Nghiên Cứu Nhân Giống Cây Thạch Tùng Vảy (Huperzia squarrosa) Tại Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM

Khóa luận nghiên cứu nhân giống cây thạch tùng vảy Huperzia squarrosa Forst Trevis, ứng dụng công nghệ sinh học trong bảo tồn và phát triển.

• Tác giả: Nguyễn Đình Vương
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Vũ Phong
• Trường học: Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Nhân Giống Cây Thạch Tùng Vảy (Huperzia squarrosa)
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Thủ Đức

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOAN
• TÓM TẮT
• 1. CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
• 2. CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Tổng quan về cây Thạch tùng vảy (Huperzia squarrosa)
• 2.2. Đặc điểm hình thái học của cây Thạch tùng vảy
• 2.3. Đặc điểm sinh thái, sinh học của Thạch tùng vảy
• 2.4. Thành phần hóa học của cây Thạch tùng vảy
• 2.5. Nguồn Huperzin A trong cây họ Thạch tùng
• 2.6. Vai trò Huperzin A trong y học
• 2.7. Đặc tính chữa bệnh Alzheimer của HupA
• 2.8. Nhân giống về thể băng sinh
• 2.9. Cơ sở khoa học của sự hình thành rễ bất định
• 2.10. Ý nghĩa của nhân giống bằng hom
• 2.11. Nhân giống vô tính bằng nuôi cây mô tế bào thực vật in vitro
• 2.12. Cơ sở khoa học của phương pháp nhân giống vô tính bằng nuôi cây mô tế bào thực vật
• 2.13. Tính toàn năng của tế bào. Tính phân hóa và phản phân hóa của tế bào
• 2.14. Lợi ích của nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro
• 2.15. Tình hình nghiên cứu nhân giống họ Thạch tùng trên thế giới
• 2.16. Tình hình nghiên cứu nhân giống bằng nuôi cấy mô
• 2.17. Tình hình nghiên cứu nhân giống bằng giâm hom
• 2.18. Tình hình nghiên cứu nhân giống họ Thạch tùng ở Việt Nam
• 3. CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Vật liệu nghiên cứu
• 3.2. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm
• 3.3. Điều kiện nuôi cấy
• 3.4. Phương pháp nghiên cứu
• 3.5. Khảo sát ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng và vị trí lấy hom đến khả năng tái sinh thành cây con của cây Thạch tùng vảy
• 3.6. Chuẩn bị giá thể và vườn ươm. Bố trí thí nghiệm
• 3.7. Phương pháp nhân giống vô tính bằng hình thức nuôi cấy mô
• 3.8. Khảo sát ảnh hưởng của Javel ở tỷ lệ và thời gian khác nhau lên khả năng khử trùng cây Thạch tùng vảy
• 3.9. Khảo sát ảnh hưởng môi trường khoáng đến sự sinh trưởng và phát triển của chồi Thạch tùng vảy
• 3.10. Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng và axit amin đến sự hình thành mô sẹo của cây Thạch tùng vảy
• 3.11. Phương pháp xử lý số liệu
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Nhân giống vô tính bằng giâm hom thân
• 4.2. Nhân giống vô tính bằng nuôi cấy mô
• 4.3. Ảnh hưởng của Javel ở các tỷ lệ và thời gian khác nhau lên khả năng khử trùng cây Thạch tùng vảy
• 4.4. Ảnh hưởng môi trường khoáng đến sự sinh trưởng và phát triển của chồi Thạch tùng vảy
• 4.5. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng và axit amin đến sự hình thành mô sẹo của cây Thạch tùng vảy
• 5. CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng quan về Nghiên cứu nhân giống cây Thạch tùng vảy

Nghiên cứu nhân giống cây Thạch tùng vảy (Huperzia squarrosa) tại Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM là một bước tiến quan trọng trong việc bảo tồn và phát triển nguồn gen quý hiếm. Cây Thạch tùng vảy không chỉ có giá trị dược liệu mà còn đóng góp vào sự đa dạng sinh học của Việt Nam. Việc nghiên cứu này nhằm xác định các điều kiện thích hợp cho việc nhân giống cây, từ đó góp phần bảo tồn loài cây này trong tự nhiên.

1.1. Đặc điểm sinh học của cây Thạch tùng vảy

Cây Thạch tùng vảy (Huperzia squarrosa) thuộc họ Lycopodiaceae, có đặc điểm sinh trưởng chậm và khả năng sinh sản kém. Loài cây này thường mọc ở các vùng núi cao và có giá trị dược liệu cao, đặc biệt là trong việc điều trị các bệnh về trí nhớ.

1.2. Tầm quan trọng của nghiên cứu nhân giống

Nghiên cứu nhân giống cây Thạch tùng vảy không chỉ giúp bảo tồn nguồn gen mà còn tạo ra nguồn nguyên liệu cho sản xuất dược phẩm. Việc này đặc biệt quan trọng trong bối cảnh cây đang bị khai thác quá mức.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu nhân giống cây Thạch tùng vảy

Mặc dù cây Thạch tùng vảy có nhiều tiềm năng, nhưng việc nhân giống loài cây này gặp phải nhiều thách thức. Các yếu tố như điều kiện môi trường, kỹ thuật nhân giống và sự suy giảm số lượng cây trong tự nhiên đều ảnh hưởng đến khả năng nhân giống thành công.

2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến tỷ lệ sống của hom giống

Tỷ lệ sống của hom giống cây Thạch tùng vảy phụ thuộc vào nhiều yếu tố như vị trí lấy hom, chất điều hòa sinh trưởng và điều kiện môi trường. Việc nghiên cứu các yếu tố này là cần thiết để tối ưu hóa quy trình nhân giống.

2.2. Khó khăn trong việc bảo tồn nguồn gen

Sự khai thác quá mức và biến đổi khí hậu đã làm giảm đáng kể số lượng cây Thạch tùng vảy trong tự nhiên. Điều này đặt ra thách thức lớn cho việc bảo tồn và phát triển nguồn gen của loài cây này.

III. Phương pháp nhân giống cây Thạch tùng vảy hiệu quả

Để nhân giống cây Thạch tùng vảy, hai phương pháp chính được áp dụng là giâm hom và nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro. Mỗi phương pháp đều có những ưu điểm và nhược điểm riêng, cần được nghiên cứu kỹ lưỡng để đạt hiệu quả cao nhất.

3.1. Phương pháp giâm hom

Giâm hom là phương pháp đơn giản và hiệu quả để nhân giống cây Thạch tùng vảy. Nghiên cứu cho thấy, việc sử dụng hom ở vị trí ngọn và xử lý bằng chất điều hòa sinh trưởng IBA có nồng độ phù hợp sẽ tăng tỷ lệ sống và ra rễ của hom.

