giúp phân chia các mẫu giống thành các nhóm rõ rệt, phản ánh sự thích nghi sinh thái.
• Đa dạng di truyền phân tử dựa trên vùng gen ITS:
  • Khuếch đại thành công đoạn gen ITS ở 23 mẫu giống bằng cặp mồi ITS1/ITS4.
  • Phân tích thành phần nucleotide và ma trận khoảng cách di truyền: Xác định mức độ tương đồng di truyền cao giữa các mẫu cùng loài thu thập ở các địa phương khác nhau (ví dụ các mẫu P. callosum, P. delenatii, P. vietnamense) và phát hiện các vị trí sai khác nucleotide đặc trưng cho từng loài so với mẫu tham chiếu trên NCBI.
  • Xây dựng cây phát sinh chủng loại phân tử, làm rõ mối quan hệ di truyền giữa các loài có hình thái tương đồng (như phân biệt P. hangianum và P. emersonii; các biến thể P. malipoense var. jackii).
• Lựa chọn nguồn gen ưu tú và kết quả lai tạo:
  • Tuyển chọn 2 loài ưu tú có giá trị thẩm mỹ cao và nguy cơ tuyệt chủng lớn để tập trung bảo tồn, nhân giống: Hài Việt Nam (P. vietnamense) và hài Điểm Ngọc (P. emersonii).
  • Đánh giá khả năng lai tạo trên 9 cặp bố mẹ: Thời gian bảo quản hạt phấn và thời điểm nở hoa ảnh hưởng trực tiếp đến sức sống hạt phấn. Thời điểm thụ phấn thích hợp nhất trong ngày cho tỷ lệ đậu quả cao. Bổ sung dinh dưỡng phân bón gốc cho cây mẹ giúp quả lai phát triển ổn định sau 7 tháng. Thu được 03 tổ hợp lai có triển vọng.
• Kết quả nhân giống in vitro hài Việt Nam (P. vietnamense) và sản phẩm lai:
  • Khử trùng quả 8 tháng tuổi bằng dung dịch khử trùng tối ưu cho tỷ lệ mẫu vô trùng cao sau 7 ngày nuôi cấy.
  • Hạt nảy mầm đạt tỷ lệ cao sau 6 tháng nuôi cấy trên môi trường MS.
  • Giai đoạn nhân nhanh chồi (sau 60 ngày): Môi trường MS bổ sung BAP 4 mg/L kết hợp Kinetin (0,4–0,6 mg/L) cho hệ số nhân chồi cao và chồi sinh trưởng tốt.
  • Giai đoạn tạo rễ (sau 60 ngày): Môi trường bổ sung $\alpha\text{-NAA}$ 1,5 mg/L (hoặc IAA thích hợp) kích thích hình thành rễ hoàn chỉnh, rễ mập và nhiều lông hút.
  • Giai đoạn vườn ươm: Cây con in vitro chuyển ra vườn ươm đạt tỷ lệ sống cao nhất khi trồng trên giá thể rêu Chile kết hợp chế độ phân bón lá phù hợp.
  • Tái sinh thành công cây con hoàn chỉnh của 03 tổ hợp lai và bước đầu theo dõi đặc điểm hình thái lá con lai so với bố mẹ.
• Kết quả nhân giống tách chồi hài Điểm Ngọc (P. emersonii):
  • Đánh giá ảnh hưởng của chủng loại và nồng độ phân bón: Xác định chế độ dinh dưỡng kích thích khả năng đẻ nhánh tối ưu sau 60 ngày.
  • Xác định thời điểm tách chồi thích hợp giúp cây con sinh trưởng thuận lợi sau 2 tháng.
  • Khảo sát giá thể: Hỗn hợp giá thể phối trộn tối ưu giúp cây sau tách nhánh đạt tỷ lệ sống và phát triển thân rễ tốt sau 90 ngày và 3 tháng theo dõi.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt khoa học

