Nghiên Cứu Nhân Giống Cúc Đại Đóa In Vitro Tại Gia Lâm, Hà Nội

Đánh giá khả năng sinh trưởng và phát triển của các chủng nấm đông trùng hạ thảo cordyceps militaris, cung cấp thông tin hữu ích cho nghiên cứu và ứng dụng.

• Tác giả: Dương Thị Quỳnh
• Người hướng dẫn: TS. Phùng Thị Thu Hà
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Thực vật
• Đề tài: Nghiên Cứu Nhân Giống Cúc Đại Đóa In Vitro Tại Gia Lâm, Hà Nội
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. PHẦN 1: MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU
• 1.1. Mục đích
• 1.2. Yêu cầu
• 2. PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Giới thiệu chung về cây hoa Cúc
• 2.2. Vị trí phân loại, nguồn gốc và phân bố
• 2.2.1. Vị trí phân loại
• 2.2.2. Nguồn gốc, phân bố
• 2.3. Đặc điểm thực vật học
• 2.4. Yêu cầu ngoại cảnh của cây hoa Cúc
• 2.4.1. Ánh sáng
• 2.4.2. Nhiệt độ
• 2.4.3. Độ ẩm
• 2.4.4. Đất
• 2.4.5. Dinh dưỡng
• 2.5. Giá trị của cây hoa Cúc
• 2.5.1. Giá trị cảnh quan
• 2.5.2. Giá trị kinh tế
• 2.6. Giới thiệu về nhân giống invitro ở thực vật
• 2.6.1. Nhân giống in vitro
• 2.6.2. Sơ lược về lịch sử phát triển nuôi cấy mô
• 3. PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu
• 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
• 3.1.2. Vật liệu nghiên cứu
• 3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 3.2.1. Địa điểm nghiên cứu
• 3.2.2. Thời gian nghiên cứu
• 3.3. Nội dung nghiên cứu
• 3.3.1. Xác định môi trường thích hợp cho giai đoạn nhân chồi
• 3.3.2. Xác định môi trường thích hợp cho giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh
• 3.3.3. Đánh giá khả năng thích nghi ở vườn ươm
• 3.4. Phương pháp nghiên cứu và bố trí thí nghiệm
• 3.4.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm
• 3.4.2. Điều kiện nuôi cấy
• 3.4.3. Các chỉ tiêu theo dõi
• 3.4.4. Phương pháp xử lý số liệu
• 4. PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Kết quả xác định môi trường thích hợp cho giai đoạn nhân chồi
• 4.1.1. Ảnh hưởng của BAP tới khả năng nhân chồi Cúc đại đóa
• 4.1.2. Ảnh hưởng của BAP kết hợp NAA tới khả năng nhân chồi Cúc đại đóa
• 4.1.3. Ảnh hưởng của BAP kết hợp với nước dừa tới khả năng nhân chồi Cúc đại đóa
• 4.2. Kết quả xác định môi trường thích hợp cho giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh của một số giống Cúc đại đóa
• 4.2.1. Ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ của 1 số giống Cúc đại đóa
• 4.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng than hoạt tính tới khả năng ra rễ Cúc đại đóa
• 4.2.3. Đánh giá khả năng sinh trưởng của cúc đại đóa tím, đỏ sau khi đưa ra ngoài vườn ươm
• 5. PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC 1: MỘT SỐ HÌNH ẢNH TRONG QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU
• PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ XỬ LÍ SỐ LIỆU

Tóm tắt

I. Nghiên Cứu Nhân Giống Cúc Đại Đóa In Vitro Tổng Quan Dự Án

Nghiên cứu nhân giống cúc đại đóa in vitro tại Gia Lâm, Hà Nội, mở ra hướng đi mới cho ngành trồng hoa. Kỹ thuật in vitro cúc đại đóa hứa hẹn tạo ra giống cây chất lượng cao, sạch bệnh, đáp ứng nhu cầu thị trường ngày càng tăng. Đề tài tập trung vào việc xây dựng quy trình nhân giống hiệu quả, từ giai đoạn nhân giống invitro tại nhà đến khi cây thích nghi với điều kiện vườn ươm. Công nghệ nhân giống cúc bằng phương pháp nuôi cấy mô là giải pháp tiên tiến, khắc phục hạn chế của phương pháp giâm cành truyền thống. Bài viết này sẽ đi sâu vào các khía cạnh của nghiên cứu, từ tổng quan tài liệu đến kết quả thực nghiệm, mang đến cái nhìn toàn diện về tiềm năng của phương pháp in vitro cúc đại đóa.