3.2. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào

Nuôi cấy mô tế bào là phương pháp hiện đại giúp sản xuất cây giống quy mô lớn. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc khử trùng và sử dụng môi trường dinh dưỡng thích hợp là yếu tố quyết định đến sự thành công của phương pháp này.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy, việc áp dụng các phương pháp nhân giống hiệu quả đã giúp tăng tỷ lệ sống và phát triển của cây Thạch tùng vảy. Những kết quả này không chỉ có giá trị trong nghiên cứu mà còn có thể ứng dụng vào thực tiễn sản xuất dược liệu.

4.1. Tỷ lệ sống và ra rễ của hom giống

Nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ sống của hom giống cây Thạch tùng vảy có thể đạt tới 70% khi áp dụng phương pháp giâm hom với điều kiện tối ưu. Điều này mở ra cơ hội cho việc nhân giống loài cây này trên diện rộng.

4.2. Ứng dụng trong sản xuất dược liệu

Kết quả nghiên cứu có thể được ứng dụng trong sản xuất dược liệu từ cây Thạch tùng vảy, góp phần cung cấp nguồn nguyên liệu cho ngành dược phẩm, đặc biệt là trong điều trị các bệnh về trí nhớ.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu nhân giống cây Thạch tùng vảy tại Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM đã đạt được những kết quả khả quan. Tuy nhiên, cần tiếp tục nghiên cứu để hoàn thiện các phương pháp nhân giống và bảo tồn nguồn gen của loài cây này.

5.1. Tầm quan trọng của việc bảo tồn nguồn gen

Bảo tồn nguồn gen cây Thạch tùng vảy là rất cần thiết để đảm bảo sự tồn tại của loài cây này trong tự nhiên. Việc nghiên cứu và phát triển các phương pháp nhân giống hiệu quả sẽ góp phần vào công tác bảo tồn.

5.2. Hướng nghiên cứu trong tương lai

Trong tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của cây Thạch tùng vảy, từ đó tìm ra các giải pháp tối ưu cho việc nhân giống và bảo tồn loài cây này.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Trước thực trạng biến đổi khí hậu, diện tích rừng tự nhiên bị thu hẹp cùng áp lực khai thác quá mức của con người, tính đa dạng nguồn gen thực vật, đặc biệt là các loài cây dược liệu quý, đang đứng trước nguy cơ suy giảm nghiêm trọng. Cây Thạch tùng vảy (Huperzia squarrosa (Forst.) Trevis), còn gọi là Thạch tùng thân gập hay cây Râu rồng, thuộc họ Thạch tùng (Lycopodiaceae), là loài dược liệu có giá trị cao nhờ chứa hoạt chất chính Huperzin A (HupA). Hoạt chất này có khả năng ức chế mạnh men acetylcholinesterase (AChE), đóng vai trò quan trọng trong việc hỗ trợ và điều trị các chứng suy giảm trí nhớ, thoái hóa thần kinh, đặc biệt là bệnh Alzheimer (AD), cũng như các bệnh lý như nhược cơ, động kinh và sa sút trí tuệ mạch máu.

Trong tự nhiên, Thạch tùng vảy có đặc tính sinh thái đặc thù: là loài biểu sinh (phụ sinh) hoặc bám vách đá ẩm vùng núi cao, ưa ẩm, chịu bóng, tốc độ tăng trưởng rất chậm (chỉ vài centimet mỗi năm) và khả năng tái sinh tự nhiên kém (bào tử đơn bào cần từ 3 đến 8 năm mới nảy mầm và có thể mất đến 7 năm hoặc lâu hơn để phát triển thành thể giao tử). Hiện nay, nguồn dược liệu tự nhiên đang bị khai thác cạn kiệt, trong khi nhu cầu sử dụng HupA thay thế cho loài Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata) ngày càng tăng. Tại Việt Nam, trước thời điểm nghiên cứu này, chưa có công trình nào công bố quy trình nhân giống thành công loài Thạch tùng vảy.

Đề tài khóa luận "Nghiên cứu nhân giống loài Thạch tùng vảy (Huperzia squarrosa (Forst.) Trevis)" do sinh viên Nguyễn Đình Vương thực hiện tại Khoa Khoa học Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh nhằm giải quyết yêu cầu cấp thiết về mặt bảo tồn và phát triển nguồn gen loài dược liệu này.

Mục tiêu chung của đề tài là xác định các điều kiện sinh học và kỹ thuật thích hợp cho việc nhân giống vô tính loài Thạch tùng vảy thông qua hai hình thức: giâm hom thân và nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro.

Nhiệm vụ nghiên cứu được cụ thể hóa thành 4 nội dung:

1. Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng (IBA, NAA) và vị trí lấy hom (hom ngọn V1 và hom thân V2) đến khả năng tái sinh thành cây con của cây Thạch tùng vảy.
2. Khảo sát ảnh hưởng của dung dịch Javel ở các nồng độ và thời gian xử lý khác nhau kết hợp dung dịch kháng sinh lên khả năng khử trùng tạo nguồn mẫu sạch in vitro.
3. Khảo sát ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng khoáng (MS và 1/4 MS) đến sự sinh trưởng, phát triển và khả năng ra rễ của chồi Thạch tùng vảy in vitro.
4. Khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng (IBA, Kinetin) và axit amin (Glutamin) đến sự hình thành mô sẹo (callus) của cây Thạch tùng vảy.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Cây Thạch tùng vảy (Huperzia squarrosa (Forst.) Trevis) có nguồn gốc thu thập từ rừng tự nhiên tại tỉnh Tuyên Quang, được định loại hình thái theo tài liệu của Phạm Hoàng Hộ (1999) và thuần dưỡng sinh trưởng khỏe mạnh tại nhà lưới.
• Thời gian thực hiện: Từ tháng 02/2022 đến tháng 02/2023.
• Không gian nghiên cứu: Phòng Sinh học thực vật ứng dụng, Khoa Khoa học Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận dựa trên các cơ sở sinh học thực nghiệm và sinh lý thực vật:

