mở đầu cũng nghiệp vi nhân giống thực vật. 8 Năm 1960, Cocking lần đầu tiên sử dụng enzym phân giải thành tế bào và đã tạo ra số lượng lớn tế bào trần. Kỹ thuật này sau đó đã được hoàn thiện để tách nuôi tế bào trần ở nhiều cây trồng khác nhau. đã tái sinh được cây từ tế bào trần mô thịt lá (mesophyll cell) ở thuốc lá.
Năm 1972, Carlson và cộng sự lần đầu tiên thực hiện lại tế bào sôma giữa các loài, tạo được cây từ dung hợp tế bào trần của 2 loại thuốc lá Nicotiana glauca và N. tạo được cây lai soma “cà chua thuốc lá” bằng lai xa tế bào trần của 2 cây này. Đến nay, việc tái sinh cây hoàn chỉnh từ tế bào trần hoặc từ lai tế bào trần đã thành công ở nhiều loài thực vật. Năm 1964, Guha và Maheshwari lần đầu tiên thành công trong tạo được cây đơn bội từ nuôi cấy bao phấn của cây cà Datura.
Kỹ thuật này sau đó đã được nhiều tác giả phát triển và ứng dụng rộng rãi trong tạo dòng đơn bội (1x), dòng thuần nhị bội kép (2x), cố định ưu thế lai (nuôi cấy bao phấn hoặc hạt phấn của dòng lai F1 để tạo giống thuần mang tính trạng ưu thế lai). Năm 1985 Flores và Filner lần đầu tiên sản xuất chất trao đổi thứ cấp từ nhân nuôi rễ tơ ở Hyoscyamus mutics. Những rễ này sản xuất nhiều hoạt chất hyoscyamine hơn cây tự nhiên. Hiện nay, công nghệ nuôi cấy tế bào và mô (ví dụ mô rễ của nhân sâm) trong các bioreactor dung tích lớn đã được thương mại hoá ở mức công nghiệp để sản xuất sinh dược.Cơ sở khoa học của nhân giống in vitro Theo Đặng Ngọc Hùng (2009), nguyên lý cơ bản của nhân giống nuôi cấy mô tế bào là tính toàn năng của tế bào thực vật.
Mỗi tế bào bất kỳ của cơ thể thực vật đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đầy đủ của thực vật đó còn gọi là bộ gen. Đặc tính của thực vật được thể hiện ra kiểu hình cụ thể trong từng thời kỳ của quá trình phát triển phụ thuộc vào sự giải mã các thông tin di truyền tương ứng trong hệ gen của tế bào. Do đó, khi gặp điều kiện thích hợp, trong mối tương tác qua lại với điều kiện môi trường, cơ quan, mô hoặc tế 9 bào đều có thể phát triển thành một cá thể mới hoàn chỉnh mang những đặc tính di truyền giống như cây mẹ. Sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào: Sự phân hóa: là tiến trình quy định biến đổi tế bào phôi sinh thành tế bào chuyên hóa.
Sự phản phân hóa tế bào: là quá trình chuyển tế bào chuyên hóa về một chức năng nào đó về trạng thái phôi sinh ban đầu và phân chia mạnh mẽ. Giai đoạn nhân giống invitro Theo Nguyễn Thị Lý Anh & Nguyễn Quang Thạch (2005) sự thành công của việc nhân giống in vitro chỉ đạt được khi trải qua các giai đoạn: Giai đoạn 1: Khử trùng mô nuôi cấy Đây là giai đoạn tối quan trọng quyết định toàn bộ quá trình nhân giống in vitro. Mục đích của giai đoạn này là phải tạo ra được nguyên liệu vô trùng để đưa vào nuôi cấy in vitro. Vô trùng mô cấy là một thao tác khó, ít khi thành công ngay lần đầu tiên.