1. Cung cấp hệ thống dữ liệu toàn diện về đặc điểm sinh thái học, hình thái học (theo quy phạm 42 chỉ tiêu DUS/UPOV) và đa dạng di truyền phân tử (vùng gen ITS-rDNA) của 23 mẫu giống thuộc 20 loài lan hài phân bố tự nhiên và nuôi trồng tại khu vực miền núi phía Bắc Việt Nam.
2. Xác định các sai khác nucleotide đặc trưng và mức độ tương đồng di truyền giữa các loài lan hài bản địa, cung cấp bằng chứng phân tử phục vụ định danh chính xác các loài có kiểu hình tương đồng khi không có hoa.

Đóng góp mới về mặt thực tiễn

1. Tuyển chọn được 2 loài lan hài quý hiếm, có giá trị thẩm mỹ cao nhưng đang bị đe dọa nghiêm trọng để đưa vào quy trình nhân giống bảo tồn: loài hài Việt Nam (P. vietnamense - mức Tuyệt chủng ngoài tự nhiên EW) và loài hài Điểm Ngọc (P. emersonii - mức Rất nguy cấp CR).
2. Xây dựng thành công quy trình nhân giống in vitro từ hạt quả 8 tháng tuổi cho loài lan hài Việt Nam (P. vietnamense), hoàn thiện các công đoạn từ khử trùng, nảy mầm, nhân nhanh chồi (MS + BAP 4 mg/L + Kinetin), ra rễ (MS + $\alpha\text{-NAA}$ 1,5 mg/L) đến chăm sóc vườn ươm trên giá thể rêu Chile.
3. Hoàn thiện quy trình kỹ thuật nhân giống vô tính bằng phương pháp tách chồi cho loài hài Điểm Ngọc (P. emersonii), xác định loại phân bón kích thích đẻ nhánh, thời điểm tách mầm và thành phần giá thể trồng.
4. Thiết lập và lai tạo thành công 9 cặp bố mẹ lan hài, tạo ra và tái sinh thành công cây con hoàn chỉnh của 03 tổ hợp lai có triển vọng.

Kiến nghị và đề xuất

• Ứng dụng quy trình nhân giống in vitro và tách chồi đã hoàn thiện vào các trung tâm cứu hộ, vườn quốc gia và cơ sở sản xuất giống nhằm nhân nhanh nguồn cây giống phục vụ tái thả tự nhiên và thương mại hóa.
• Tiếp tục theo dõi, đánh giá các chỉ tiêu nông sinh học và đặc điểm hoa của 03 dòng lai khi cây bước vào giai đoạn ra hoa hoàn chỉnh.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế: Phạm vi thu thập mẫu tập trung chính tại các tỉnh miền núi phía Bắc; các cá thể con lai mới được đánh giá ở giai đoạn cây con in vitro và giai đoạn vườn ươm ban đầu, chưa đủ thời gian để đánh giá đầy đủ đặc tính hoa của thế hệ lai thương phẩm (do chu kỳ sinh trưởng của lan hài từ hạt đến khi ra hoa kéo dài nhiều năm).
• Hướng nghiên cứu tiếp:
  1. Tiếp tục chăm sóc và theo dõi chu kỳ nở hoa của các dòng lan lai để đánh giá độ bền, màu sắc, hương thơm và tính ổn định di truyền của hoa con lai.
  2. Mở rộng nghiên cứu chỉ thị phân tử đa locus (kết hợp ITS với các mã vạch lục lạp như matK, rbcL) trên toàn bộ tập đoàn lan hài Việt Nam.
  3. Thử nghiệm tối ưu hóa quy trình sản xuất giống quy mô công nghiệp phục vụ xuất khẩu.