• Cơ sở sinh lý tạo rễ bất định trong giâm hom: Dựa trên khả năng tái phân hóa của tế bào tiền tượng tầng thành mô phân sinh và mầm rễ bất định khi cành giâm được tách rời khỏi cây mẹ dưới tác động điều hòa của nhóm hormone auxin nội sinh và auxin ngoại sinh bổ sung (IBA - Indole-3-Butyric acid, NAA - 1-Naphthaleneacetic acid).
• Cơ sở công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật (in vitro): Dựa trên học thuyết về tính toàn năng của tế bào thực vật (Haberland, 1902), khả năng phân hóa và phản phân hóa của tế bào đã chuyên hóa quay trở lại trạng thái phôi sinh để hình thành khối tế bào bất định (mô sẹo - callus) khi được cung cấp đầy đủ dinh dưỡng khoáng và tỷ lệ hormone sinh trưởng thích hợp.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm bao gồm:

1. Phương pháp giâm hom sinh dưỡng:

   • Chuẩn bị mẫu: Chọn thân cây khỏe mạnh, chiều dài trên 40 cm; cắt thành các đoạn hom 8 cm (vát gốc). Chia làm 2 nhóm vị trí: hom ngọn (V1) và hom giữa thân cách gốc 17 cm (V2).
   • Xử lý hormone: Khảo sát IBA (500, 1000, 1500 ppm - ngâm 30 phút), NAA (10, 20, 30 ppm - ngâm 5 phút) và đối chứng không xử lý.
   • Giá thể và điều kiện giâm: Hỗn hợp xơ dừa vụn : than củi vụn : trấu hun theo tỷ lệ 3:2:2 (thể tích); nuôi dưỡng trong bầu giâm 7 cm x 7 cm tại nhà lưới có điều kiện ẩm độ và ánh sáng tương đương cây mẹ. Bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD).

2. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro:

   • Quy trình khử trùng mẫu: Mẫu chồi ngọn (2–3 cm) rửa xà phòng 20 phút, ngâm thuốc diệt nấm 40 phút, khử cồn 70% trong 30 giây; sau đó xử lý với Javel ở 3 nồng độ (20%, 30%, 40%) trong 3 mốc thời gian (20, 30, 40 phút); tiếp tục xử lý dung dịch kháng sinh (Ampicillin 2,5 mg/mL + Tetracyclin 2,5 mg/mL) trong 30 phút. Bố trí 9 nghiệm thức (A1–A9), mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần (14 mẫu/lần). Đánh giá tỷ lệ sống sạch và nhiễm sau 10 ngày cấy trên môi trường MS.
   • Khảo sát dinh dưỡng khoáng: Chồi vô trùng được cấy chuyển sang môi trường MS nguyên nồng độ và môi trường 1/4 MS (giảm 1/4 khoáng đa lượng, vi lượng và 1/2 vitamin của MS), bổ sung 20 g/L đường sucrose, 8 g/L agar, pH 5,7–5,8; không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng. Theo dõi tỷ lệ sống, tỷ lệ ra rễ, số rễ sau 60 ngày.
   • Khảo sát cảm ứng tạo mô sẹo: Chồi sống sạch được cấy vào nền 1/4 MS có bổ sung tổ hợp IBA (0; 0,01; 0,015 mg/L), Kinetin (0; 0,3 mg/L) và Glutamin (0; 3 mg/L), gồm 6 nghiệm thức (S1–S6). Thí nghiệm lặp lại 3 lần, mỗi lần 3 bình (3 mẫu/bình, tổng 162 mẫu), theo dõi tỷ lệ tạo sẹo sau 60 ngày.
   • Điều kiện phòng nuôi cấy: Nhiệt độ 25 ± 2°C, độ ẩm 60–70%, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày, cường độ ánh sáng 2000–3000 lux.

3. Phương pháp xử lý số liệu:

   • Sử dụng phần mềm Microsoft Excel 2016 để tính toán các tỷ lệ phần trăm.
   • Dữ liệu tỷ lệ phần trăm ($x$) được chuyển đổi theo công thức $y = \arcsin(\sqrt{x/100})$ trước khi phân tích thống kê.
   • Phân tích phương sai ANOVA (1 yếu tố và 2 yếu tố) và kiểm định so sánh phân hạng trung bình Tukey's HSD ở mức ý nghĩa $P < 0,05$ bằng phần mềm Minitab 16.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Mở đầu

Chương này phân tích bối cảnh suy thoái tài nguyên thực vật rừng, nêu bật giá trị y dược học của cây Thạch tùng vảy (Huperzia squarrosa) nhờ chứa alkaloid Huperzin A có hoạt tính ức chế men AChE điều trị bệnh Alzheimer. Tác giả chỉ rõ thực trạng khan hiếm nguồn nguyên liệu tự nhiên, sự sinh trưởng chậm của loài, đồng thời nhấn mạnh việc chưa có quy trình nhân giống hoàn chỉnh tại Việt Nam. Trên cơ sở đó, chương xác định mục tiêu chung và 4 nội dung nghiên cứu cụ thể về giâm hom và vi nhân giống in vitro.

Chương 2. Tổng quan tài liệu

Tác giả tổng hợp toàn diện hệ thống phân loại học của họ Lycopodiaceae và chi Huperzia, mô tả chi tiết đặc điểm thực vật học, hình thái thân thảo biểu sinh, lá dinh dưỡng không cuống, nhánh sinh sản mang túi bào tử màu vàng hình thận của loài Huperzia squarrosa.

Chương tổng quan sâu sắc về thành phần hóa sinh:

• Cấu trúc phân tử Huperzin A ($C_{15}H_{18}N_2O$, phân tử lượng 242, điểm nóng chảy 230°C, dạng đồng phân quang học $(-)$-huperzin A có hoạt tính).
• Nhóm các alkaloid khác: lycosquarrosamin-A, acetylaposerratinin, lycosquarosin A, lycocernuasid A...
• Cơ chế tác động dược lý của HupA: xuyên qua hàng rào máu não ở liều microgram, ức chế chọn lọc AChE, ngăn chặn sự tích tụ mảng xơ vữa $\beta$-amyloid ngoại bào và đám rối thần kinh nội bào, tăng cường dẫn truyền cholinergic.

Chương cũng phân tích cơ sở sinh lý của sự hình thành rễ bất định trong giâm hom, tính toàn năng và phân hóa tế bào trong nuôi cấy mô, đồng thời điểm luận các công trình nhân giống các loài Thạch tùng trên thế giới (Szypula, Li, Zhou, Ma, Qin, Zhang...) và các nghiên cứu bước đầu tại Việt Nam (Lê Thị Lan Anh, Phan Xuân Bình Minh).