Tuy vậy, nếu kiên trì tìm được nồng độ và thời gian vô trùng thích hợp thì sau vài lần thử chắc chắn sẽ đạt kết quả. Giai đoạn 2: Tái sinh mẫu nuôi cấy Mục đích của các giai đoạn này là sự tái sinh một cách định hướng các mô nuôi cấy. Quá trình này được điều khiển chủ yếu dựa vào tỷ lệ của các hợp chất auxin, cytokynin ngoại sinh đưa vào môi trường nuôi cấy. Tuy nhiên, bên cạnh điều kiện đó cũng cần quan tâm tới tuổi sinh lý của mẫu cấy.
Thường mô non, chưa phân hoá có khả năng tái sinh cao hơn các mô trưởng thành. Người ta còn nhận thấy rằng mẫu nuôi cấy trong thời gian sinh trưởng nhanh của cây cho kết quả rất khả quan trong tái sinh chồi. Giai đoạn 3: Nhân nhanh Giai đoạn này được coi là giai đoạn then chốt của quá trình. Để tăng hệ số nhân, ta thường đưa thêm vào môi trường dinh dưỡng nhân tạo các chất điều hoà sinh trưởng (auxin, cytokynin, gibberellin,…), các chất bổ sung khác như nước 10 dừa, dịch chiết nấm men,… kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng thích hợp.
Tuỳ thuộc vào từng đối tượng nuôi cấy, người ta có thể nhân nhanh bằng kích thích sự hình thành qua các cụm chồi (nhân cụm chồi) hay kích thích sự phát triển của các chồi nách (vi giâm cành) hoặc thông qua việc tạo cây từ phôi vô tính. Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh Khi đạt được kích thước nhất định, các chồi được chuyển từ môi trường ở giai đoạn 3 sang môi trường tạo rễ. Thường 2 - 3 tuần, từ những chồi riêng lẻ này sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây hoàn chỉnh. Ở giai đoạn này người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy các auxin là nhóm hormon thực vật quan trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy.
Giai đoạn 5: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên Giai đoạn đưa cây hoàn chỉnh từ ống nghiệm ra ngoài điều kiện tự nhiên là bước cuối cùng của quá trình nhân giống in vitro và là bước quyết định khả năng ứng dụng quá trình này trong thực tiễn sản xuất. Để đưa cây từ ống nghiệm ra ngoài vườn ươm với tỷ lệ sống cao, cây sinh trưởng tốt cần đảm bảo một số yêu cầu: + Cây trong ống nghiệm đã đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất định (số lá, số rễ, chiều cao cây…) + Cần có thời gian huấn luyện cây con (từ 1-2 tuần tùy từng loại cây) để thích nghi với những thay đổi về nhiệt độ, độ ẩm, sâu bệnh, bằng cách đặt bình cây ngoài điều kiện tự nhiên, mở nắp bình nuôi… + Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, thoát nước. Phải chủ động điều chỉnh được độ ẩm, sự chiếu sáng của vườn ươm cũng như chế độ dinh dưỡng thích hợp. Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro 2.
Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy. Một trong những yếu tố quan trọng nhất trong sự tăng trưởng và phát sinh hình thái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy mô là thành phần môi trường nuôi cấy. Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào và mô thực vật thay đổi tùy theo loài và bộ phận nuôi cấy. Đối với cùng một mẫu cấy nhưng tùy theo mục đích thí nghiệm thì thành phần môi trường cũng sẽ thay đổi.
Môi trường thay đổi tùy theo giai đoạn phân hóa của mẫu cấy. Tuy vậy, tất cả các môi trường nuôi cấy đều bao gồm năm thành phần: Khoáng đa lượng, khoáng vi lượng, vitamin, đường, các chất điều hòa sinh trưởng thực vật (Nguyễn Đức Lượng & Lê Thị Thủy Tiên, 2006). Khoáng đa lượng: Nhu cầu khoáng của mô, tế bào thực vật tách rời không khác nhiều so với cây trồng trong điều kiện tự nhiên. Các nguyên tố đa lượng cần phải cung cấp là nitrogen, phosphorus, potassium, calcium, magnesium, sắt.