---

Giá trị tham khảo

• Đối với công tác đào tạo và nghiên cứu: Là tài liệu chuyên khảo cho giảng viên, nghiên cứu sinh, học viên cao học thuộc các chuyên ngành Di truyền và Chọn giống cây trồng, Công nghệ sinh học thực vật, Bảo tồn đa dạng sinh học và Nông nghiệp. Cung cấp bộ số liệu chuẩn hóa về 42 chỉ tiêu hình thái DUS và trình tự mồi ITS1/ITS4 cho chi Paphiopedilum.
• Đối với cơ quan quản lý và bảo tồn thiên nhiên: Cung cấp cơ sở khoa học cho các Vườn quốc gia, Khu bảo tồn thiên nhiên trong việc xây dựng phương án bảo tồn chuyển chỗ (ex situ) và phục hồi quần thể (in situ) các loài lan hài nguy cấp theo Nghị định 06/2019/NĐ-CP và Sách đỏ.
• Đối với sản xuất nông nghiệp công nghệ cao: Cung cấp quy trình thông số môi trường nhân giống in vitro và giá thể thuần hóa vườn ươm phục vụ các cơ sở nuôi cấy mô thương mại.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Luận án đã thu thập và đánh giá bao nhiêu loài và mẫu giống lan hài tại miền núi phía Bắc?

Luận án đã thu thập tổng cộng 23 mẫu giống thuộc 20 loài lan hài (Paphiopedilum) phân bố tự nhiên và nuôi trồng tại các tỉnh miền núi phía Bắc (như Thái Nguyên, Cao Bằng, Hà Giang, Tuyên Quang, Lai Châu, Bắc Kạn, Quảng Ninh), ký hiệu từ H1 đến H23.

2. Cặp mồi nào được sử dụng trong phân tích di truyền phân tử và điều kiện gắn mồi ra sao?

Luận án sử dụng cặp mồi khuếch đại vùng gen nhân ITS gồm:

• Mồi xuôi ITS1: 5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'
• Mồi ngược ITS4: 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'
• Nhiệt độ gắn mồi ($Tm$) được xác định là $59^\circ\text{C}$.

3. Hai loài lan hài trọng tâm được luận án chọn lọc để nghiên cứu nhân giống bảo tồn là gì?

Luận án chọn lọc hai loài đặc hữu, có giá trị thẩm mỹ cao nhưng đang bị đe dọa nghiêm trọng:

1. Hài Việt Nam (Paphiopedilum vietnamense): loài có phân hạng Tuyệt chủng ngoài tự nhiên (EW) theo Sách đỏ Việt Nam.
2. Hài Điểm Ngọc (Paphiopedilum emersonii): loài có phân hạng Rất nguy cấp (CR) theo Sách đỏ Việt Nam.

4. Quy trình nhân giống in vitro lan hài Việt Nam (P. vietnamense) sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng nào?

• Giai đoạn nảy mầm: Sử dụng hạt từ quả 8 tháng tuổi gieo trên môi trường MS.
• Giai đoạn nhân nhanh chồi: Môi trường MS bổ sung BAP nồng độ 4 mg/L kết hợp với Kinetin (0,4–0,6 mg/L).
• Giai đoạn ra rễ tạo cây hoàn chỉnh: Môi trường MS bổ sung $\alpha\text{-NAA}$ nồng độ 1,5 mg/L (hoặc IAA).
• Giai đoạn thuần hóa vườn ươm: Cây con ra ngôi sinh trưởng tốt nhất trên giá thể rêu Chile.

5. Kết quả thực nghiệm lai tạo của luận án đạt được như thế nào?

Luận án đã đề xuất và tiến hành lai tạo trên 9 cặp bố mẹ lan hài tiềm năng, khảo sát các yếu tố sinh lý hạt phấn và thời điểm thụ phấn, qua đó thu được và tái sinh thành công cây con hoàn chỉnh của 03 tổ hợp lai có triển vọng.