Chương 3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Trình bày chi tiết nguồn mẫu thu nhận tại Tuyên Quang; danh mục hóa chất, môi trường dinh dưỡng (MS, 1/4 MS), hormone sinh trưởng (IBA, NAA, Kinetin), axit amin (Glutamin), chất khử trùng (Javel, cồn 70%, Ampicillin, Tetracyclin); các trang thiết bị phân tích và nuôi cấy. Mô tả chi tiết cách thức bố trí thí nghiệm giâm hom (14 nghiệm thức B1–B14), thí nghiệm khử trùng bề mặt (9 nghiệm thức A1–A9), thí nghiệm khảo sát môi trường khoáng tạo chồi/rễ và thí nghiệm cảm ứng mô sẹo (6 nghiệm thức S1–S6), cùng các công thức tính toán và thuật toán thống kê Minitab 16.

Chương 4. Kết quả và thảo luận

Chương tập hợp toàn bộ các phát hiện thực nghiệm và luận giải cơ chế:

1. Kết quả nhân giống vô tính bằng giâm hom thân

Khảo sát sau 2 tháng cho thấy vị trí lấy hom đóng vai trò quyết định đến khả năng ra rễ:

• Tất cả các nghiệm thức sử dụng hom giữa thân (V2, từ B8 đến B14) hoàn toàn không có khả năng tạo rễ (tỷ lệ ra rễ đạt 0,00%), dù tỷ lệ sống đạt từ 40% đến 100%.
• Nhóm hom phần ngọn (V1, từ B1 đến B7) cho khả năng sinh trưởng và ra rễ vượt trội. Xử lý IBA cho kết quả tối ưu hơn rõ rệt so với NAA.

Nghiệm thức	Vị trí hom	Chất điều hòa sinh trưởng	Thời gian xử lý	Tỷ lệ sống (%)	Tỷ lệ ra rễ (%)	Chiều dài rễ TB (mm)	Số rễ TB (rễ/mẫu)
B1	V1	IBA 500 ppm	30 phút	100,00	100,00	9,8	5,6
B2	V1	IBA 1000 ppm	30 phút	80,00	80,00	8,2	4,2
B3	V1	IBA 1500 ppm	30 phút	100,00	100,00	11,9	6,1
B4	V1	NAA 10 ppm	5 phút	90,00	90,00	7,4	3,7
B5	V1	NAA 20 ppm	5 phút	60,00	60,00	6,9	1,8
B6	V1	NAA 30 ppm	5 phút	20,00	20,00	1,5	0,7
B7	V1	Đối chứng (không xử lý)	-	80,00	80,00	9,6	3,6
B8–B14	V2	IBA / NAA các nồng độ	5–30 phút	40,00–100,00	0,00	0,0	0,0

Nghiệm thức B3 (Hom ngọn V1 xử lý IBA 1500 ppm trong 30 phút) đạt kết quả tối ưu nhất với tỷ lệ sống 100%, tỷ lệ ra rễ 100%, số rễ đạt 6,1 rễ/mẫu và chiều dài rễ đạt 11,9 mm. Đối với NAA, khi tăng nồng độ từ 10 ppm lên 30 ppm, tỷ lệ sống và tỷ lệ ra rễ giảm mạnh từ 90% xuống còn 20%.

2. Kết quả nhân giống vô tính bằng nuôi cấy mô in vitro

• Khử trùng mẫu cấy: Nồng độ Javel và thời gian xử lý ảnh hưởng có ý nghĩa thống kê ($P < 0,05$) đến khả năng tạo mẫu sống sạch sau 10 ngày.

Nghiệm thức	Nồng độ Javel (%)	Thời gian (phút)	Tỷ lệ nhiễm (%)	Tỷ lệ sống sạch (%)
A1	20	20	$97,62 \pm 4,12$	$2,38 \pm 4,13$
A2	20	30	$76,20 \pm 18,00$	$23,80 \pm 18,10$
A3	20	40	$71,43 \pm 14,29$	$28,57 \pm 14,30$
A4	30	20	$61,90 \pm 14,87$	$38,10 \pm 14,87$
A5	30	30	$54,76 \pm 10,91$	$45,24 \pm 10,91$
A6	30	40	$45,24 \pm 10,91$	$54,76 \pm 10,91$
A7	40	20	$33,30 \pm 23,00$	$67,70 \pm 23,00$
A8	40	30	$38,10 \pm 16,50$	$61,90 \pm 16,50$
A9	40	40	$26,20 \pm 18,00$	$73,80 \pm 18,00$

Nghiệm thức A9 (Javel 40% trong 40 phút kết hợp dung dịch kháng sinh 30 phút) cho hiệu quả cao nhất với tỷ lệ sống sạch đạt 73,80%, tỷ lệ nhiễm giảm còn 26,20%.

• Ảnh hưởng của môi trường khoáng: Sau 60 ngày nuôi cấy trên môi trường không chứa chất điều hòa sinh trưởng, môi trường giảm nồng độ khoáng 1/4 MS cho kết quả vượt trội so với môi trường MS chuẩn.

Môi trường	Tỷ lệ sống (%)	Tỷ lệ ra rễ (%)	Số rễ TB (rễ/mẫu)	Trạng thái mẫu cấy
MS	$15,00 \pm 7,07$	$0,00 \pm 0,00$	0,00	Không phát triển, lá vàng dần và chết
1/4 MS	$70,00 \pm 14,07$	$55,00 \pm 7,07$	2,09	Phát triển tốt, thân mập khỏe, lá xanh đậm

• Khảo sát cảm ứng hình thành mô sẹo (Callus): Sau 2 tháng nuôi cấy, tỷ lệ phát sinh mô sẹo ở loài Thạch tùng vảy nhìn chung rất thấp. Mô sẹo chỉ hình thành ở 2 trên 6 nghiệm thức:
  • Nghiệm thức S2 (1/4 MS + 0,01 mg/L IBA + 0,3 mg/L Kinetin): tỷ lệ tạo sẹo đạt cao nhất là 11,11% (3/27 mẫu).
  • Nghiệm thức S5 (1/4 MS + 0,015 mg/L IBA + 0,3 mg/L Kinetin + 3 mg/L Glutamin): tỷ lệ tạo sẹo đạt 3,70% (1/27 mẫu).
  • Các nghiệm thức S1, S3, S4, S6 đều không xuất hiện mô sẹo (tỷ lệ 0,00%). Bổ sung Glutamin 3 mg/L không mang lại hiệu quả tăng sinh mô sẹo ở loài này.

Chương 5. Kết luận và kiến nghị

Tổng kết các kết quả thực nghiệm đạt được về công thức giâm hom, công thức khử trùng mẫu, môi trường dinh dưỡng khoáng thích hợp và công thức kích thích tạo sẹo. Nêu lên các kiến nghị định hướng cho các nghiên cứu tiếp theo.