1.1. Mục tiêu và Phạm vi nghiên cứu về cúc đại đóa Hà Nội

Nghiên cứu đặt mục tiêu xây dựng quy trình nhân giống hoàn chỉnh cho cúc đại đóa, bao gồm giai đoạn nhân nhanh chồi và tạo cây hoàn chỉnh trong điều kiện phòng thí nghiệm nhân giống invitro, cũng như giai đoạn huấn luyện cây ngoài vườn ươm. Phạm vi nghiên cứu tập trung vào hai giống cúc đại đóa phổ biến là giống tím và giống đỏ. Đánh giá khả năng sinh trưởng của cây cúc đại đóa in vitro tại vườn ươm là một phần quan trọng, đảm bảo cây có thể thích nghi tốt với môi trường thực tế. Dự kiến kết quả nghiên cứu sẽ đóng góp vào việc nâng cao chất lượng và sản lượng hoa cúc đại đóa tại khu vực Gia Lâm, Hà Nội.

1.2. Tầm quan trọng của nhân giống cúc tại Gia Lâm

Việc nghiên cứu nhân giống cúc tại Gia Lâm mang ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển kinh tế địa phương. Khu vực Gia Lâm có tiềm năng lớn để phát triển ngành trồng hoa, đặc biệt là cúc đại đóa. Tuy nhiên, phương pháp nhân giống truyền thống còn nhiều hạn chế. Kỹ thuật nhân giống invitro sẽ giúp tạo ra số lượng lớn cây giống đồng đều, chất lượng cao, đáp ứng nhu cầu của thị trường. Ngoài ra, việc áp dụng công nghệ cao vào sản xuất nông nghiệp cũng góp phần nâng cao giá trị gia tăng cho sản phẩm hoa cúc đại đóa. Nghiên cứu này là bước đi quan trọng để đưa công nghệ nhân giống invitro cúc đến với người nông dân.

II. Vấn Đề và Thách Thức trong Nhân Giống In Vitro Cúc Đại Đóa

Mặc dù nhân giống in vitro mang lại nhiều ưu điểm, nhưng cũng đối mặt với không ít thách thức. Tình trạng thoái hóa giống do nhân giống vô tính kéo dài là một vấn đề nan giải. Các giống cúc đại đóa cũ và mới nhập khẩu thường bị giảm chất lượng do sâu bệnh và thiếu quy trình phục tráng định kỳ. Phương pháp giâm cành truyền thống có hệ số nhân giống thấp, dễ bị ảnh hưởng bởi điều kiện khí hậu, đặc biệt vào mùa hè nóng ẩm. Do đó, việc nghiên cứu và hoàn thiện quy trình nuôi cấy mô cúc đại đóa là vô cùng cần thiết để giải quyết các vấn đề này.

2.1. Thoái hóa giống và ảnh hưởng đến chất lượng cúc đại đóa

Thoái hóa giống là vấn đề nghiêm trọng ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng của cúc đại đóa. Nhân giống vô tính qua nhiều thế hệ dẫn đến tích lũy các đột biến gen, làm giảm khả năng sinh trưởng, kháng bệnh và chất lượng hoa. Theo tài liệu gốc, các giống cúc đại đóa hiện nay, cả giống cũ và giống mới nhập khẩu, đều đang trong tình trạng thoái hóa do nhân giống vô tính kéo dài mà không có quy trình phục tráng định kỳ. Điều này ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng đáp ứng nhu cầu của thị trường về số lượng và chất lượng hoa cúc.

2.2. Hạn chế của phương pháp giâm cành truyền thống cúc đại đóa

Phương pháp giâm cành truyền thống có nhiều hạn chế, đặc biệt trong điều kiện khí hậu nóng ẩm của Việt Nam. Hệ số nhân giống thấp, cây con dễ bị nhiễm bệnh từ cây mẹ và môi trường. Đặc biệt vào mùa hè, nhiệt độ và độ ẩm cao tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của nấm bệnh, gây khó khăn lớn cho việc nhân giống cúc trên đồng ruộng. Do đó, cần có giải pháp thay thế hiệu quả hơn để đảm bảo nguồn cung cây giống chất lượng cao và ổn định cho thị trường.

III. Phương Pháp Tối Ưu Môi Trường Nhân Chồi Cúc Đại Đóa In Vitro

Nghiên cứu tập trung vào việc xác định môi trường tối ưu cho giai đoạn nhân chồi cúc đại đóa. Các thí nghiệm được thực hiện để đánh giá ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng như BAP (6-Benzyl adenin purin) và NAA (1-naphthaleneacetic acid), cũng như các chất bổ sung tự nhiên như nước dừa. Theo tài liệu, giống Cúc đại đóa tím nhân nhanh chồi tốt nhất trong môi trường 1/2 MS + 0,5 mg/l BAP + 10% nước dừa. Với Cúc đại đóa đỏ môi trường phù hợp nhất là 1/2 MS + 0,3 mg/l BAP + 5% nước dừa.