---

Kết luận

Luận án của nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Tình đã giải quyết một cách có hệ thống các vấn đề khoa học và thực tiễn liên quan đến nguồn gen lan hài (Paphiopedilum) đặc hữu tại khu vực miền núi phía Bắc Việt Nam. Thông qua việc kết hợp đánh giá 42 chỉ tiêu hình thái theo chuẩn DUS/UPOV và phân tích trình tự phân tử vùng gen ITS-rDNA, công trình đã làm sáng tỏ mức độ đa dạng di truyền và mối quan hệ phát sinh loài của 23 mẫu giống thu thập. Luận án đã hoàn thiện thành công quy trình nhân giống in vitro cho loài hài Việt Nam (P. vietnamense), quy trình tách chồi cho loài hài Điểm Ngọc (P. emersonii), đồng thời lai tạo và tái sinh thành công 03 tổ hợp lan hài mới, đóng góp thiết thực cho công tác bảo tồn đa dạng sinh học và phát triển nguồn gen hoa cây cảnh có giá trị kinh tế.

Trích đoạn nội dung tài liệu

NGUYÄN THà TÌNH NGHIÊN CĀU ĐA D¾NG VÀ PHÁT TRIÂN NGUàN GEN MÞT SÞ LOÀI LAN HÀI (Paphiopedilum) Đ¾C HĀU KHU VĂC MIÀN NÚI PHÍA BÂC VIÆT NAM LUÀN ÁN TI¾N S) NÔNG NGHIÆP HÀ NÞI – 2023 BÞ GIÁO DĀC VÀ ĐÀO T¾O BÞ NÔNG NGHIÆP VÀ PTNT VIÆN KHOA HâC NÔNG NGHIÆP VIÆT NAM NGUYÄN THà TÌNH NGHIÊN CĀU ĐA D¾NG VÀ PHÁT TRIÂN NGUàN GEN MÞT SÞ LOÀI LAN HÀI (Paphiopedilum) Đ¾C HĀU KHU VĂC MIÀN NÚI PHÍA BÂC VIÆT NAM Ngành: Di truyÁn và Chãn gißng cây tráng Mã sß: 962.11 LUÀN ÁN TI¾N S) NÔNG NGHIÆP Ng°ái h°ßng dẫn khoa học: 1. Ngô Xuân Bình 2. TrÅn Ngãc Hùng HÀ NÞI – 2024 i LàI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan, đây là công trình nghiên cứu căa tôi. Các sá liệu và kÁt quÁ nghiên cứu trong lu¿n án này là trung thực và ch°a từng đ°ÿc công bá trong b¿t kỳ một công trình nào khác.

Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ, hÿp tác cho việc thực hiện lu¿n án này đã đ°ÿc cám ¢n và các thông tin trích dẫn trong lu¿n án này đều đ°ÿc chỉ dẫn rõ nguồn gác. Tác giÁ luÁn án NguyÅn Thá Tình ii LàI CÀM ¡N Để hoàn thành lu¿n án này, tôi đã nh¿n đ°ÿc sự quan tâm giúp đỡ nhiệt tình căa các Th¿y, Cô giáo, các t¿p thể, cá nhân cùng b¿n bè đồng nghiệp và gia đình. Tôi xin bày tß lòng biÁt ¢n sâu sÁc nh¿t tßi GS.TS Ngô Xuân Bình - Bộ khoa học và Công nghệ, TS. TrÅn Ngãc Hùng - Viện Nghiên cứu Rau QuÁ.

Hai Th¿y đã t¿n tình h°ßng dẫn, giúp đỡ, động viên và t¿o điều kiện tát nh¿t cho tôi trong suát quá trình thực hiện đề tài cũng nh° hoàn thành lu¿n án. Tôi xin chân thành cÁm ¢n Viện Nghiên cứu Rau QuÁ, các b¿n bè đồng nghiệp trong Viện Nghiên cứu Rau QuÁ đã t¿o điều kiện thu¿n lÿi nh¿t cho tôi trong quá trình học t¿p và thực hiện nghiên cứu. Tôi xin chân thành cÁm ¢n các Th¿y, Cô giáo, các anh, chị, em trong Ban Đào t¿o sau đ¿i học, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam đã t¿n tình giúp đỡ và chỉ bÁo tôi trong suát quá trình học t¿p và thực hiện nghiên cứu. Tôi xin chân thành cÁm ¢n các t¿p thể, cá nhân, Khoa CNSH – CNTP tr°áng Đ¿i học Nông Lâm Thái Nguyên đã hÿp tác giúp đỡ và chia sẻ thông tin, kinh nghiệm quý báu, cung c¿p các mẫu giáng lan hài trong quá trình thực hiện nghiên cứu.