Khoáng vi lượng: là các nguyên tố được sử dụng với nồng độ dưới 30 ppm, gồm có: Fe, Cu, Mn, Zn, Mo, Bo… Tuy chỉ cần một lượng nhỏ trong môi trường nuôi cấy nhưng chúng là thành phần không thể thiếu cho sự sinh trưởng và phát triển của mô. Hàm lượng các nguyên tố đa lượng và các nguyên tố vi lượng phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy và các đối tượng nuôi cấy. Carbon và nguồn năng lượng: Trong nuôi cấy in vitro, nguồn carbon giúp mô, tế bào thực vật tổng hợp nên các chất hữu cơ giúp tế bào phân chia, tăng sinh khối không phải là do quá trình quang hợp cung cấp mà chính là nguồn carbon bổ sung vào môi trường dưới dạng đường. Hai dạng đường thường gặp nhất trong nuôi cấy in vitro là glucose và sucrose, nhưng hiện nay sucrose được sử dụng phổ biến hơn.
Tùy theo mục đích nuôi cấy, nồng độ sucrose thay đổi từ 1 – 6% (w/v), thông thường nhất là 2% w/v, tương ứng với 58,4mM (Nguyễn Đức Lượng & Lê Thị Thủy Tiên, 2006). 12 Vitamin: thông thường thực vật tổng hợp các vitamin cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển của chúng. Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau. Khi tế bào và mô được nuôi cấy in vitro thì một vài vitamin trở thành yếu tố giới hạn sự phát triển của chúng.
Các vitamin thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: thiamin, acid nicotinic, pyridoxine và myo inositol. Thiamin là một vitamin căn bản cần thiết cho sự tăng trưởng của tất cả các tế bào. Các hợp chất hữu cơ bổ sung không xác định: Bổ sung nhiều chất hữu cơ khác nhau vào trong môi trường nuôi cấy thường mang lại kết quả thuận lợi cho sự tăng trưởng của mô. Các chất bổ sung này là: protein hydrolysate, nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết lúa mạch, chuối, nước cam, nước cà chua.
Tuy nhiên các chất hữu cơ không xác định này chỉ nên được sử dụng như là giải pháp cuối cùng và chỉ có nước dừa và protein hydrolysate hiện nay được sử dụng rộng rãi. Amino acid và các nguồn cung cấp nitrogen khác: mặc dù tế bào có khả năng tổng hợp tất cả các amino acid cần thiết nhưng sự bổ sung các amino acid vào môi trường nuôi cấy là để kích thích sự tăng trưởng của tế bào. Việc sử dụng amino acid đặc biệt quan trọng trong môi trường nuôi cấy tế bào và nuôi cấy tế bào trần. Amino acid cung cấp cho tế bào thực vật nguồn amino acid sẵn sàng cho nhu cầu của tế bào và nguồn nitrogen này được tế bào hấp thu nhanh hơn nitrogen vô cơ (Nguyễn Đức Lượng & Lê Thị Thủy Tiên, 2006).
Agar (thạch):là thành phần quyết định trạng thái vật lý của môi trường nuôi cấy. Độ cứng của agar phụ thuộc vào nồng độ agar sử dụng và pH môi trường nuôi cấy. Nồng độ agar thường sử dụng là 5-10 %, nồng độ này cho phép ổn định trong môi trường nuôi cấy PH của môi trường: pH của môi trường là yếu tố rất quan trọng. Sự ổn định pH của môi trường là yếu tố duy trì trao đổi chất trong tế bào.
Giá trị của 13 pH trong môi trường thích hợp cho sinh trưởng và phát triển của nhiều loài thức vật biến đổi từ 5,5-6,0. Theo Nguyễn Như Khanh (1990) và Bùi Bá Bổng (1995), khi pH thấp (môi trường axit) sẽ hoạt hóa các enzyme hydrolaza dẫn đến kìm hãm sự sinh trưởng, đồng thời kích thích sự lão hóa tế bào trong mô cấy.