---

Kết quả và đóng góp

Kết quả chính kèm số liệu thực nghiệm

1. Quy trình giâm hom: Xác định mẫu hom ngọn (V1) xử lý dung dịch IBA nồng độ 1500 ppm trong 30 phút trên giá thể phối trộn (xơ dừa : than củi : trấu hun = 3:2:2) là tối ưu nhất, đạt tỷ lệ sống 100%, tỷ lệ ra rễ 100%, số rễ trung bình đạt 6,1 rễ/mẫu, chiều dài rễ trung bình đạt 11,9 mm sau 60 ngày.
2. Quy trình khử trùng bề mặt chồi in vitro: Thiết lập thành công phương pháp khử trùng nhiều bước sử dụng dung dịch Javel 40% trong 40 phút kết hợp ngâm dung dịch kháng sinh (Ampicillin 2,5 mg/mL + Tetracyclin 2,5 mg/mL) trong 30 phút, đạt tỷ lệ mẫu sống sạch 73,80% sau 10 ngày cấy trên môi trường MS.
3. Môi trường khoáng nuôi cấy chồi: Xác định môi trường khoáng nghèo dinh dưỡng 1/4 MS là phù hợp cho sự sinh trưởng và tái sinh rễ tự nhiên của chồi Huperzia squarrosa, cho tỷ lệ sống 70%, tỷ lệ tạo rễ 55% với số rễ trung bình 2,09 rễ/mẫu, cây con sinh trưởng mập khỏe, lá xanh đậm sau 60 ngày.
4. Cảm ứng mô sẹo: Bước đầu cảm ứng tạo mô sẹo thành công trên môi trường 1/4 MS bổ sung 0,01 mg/L IBA và 0,3 mg/L Kinetin với tỷ lệ tạo sẹo đạt 11,11% sau 60 ngày nuôi cấy.

Đóng góp khoa học và thực tiễn của tác giả

• Đóng góp mới về kỹ thuật giâm hom: Khóa luận là công trình đầu tiên tại Việt Nam chứng minh sự khác biệt quyết định giữa các vị trí lấy hom trên thân cây Thạch tùng vảy. Tác giả phát hiện chỉ có hom phần ngọn (V1) mới có khả năng cảm ứng ra rễ (đạt 100%), trong khi hom giữa thân (V2) hoàn toàn không ra rễ (0%), đây là dữ liệu thực nghiệm quan trọng chưa từng được công bố trước đó cho loài này.
• Đóng góp về phương pháp khử trùng an toàn: Nghiên cứu đã thành công trong việc dùng Javel nồng độ cao (40%) kết hợp kháng sinh thông thường để tạo mẫu sạch đạt 73,80%, loại bỏ sự phụ thuộc vào thủy ngân clorua ($HgCl_2$) — một hóa chất cực độc thường dùng trong các nghiên cứu quốc tế trên chi Huperzia nhưng gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng.
• Ý nghĩa thực tiễn: Cung cấp các thông số kỹ thuật nền tảng phục vụ công tác bảo tồn nguồn gen quý Huperzia squarrosa và mở ra hướng chủ động sản xuất sinh khối thu nhận hoạt chất Huperzin A dùng trong công nghiệp dược phẩm.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

• Tỷ lệ cảm ứng tạo mô sẹo (callus) còn thấp (cao nhất mới đạt 11,11%), chưa khảo sát được nhiều tổ hợp nồng độ chất điều hòa sinh trưởng cũng như các loại axit amin khác nhau.
• Số lượng mẫu hom ngọn (V1) trên mỗi cá thể cây mẹ còn hạn chế, dẫn đến việc lặp lại thí nghiệm ở nhóm hom ngọn chưa đạt quy mô lớn như nhóm hom giữa thân.
• Thí nghiệm mới dừng lại ở giai đoạn tạo chồi và rễ in vitro cơ bản, chưa tiến hành giai đoạn nhân nhanh cụm chồi quy mô lớn, tạo phôi vô tính hoàn chỉnh hay giai đoạn ra ngôi huấn luyện cây giống ngoài vườn ươm.

Hướng nghiên cứu tiếp (theo kiến nghị của tác giả)

• Tiếp tục khảo sát các yếu tố ảnh hưởng sâu hơn đến khả năng tạo mô sẹo của cây Thạch tùng vảy như: độ dày lát cắt mẫu, vị trí giải phẫu của mẫu cấy, ảnh hưởng của các axit amin khác ở dải nồng độ cao hơn.
• Nghiên cứu mở rộng các phương pháp nhân giống in vitro chuyên sâu: nhân giống thông qua hệ thống mô sẹo huyền phù tế bào và con đường phát sinh phôi vô tính (somatic embryogenesis) nhằm nâng cao hệ số nhân giống.

---

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu chuyên khảo thực nghiệm có giá trị đối với:

• Sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu sinh thuộc các ngành Công nghệ Sinh học, Sinh học thực vật, Nông học, Dược liệu học đang thực hiện các đề tài về nhân giống vô tính, vi nhân giống cây rừng và cây thuốc quý hiếm.
• Các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô và trung tâm bảo tồn nguồn gen thực vật: Có thể ứng dụng trực tiếp công thức giâm hom ngọn kết hợp IBA 1500 ppm và quy trình khử trùng mẫu bằng Javel 40% không sử dụng $HgCl_2$.
• Các nhà nghiên cứu hóa sinh và dược học: Tham khảo dữ liệu tổng quan chi tiết về nhóm alkaloid của họ Thạch tùng, cấu trúc Huperzin A và cơ chế dược lý đối với bệnh Alzheimer.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao hom giâm ở vị trí giữa thân (V2) lại không thể hình thành rễ dù vẫn duy trì tỷ lệ sống?
Dữ liệu thực nghiệm của khóa luận cho thấy tất cả các nghiệm thức sử dụng hom V2 (cách gốc 17 cm) đều đạt tỷ lệ ra rễ là 0,00%, trong khi hom ngọn V1 đạt tỷ lệ ra rễ lên tới 100%. Điều này được giải thích là do các mô ở phần ngọn non có khả năng phân chia tế bào mạnh, mức độ trẻ hóa cao và khả năng tổng hợp cũng như đáp ứng với auxin nội sinh/ngoại sinh tốt hơn nhiều so với phần thân già phía dưới đã bị hóa gỗ hoặc giảm khả năng phản phân hóa.