Đặc biệt cÁm ¢n các tác giÁ có tên trong các bài báo khoa học đã công bá đã hỗ trÿ và giúp đỡ tôi trong quá trình tiÁn hành các thí nghiệm căa lu¿n án. Nghiên cứu đ°ÿc nh¿n tài trÿ bãi Bộ khoa học và Công nghệ thông qua Đề tài c¿p Nhà n°ßc Mã sá: NVQG. Nghiên cứu sinh xin trân trọng cÁm ¢n Bộ khoa học và Công nghệ. Cuái cùng tôi vô cùng biÁt ¢n các thành viên trong gia đình đã luôn bên c¿nh, động viên khích lệ, tiÁp thêm sức m¿nh và nghị lực để tôi hoàn thiện công trình nghiên cứu này.

Tôi xin chân thành cÁm ¢n! Hà Nội, ngày 02 tháng 02 năm 2024 Tác giÁ NguyÅn Thá Tình iii DANH MĀC CHĀ VI¾T TÂT Chā vi¿t tÃt DiÅn giÁi ABI Applied Biosystems Incorporated Amplified Fragment Length Polymorphism (Đa hình chiều dài AFLP đo¿n nhân bÁn) BA Benzyladenine Basic Local Alignment Search Tool (Công cā tìm kiÁm sÁp gióng BLAST cột từng ph¿n c¢ bÁn) CTAB Cetyltrimethylammonium bromide (Dung dịch đệm) CV Coefficient of Variation (Hệ sá biÁn động) EDTA Ethylenediamine tetraacetate EtBr Ethidium bromide GA3 Gibberellin (Hormone sinh tr°ãng thực v¿t) IAA Indole - 3 - acetic acid (Hormone sinh tr°ãng thực v¿t) IBA Indole - 3 - butyric acid (Hormone sinh tr°ãng thực v¿t) ISSR Inter - Simple Sequence Repeat (Đo¿n lặp trình tự đ¢n) ITS Internal transcribed spacer LSD Least Significant Difference Test matK Maturase K (Gen maturase K National Center for Biotechnology Information (Trung tâm NCBI Thông tin Công nghệ sinh học Quác gia) PCR Polymerase Chain Reaction (PhÁn ứng chuỗi Polymerase) QTLs Quantitative trait locus Random Amplified Polymorphic DNAs (DNA đa hình nhân ngẫu RAPD nhiên rbcL Ribulose - bisphosphate carboxylase RCB Randomized Completely Block (Khái Ngẫu nhiên đă) Restriction Fragment Length Polymorphism (Đa hình về chiều RFLP dài căa các đo¿n DNA) SSR Simple Sequence Repeats (Trình tự lặp l¿i đ¢n giÁn) Taq Thermus aquaticus TBE Tris/Borate/EDTA THT Than ho¿t tính α NAA α - Naphthalene acetic acid (Hormone sinh tr°ãng thực v¿t) iv MĀC LĀC LàI CAM ĐOAN .ii DANH MĀC CHĀ VIÀT TÀT .iv DANH MĀC BÀNG .vii DANH MĀC HÌNH. Tính c¿p thiÁt căa đề tài. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn .1 Ý nghĩa khoa học. Ý nghĩa thực tiễn.

Nhāng đóng góp mßi căa đề tài lu¿n án. Đái t°ÿng và ph¿m vi nghiên cứu đề tài. Đái t°ÿng nghiên cứu. Ph¿m vi nghiên cứu.