2. Phương pháp khử trùng mẫu in vitro của khóa luận có điểm gì cải tiến so với các công bố quốc tế trước đây?
Nhiều nghiên cứu quốc tế trước đây trên cây Thạch tùng răng cưa (như Li và ctv, 2009; Zhou và ctv, 2009) sử dụng muối thủy ngân clorua ($HgCl_2$ 0,10%) để khử trùng. Khóa luận này đã thay thế hoàn toàn bằng dung dịch Javel 40% trong 40 phút kết hợp hỗn hợp kháng sinh Ampicillin 2,5 mg/mL và Tetracyclin 2,5 mg/mL trong 30 phút, đạt tỷ lệ mẫu sống sạch 73,80%, vừa đảm bảo hiệu quả sạch nấm/khuẩn vừa an toàn cho người thao tác và không gây ô nhiễm môi trường.

3. Vì sao môi trường dinh dưỡng khoáng 1/4 MS lại vượt trội hơn môi trường MS đầy đủ trong nuôi cấy chồi Thạch tùng vảy?
Sau 60 ngày nuôi cấy, môi trường 1/4 MS cho tỷ lệ sống 70% và tỷ lệ ra rễ 55%, trong khi môi trường MS chuẩn chỉ đạt tỷ lệ sống 15% và 0% ra rễ (chồi bị vàng lá và chết). Nguyên nhân xuất phát từ đặc tính sinh thái tự nhiên của Thạch tùng vảy là loài biểu sinh, thích nghi với điều kiện dinh dưỡng nghèo kiệt trên vỏ cây hoặc mùn rêu vách đá; môi trường MS nguyên nồng độ có hàm lượng muối khoáng quá cao gây ức chế sinh trưởng và ngộ độc khoáng đối với mô cấy của loài này.

4. Axit amin Glutamin có vai trò như thế nào trong quá trình tạo mô sẹo ở nghiên cứu này?
Thực nghiệm cho thấy việc bổ sung 3 mg/L Glutamin vào môi trường 1/4 MS không làm tăng tỷ lệ tạo mô sẹo. Ở nghiệm thức S2 (không có Glutamin) tỷ lệ tạo sẹo đạt 11,11%, trong khi ở nghiệm thức S4 (bổ sung 3 mg/L Glutamin) tỷ lệ tạo sẹo là 0,00%, và ở S5 (có Glutamin) tỷ lệ chỉ đạt 3,70%. Kết quả này cho thấy ở nồng độ 3 mg/L, Glutamin chưa thể hiện vai trò kích thích phân chia tế bào tạo callus ở Thạch tùng vảy.

5. Hoạt chất chính Huperzin A trong cây Thạch tùng vảy có cơ chế dược lý gì đối với bệnh Alzheimer?
Huperzin A (HupA) là một alkaloid có khả năng vượt qua hàng rào máu não với liều lượng rất nhỏ tính bằng microgram để ức chế đặc hiệu và thuận nghịch enzyme acetylcholinesterase (AChE). Việc vô hiệu hóa AChE giúp ngăn ngừa sự phân hủy chất dẫn truyền thần kinh acetylcholine (ACh), làm tăng nồng độ ACh trong não, qua đó cải thiện chức năng nhận thức, trí nhớ, đồng thời ức chế sự tích tụ mảng xơ vữa $\beta$-amyloid ngoại bào — nguyên nhân cốt lõi gây thoái hóa tế bào thần kinh ở bệnh nhân Alzheimer.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Nguyễn Đình Vương đã xây dựng thành công các thông số kỹ thuật quan trọng cho quá trình nhân giống loài cây dược liệu quý Thạch tùng vảy (Huperzia squarrosa (Forst.) Trevis) bằng hai phương pháp giâm hom sinh dưỡng và nuôi cấy mô in vitro. Nghiên cứu đã xác định phương pháp giâm hom ngọn xử lý IBA 1500 ppm cho tỷ lệ ra rễ tuyệt đối 100%, quy trình khử trùng bằng Javel 40% kết hợp kháng sinh đạt tỷ lệ mẫu sạch 73,80%, và chứng minh môi trường khoáng nghèo 1/4 MS là tối ưu cho sự sống sót và ra rễ của chồi in vitro. Đây là công trình thực nghiệm có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao, đặt nền tảng vững chắc cho công tác bảo tồn nguồn gen bản địa và phát triển nguồn nguyên liệu chiết xuất Huperzin A tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1. MỞ DAU ooe.ccecccccecsceccsesssesseessessesseesseesssesecssessscssessssiesssssesiessessuseseesiecseeeseeees | ee ee | kL2.1MIuo: ti6¡i:1rg hi Gt GỮTHccesesseessssrsosssostrsaskoiiegakiilrtaginggiugitirgobrigiroggsigpgetrgpggirurDrrtdrcirtybsigbddcSul 2 1. Nội dung TS HILEN CUM .nsincnnencxenansnssiosenennnite cunanrdtise nnisen stienditennnasannnitesiniinnsinntilense stnaonnnd tion 2 Chương 2. TONG QUAN TÀI LIEU.

Tổng quan về cây Thanh tùng vay (Huperzia starros4).---22-52-552©552-- 3 Sài Bị TW]PHA 19721877. ca ca ca ca cac acc 3 2. Đặc điểm hình thái học của cây Thạch tùng vảy. Đặc điểm sinh thái, sinh học của Thạch TUNG VAY 111717.

Thành phần hóa học của cây Thạch tùng Vay. Huperzin A, hoạt chất chính trong cây Thạch tùng vảy. Nguồn Huperzin A trong cây họ thạch tUmg. Vai trò Huperzin A trong y hỌC.-- --- 5222 2222221223125 1121 12112512511 221 1111151 1e ke § DD Del: SR AA SIH C8 cú cx sce sre.

Đặc tinh chữa bệnh Alzheimer của HupA. Nhẫn giống về thi băng sim THƠ sáascscsasnssscskvociibosrolSgikik2Eg. Cơ sở khoa học của sự hình thành rễ bat định.-- 2-52 sSz+Sz2x+£zzEzzxzzxzez 10 2. Ý nghĩa của nhân giống bằng hom.--- 2-2 22©2++2++EE+EE+2EE+rxrrxrzrrerer 11 2.

Nhân giống vô tinh bằng nuôi cay mô tế bào thực Vat in vi/ro. Cơ sở khoa học của phương pháp nhân giống vô tinh bằng nuôi cay mô tế bào thực: VAG Lit VIỆT bupttcinsDtii TU SSS0IGIN G4855 G32NB43103R80DQQNSGONSI30BE.IfNSE@NDX4NESISSBT4NRDISSGS8000)00988 12 2. Tính toàn năng của tế bảo. Tính phân hoá và phản phân hoá của tế bào.--2- 2¿©2252222z22zz2zz2zzszz2 12 2.