TâNG QUAN CÁC VÂN ĐÀ NGHIÊN CĀU. Khái quát chung về lan hài. Phân lo¿i lan hài. Sự phân bá căa lan hài .3 Sự đa d¿ng căa các loài lan hài .2 Nghiên cứu đa d¿ng di truyền lan hài trên thÁ gißi và Việt Nam.

Nghiên cứu đa d¿ng di truyền lan hài trên thÁ gißi. Nghiên cứu đa d¿ng di truyền căa lan hài ã Việt Nam. Đặc điểm sinh học lan hài. Đặc điểm hình thái căa lan hài.

Đặc điểm sinh thái lan hài. Tình hình sÁn xu¿t và tiêu thā lan hài trên thÁ gißi và ã Việt Nam. Tình hình sÁn xu¿t và tiêu thā lan hài trên thÁ gißi. Tình hình sÁn xu¿t và tiêu thā lan hài ã Việt Nam.

Nghiên cứu hiện tr¿ng và các giÁi pháp nhằm māc đích bÁo tồn lan hài trên thÁ gißi và ã Việt Nam. Hiện tr¿ng và các giÁi pháp bÁo tồn lan hài trên thÁ gißi. Hiện tr¿ng và giÁi pháp bÁo tồn lan hài ã Việt Nam. Nghiên cứu về khÁ năng nhân giáng lan hài trên thÁ gißi và ã Việt Nam.

Các kÁt lu¿n qua phân tích tổng quan. VÀT LIÆU, NÞI DUNG VÀ PH¯¡NG PHÁP NGHIÊN CĀU. V¿t liệu nghiên cứu. Phân bón, hoá ch¿t, dāng cā và thiÁt bị.

Nội dung nghiên cứu. Đánh giá một sá đặc điểm thực v¿t học căa các loài lan hài thu th¿p ã khu vực miền núi phía BÁc. Đánh giá đa d¿ng di truyền nguồn gen các loài hài căa khu vực miền núi phía BÁc Việt Nam. Đánh giá khÁ năng lai t¿o căa một sá tổ hÿp có tiềm năng nhằm t¿o ra dòng hài có triển vọng.

Nghiên cứu kỹ thu¿t nhân giáng đái vßi một sá loài hài có giá trị và đánh giá khÁ năng tái sinh căa con lai. Ph°¢ng pháp nghiên cứu. Thu th¿p nguồn gen các loài lan hài đ°ÿc trồng và phân bá t¿i các khu vực miền núi phía BÁc. Ph°¢ng pháp mô tÁ, đánh giá đặc điểm hình thái căa các loài lan hài.

Ph°¢ng pháp đánh giá đa d¿ng di truyền dựa vào kiểu hình-. Ph°¢ng pháp và kỹ thu¿t đánh giá đa d¿ng di truyền dựa vào chỉ thị phân tÿ. Ph°¢ng pháp lai t¿o lan hài. 42 Thành ph¿n dinh d°ỡng các lo¿i phân bón nh° sau:.

Ph°¢ng pháp nghiên cứu nhân giáng in vitro đái vßi lan hài Việt Nam và sÁn phÁm lai. Ph°¢ng pháp nghiên cứu nhân giáng tách chồi lan hài Điểm Ngọc. Điều kiện thí nghiệm và Các chỉ tiêu theo dõi. Điều kiện thí nghiệm.

Các chỉ tiêu theo dõi. Ph°¢ng pháp xÿ lý sá liệu. K¾T QUÀ NGHIÊN CĀU VÀ THÀO LUÀN. Thu th¿p, đánh giá thực tr¿ng và giá trị căa các loài lan hài khu vực miền núi phía BÁc.

Thu th¿p và đánh giá đặc điểm sinh thái nguồn gan các loài lan hài khu vực miền núi phía BÁc. Tình hình khai thác, sÿ dāng và nuôi trồng. KhÁ năng bÁo tồn và phát triển. Đặc điểm hình thái và đa d¿ng di truyền căa các loài lan hài đã thu th¿p.