Lợi ích của nhân giống bang nuôi cấy mô tế bao thực vật in vifro. Tình hình nghiên cứu nhân giống họ Thạch tùng (Lycopodiaceae) trên thé giới va O NACE Natty saysrssgg 2E toi tt 0iEGiGtosgBtDtl8GfE-BiA0SES:BlittBttisitsipISDIGESIEDNGGIGREUiNtEERnliltuiaqon 13 2. Tình hình nghiên cứu nhân giống họ thạch tùng trên thế giới. Tình hình nghiên cứu nhân giống bằng nuôi cấy mô.

Tình hình nghiên cứu nhân giống bằng giâm hom. Tình hình nghiên cứu nhân giống họ thạch tùng ở Việt Nam.VẬT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.--- 2525522 17 Sale | Hơi iãïi AEN CH CUO sess sensasesnenasasscosnenuexeseesscawunnasennaemaeneenwescaumnecemmmnncwncstsenvounes 17 3. Vat li@u nghién CUU 0. Thiết bị và dụng cu thí nghiệm.

ID Trường nghi BỀN ceosseceesesetosernddsrucohdiptudtiocEgkoiigEoitucobigtxg/09/in:380. Điều kiện nuôi cấy. Phuong phap nghién CU. Khao sat anh hưởng chat điều hòa sinh trưởng và vị trí lay hom đến khả năng tái sinh thành cây con của cây Thạch tùng Vảyy.- --- cee - + t2, 18 RR gs ch, eee 18 3.

Chuẩn bị giá thé và vườn ươm. Bố trí thí nghiệm. Chỉ tiều theo dO) sĩ seaaseesooabddisis53 08 0843139EI864310L11G383845134835:813891433580338383583E10 20 3. Phương pháp nhân giống vô tinh bằng hình thức nuôi cấy mô.

Khảo sát ảnh hưởng của javel ở tỷ lệ và thời gian khác nhau lên khả năng khử (RUS cây TH<CH THE VẬN: sx ceensssassnscnnncsensnaae SESEAS6gSES648k33529559554090400835802GL5834800004888/83g/U8E 20 3. Khảo sát ảnh hưởng môi trường khoáng đến sự sinh trưởng và phát triển của chỗi Thạch tùng VẬY scississscenssssaxssanssuscnssessvcscessensesvs yessnacenasvoveavaxennssvevavssthesiasssvevesteansdans 21 3. Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng và axit amin đến sự hình thành mô sẹo của cây Thạch tùng Vảy.-- -- - 131211 T HH TH nhàng 21 3. Phương pháp xử lý số liệu.-----2- 2¿©22222222E+22EE22EE22EE22E1222122212221222E222.crrree 22 VI Chương 4.KÉT QUA VÀ THẢO LUẬN.

Nhân giống vô tính bằng giâm hom thân. Nhân giống vô tính bằng nuôi cấy mô. Ảnh hưởng của javel ở các tỷ lệ và thời gian khác nhau lên khả năng khử trùng cây: Thach tine vay cescce-nnwencemnceneeeciarenn aera 2] 4. Anh hưởng môi trường khoáng đến sự sinh trưởng va phát triển của chồi Thạch UTD8 VŨ TY ong nh te tghiEDnEHEEBI8GE01009005083835808NG1/.

Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng và axit amin đến sự hình thành mô sẹo Của cay THạch tù Vay cieeceniinodooEG04443116138140483583553SESE5SISSS3SES913555S000133853838833304838 31 Chương 5. KẾT LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ. c<csc2seuni-nii4 12100 3201104621u01006061301 800 33 5. 33 TÀI LIEU THAM KHẢO.-- 2-©2222<+2E22EE2EE22EE2EE2EE22212251221271222127122212212222 2e 34 PHỤ LỤC Vil DANH SÁCH CÁC CHU VIET TAT Ach Acetylcholine AchE Acetylcholinesterase AD Alzheimer ctv Céng tac vién IBA Indole-3-Butyric acid NAA 1-Naphthaleneacetic acid NFT Nutrient Film Technique MS Murashige and Skoog, 1962 HupA Huperzin A NMR Nuclear Magnetic Resonance Vill DANH SÁCH CÁC BANG Trang Bảng 3.

Nghiệm thức thí nghiệm được bố trí với mẫu hom và nồng độ chất điều hòa sinh trudng (IBA, NAA) khac nlnau. Ty lễ javel Võ ,KHởI B18ñi MU HUD seccccessescsnecaropsnssmvnesenonenenesaeesonrtumerenremmnsuses 20 Bang 3. Thanh phan môi trường sử dụng ở các nghiệm thức tao mô sẹo. Anh hưởng chat điều hòa sinh trưởng đến tỷ lệ sống và chết của mau hom VI ay: THACH TÙNG Vay seers semen aw eect area ese 23 Bang 4.

Ảnh hưởng chat điều hòa sinh trưởng đến tỷ lệ sống và chết của mau hom V2 Gây TH<CH (iS Vay na seesdaseakessoeSUDECSGEAEEXESSGSESSSSR.SS3SSNS'0ESS. Ảnh hưởng vị trí lấy hom và chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng ra rễ của aye THẠGH i Vay c:osbcsx bötgigi43t0160056L78G 88686 28386) seem sneer sre raisin inate eee eer aeeer en 2] Bang 4. Anh hưởng của thời gian và ty lệ chat khử trùng đến mẫu Thạch tùng vảy sau 10 ngay nuOi CAY 0-4 ăễ. Ảnh hưởng môi trường khoáng đến sự sinh trưởng và phát triển của chỗồi I 1U s01.

Kết quả khảo sát tạo mô sẹo sau 2 tháng nuôi cấy.------2-22+5z+s22 31 1X DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình 2. Cau trúc phân tử của huperZin A.-- 2-22 2222+22++2E+2E+2EE2Ez22Ezzxzzrreex 7 Hình 3. Cây Thạch tùng vay trồng thuần tại nhà lưới. Hom Thạch tùng vảy trước va sau 2 tháng giâm tai nhà lưới.

Mẫu chồi Thạch tùng vay sau khi khử trùng 10 ngày. Chồi Thạch tùng vay sau 60 ngày cấy lên môi trường khảo sát. Hình thái mô sẹo quan sát dưới kính hién vi soi nổi sau 2 tháng nuôi cấy. Dat vấn đề Trước những tác động lớn của biến đổi khí hậu, diện tích đất rừng ngày càng thu hẹp và sự khai thác quá mức của con người đã làm ảnh hưởng rất lớn đến sự đa dạng nguồn gen và môi trường sống của các loài sinh vật nói chung và thực vật nói riêng, van đề nghiên cứu bảo tồn và phát triển nguồn gen các loài cây trồng, trong đó có các loại cây dược liệu đang là van đề được khoa học và xã hội quan tâm.

Thạch tùng vảy hay còn có tên gọi khác là Thạch tùng thân gập hay là cây Râu rồng (Huperzia squarrosa (G.) Trevis) là loại cây dược liệu quý. Thạch tùng vay được biết đến như một loài cây cảnh và dược liệu (Yumkham và Singh, 2013). squarrosa thu được trong mùa đông, sây khô và tán thành bột và được sử dụng như một chất bé sung phục hồi dé cải thiện trí nhớ cũng như điều trị rối loạn giấc ngủ và chứng động kinh (Yumkham và Singh, 2013). Mặc dù Thạch tùng vảy không nằm trong danh sách "đỏ" trong Chương trình Nghiên cứu bảo tồn và phát triển nguồn gen quý hiếm nhưng hiện nay đang bị khai thác quá mức gây suy giảm nghiêm trọng số lượng cá thé tồn tại trong tự nhiên.

Hoạt chất chính trong cây Thạch tùng vảy là huperzin A (HupA) có tác dụng trong việc chữa trị các bệnh về trí nhớ, đặc biệt là bệnh Alzheimer ở người già (Ferreira và ctv, 2016). Với kết quả nghiên cứu và phát hiện về tác dụng tuyệt vời của HupA dựa trên kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học phương tây đã cho thấy triển vọng phát triển các loại thuốc chữa bệnh Alzheimer từ loài cây này (Goodger va ctv, 2008). Những nghiên cứu về thành phan hóa học về Lycopodium alcaloid của loài Thạch tùng vảy nhằm mục đích tìm ra chất mới có tác dụng thay thế huperzin A và thay thế cho loài Thạch tùng răng đang ngày càng trở nên cạn kiệt. Cao chiết methanol của Thạch tùng vảy có tác dụng sinh học tương đương với Thạch tùng răng, dược liệu đã được nghiên cứu sâu về hóa học cũng như tác dụng kháng AchE (Nguyễn Ngọc Chương, 2020).

Công trình của các nhà khoa học Nhật Bản đã phân lập được một số alcaloid khác thuộc nhóm faweettimin từ cây Thạch tùng vảy khi tiến hành nghiên cứu 3 loài đại điện trong họ Thạch tùng. Các alcaloid này đã được xác đỉnh cấu trúc bao gồm: Lycopo- squarrosamin-A, Acetylaposerratinin, 8œ-hydroxyfawcettimin, 8B-hydroxyfawcettimin, 8B-acetoxyfawcettimin, acetyllycoposerramin-U, lycoflexin N-oxide (Katakawa va ctv, 2011). Ở nước ta, Thạch tùng vay đã được tìm thấy trên các vùng cao tại một số khu vực như Lào Cai, Lâm Đồng, Tam Đảo (Vĩnh Phúc), Nghệ An, Tây Nguyên, Quảng Trị. Tuy nhiên, Thạch tùng vảy có đặc tính sinh trưởng chậm, khả năng sinh sản kém, với mức khai thác nguồn cây trong tự nhiên quá lớn đã làm mat dần nguồn gen quý này ở nước ta, dẫn đến loài Thạch tùng vảy không đáp ứng được nhu cầu về nguồn nguyên liệu cho sản xuất dược phẩm.

Do vậy, việc tìm ra biện pháp nhân giống loài Thạch tùng vảy này là rất cần thiết. Hơn nữa, Việt Nam cũng chưa có công trình nghiên cứu nào thành công về nhân giống loài Thạch tùng vảy. Xuất phát từ thực tế trên, đề tài “Nghiên cứu nhân giống loài Thạch tùng vay (Huperzia squarrosa (Forst.) Trevis)” được thực hiện nhằm góp phan bảo tồn, phát triển nguồn gen loài cây dược liệu này. Mục tiêu nghiên cứu Xác định được các điều kiện thích hợp cho việc nhân giống (bằng hình thức giâm hom và nuôi cây mô tế bao thực vật in vitro) loài Thạch tùng vay góp phan bảo tồn và phát triển nguồn gen ở Việt Nam.

Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng và vị trí lay hom đến khả năng tái sinh thành cây con của cây Thạch tùng vảy. Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng của Javel ở nồng độ và thời gian khác nhau lên khả năng khử trùng cây Thạch tùng vảy. Nội dung 3: Khảo sát ảnh hưởng môi trường khoáng đến sự sinh trưởng và phát triển của cây thạch tùng vay in vitro. Nội dung 4: Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng và axit amin đến sự hình thành mô sẹo của cây Thạch tùng vảy.

TÔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Tổng quan về cây Thanh tùng vảy (Huperzia squarrosa) 2. Phân loại Thạch tùng vay hay còn được gọi là cây Rau rồng có tên khoa học là Huperzia squarrosa (Forst. Tên đồng danh là Lycopodium squarrosum Forst.

Giới (regnum) : Plantae Ngành (divisio) : Lycopodiophyta Lớp (class) : Lycopodiopsida Bộ (ordo) : Lycopodiales Ho (familia) : Lycopodiaceae Chi (genus) : Huperzia Loai (species) : Huperzia squarrosa Thực tế hiện nay, họ Lycopodiaceae còn có nhiều hệ thống phân loại khác được đề xuất bởi các nhà khoa học trên thé giới. Phố biến nhất là hệ thống phân loại của Ollgaard (năm 1989) phân chia bộ Thông đất chỉ có 1 họ Thạch tùng và trong đó có 4 chi bao gồm chi Lycopodium L., chi Lycopodiella Holub, chỉ Huperzia Bernh. và chi Phyloglossum Kunze. Đối với hệ thống phân loại của Holub (1985) thì phân chia bộ Thông đất thành 2 họ là Huperziaceae và Lycopodiaceae, trong đó có 11 chỉ (Holub, 1985; Zang và Xianxu, 1999).

Tác giả Ching cũng đề xuất phân chia bộ Thông đất thành 2 họ là Huperziaceae có 2 chi (Huperzia và Phlegmariurus) và họ Lycopodiaceae có 5 chi (Lycopodium, Diphasiastrum, Palhinhaea, Lycopodiella và Lycopodiostrum) (Holub, 1985; Øllgaard, 1989; Ma va Gang, 2004). Cụ thé như cây Thạch tùng vảy có tên khoa học là Huperzia squarrosa (Forst. và tên đồng danh của nó là Lycopodium squarrosum Forst.