Đặc điểm hình thái căa các loài lan hài phân bá và trồng khu vực miền núi phía BÁc. Đa d¿ng di truyền nguồn gen các loài lan hài phân bá và nuôi trồng t¿i khu vực miền núi phía BÁc Việt Nam. Đánh giá, xác định một sá loài lan hài có triển vọng, tiềm năng phát triển và đề xu¿t h°ßng bÁo tồn và phát triển. Xác định nguồn gen °u tú để thiÁt l¿p các cặp bá mẹ phāc vā công tác lai t¿o.

Đánh giá khÁ năng lai t¿o căa 9 cặp bá mẹ lan hài. Nghiên cứu kỹ thu¿t nhân giáng đái vßi một sá loài lan hài có giá trị và một sá sÁn phÁm lai. Nghiên cứu khÁ năng nhân giáng bằng ph°¢ng pháp nhân giáng in vitro đái vßi hài Việt Nam và sÁn phÁm lai. Nghiên cứu khÁ năng tái sinh chồi căa các sÁn phÁm lai.

KÁt quÁ nghiên cứu nhân giáng hài Điểm Ngọc bằng ph°¢ng pháp tách chồi. 123 K¾T LUÀN VÀ KI¾N NGHà .132 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH Đà CÔNG BÞ CÓ LIÊN QUAN Đ¾N LUẬN ÁN.133 TÀI LIÆU THAM KHÀO. 134 PHĀ LĀC vii DANH MĀC BÀNG TT bÁng Nßi dung bÁng Trang 1.1: Các nhóm lan hài Việt Nam theo thứ tự h¿ng bÁo tồn căa tổ chức bÁo tồn thiên nhiên quác tÁ (IUCN). T¿p đoàn nguồn gen lan hài hài phân bá tự nhiên và đ°ÿc trồng ã khu vực miền núi phía BÁc đ°ÿc thu th¿p năm 2017.

Trình tự các cặp mồi và nhiệt độ gÁn mồi .3 Thành ph¿n và thể tích các ch¿t trong phÁn ứng PCR .4 Chu trình căa phÁn ứng PCR-RAPD. Thành ph¿n cho cây mẹ giai đo¿n thā ph¿n. Thành ph¿n dinh d°ỡng trong phân bón gác lan hài Việt Nam. Dinh d°ỡng chăm sóc lan hài Điểm Ngọc.

Dinh d°ỡng chăm sóc lan hài Điểm Ngọc sau tách nhánh.1: Một sá tính tr¿ng đặc tr°ng lá căa nguồn gen lan hài t¿i khu vực miền núi phía BÁc. Đặc điểm tính tr¿ng đặc tr°ng căa thân, rễ và khÁ năng thích nghi căa nguồn gen lan hài khu vực miền núi phía BÁc. Đặc điểm đặc tr°ng căa hoa căa nguồn gen lan hài khu vực miền núi phía BÁc. Hệ sá t°¢ng đồng di truyền về trình tự nucleotide giāa 23 mẫu giáng lan hài nghiên cứu.

Một sá vị trí sai khác về trình tự nucleotide căa các mẫu giáng nghiên cứu và mẫu tham chiÁu. Ành h°ãng căa thái gian nã hoa đÁn sinh tr°ãng căa h¿t ph¿n ã một sá loài lan hài. Ành h°ãng căa thái điểm lai trong ngày đÁn tỷ lệ đ¿u quÁ căa các cặp lan hài. Ành h°ãng căa phân bón gác đÁn tăng tr°ãng căa quÁ lai sau 7 tháng năm 2019 t¿i Thái Nguyên.

Ành h°ãng căa nồng độ, thái gian khÿ trwng căa một sá dung dịch khÿ trwng đÁn khÁ năng t¿o v¿t liệu vô trwng căa hài Việt Nam sau 7 ngày nuôi c¿y .