3.1. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân giống vô tính cúc

BAP là chất điều hòa sinh trưởng quan trọng, có vai trò kích thích sự phân chia tế bào và hình thành chồi. Nghiên cứu đã chứng minh BAP có ảnh hưởng lớn đến khả năng nhân chồi cúc đại đóa. Tuy nhiên, nồng độ BAP tối ưu khác nhau tùy thuộc vào giống. Việc xác định nồng độ BAP phù hợp là yếu tố then chốt để đạt được hệ số nhân chồi cao và chất lượng chồi tốt. Quá trình này đóng vai trò quan trọng trong việc nhân giống invitro cúc.

3.2. Kết hợp BAP và NAA trong môi trường nuôi cấy in vitro cúc

Việc kết hợp BAP và NAA có thể tạo ra hiệu ứng hiệp đồng, thúc đẩy quá trình nhân chồi cúc hiệu quả hơn. NAA là auxin, có vai trò kích thích sự phát triển của rễ. Tuy nhiên, nồng độ NAA cần được điều chỉnh cẩn thận để tránh ức chế sự phát triển của chồi. Tỉ lệ BAP/NAA tối ưu sẽ khác nhau tùy thuộc vào giống và điều kiện nuôi cấy mô.

3.3. Vai trò của nước dừa trong nhân giống cúc invitro

Nước dừa là nguồn cung cấp các chất dinh dưỡng tự nhiên và các chất điều hòa sinh trưởng, có tác dụng thúc đẩy sự phát triển của chồi. Nghiên cứu cho thấy nước dừa có thể cải thiện đáng kể khả năng nhân chồi cúc đại đóa khi được sử dụng kết hợp với BAP. Nồng độ nước dừa tối ưu cần được xác định thông qua các thí nghiệm để đạt hiệu quả tốt nhất.

IV. Tối Ưu Môi Trường Tạo Cây Hoàn Chỉnh Cúc Đại Đóa In Vitro

Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh là bước quan trọng trong quy trình nhân giống in vitro. Mục tiêu là tạo ra cây con có đầy đủ rễ và thân lá, sẵn sàng để chuyển ra vườn ươm. Nghiên cứu tập trung vào việc xác định môi trường ra rễ tối ưu, bao gồm việc sử dụng NAA và than hoạt tính (AC). Các kết quả nghiên cứu cho thấy, sử dụng than hoạt tính cho giai đoạn ra rễ là thích hợp nhất.

4.1. Ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ cúc đại đóa

NAA là auxin phổ biến được sử dụng để kích thích ra rễ trong nuôi cấy mô. Nghiên cứu đã đánh giá ảnh hưởng của các nồng độ NAA khác nhau đến khả năng ra rễ của các giống cúc đại đóa. Kết quả cho thấy nồng độ NAA tối ưu khác nhau tùy thuộc vào giống. Việc xác định nồng độ NAA phù hợp là yếu tố quan trọng để đạt được tỷ lệ ra rễ cao và chất lượng rễ tốt.

4.2. Vai trò của than hoạt tính trong môi trường ra rễ in vitro cúc đại đóa

Than hoạt tính có khả năng hấp phụ các chất ức chế sinh trưởng trong môi trường nuôi cấy mô, giúp cải thiện khả năng ra rễ. Nghiên cứu đã đánh giá ảnh hưởng của các nồng độ than hoạt tính khác nhau đến khả năng ra rễ của các giống cúc đại đóa. Kết quả cho thấy than hoạt tính có thể cải thiện đáng kể khả năng ra rễ, đặc biệt là đối với các giống khó ra rễ.

V. Đánh Giá Khả Năng Thích Nghi Vườn Ươm Cây Cúc Đại Đóa In Vitro

Giai đoạn thích nghi vườn ươm là bước cuối cùng trong quy trình nhân giống in vitro, đảm bảo cây con có thể sinh trưởng và phát triển tốt trong điều kiện tự nhiên. Nghiên cứu đánh giá khả năng sinh trưởng của cây cúc đại đóa sau khi chuyển ra vườn ươm. Theo tài liệu, cây Cúc đại đóa tím in vitro từ môi trường ra rễ 1/2 MS + 0,3 mg/l NAA sinh trưởng tốt nhất với tỉ lệ cây sống sau 4 tuần đạt 90%.

5.1. Tỷ lệ sống và sinh trưởng ban đầu của cây cúc đại đóa tại vườn ươm

Tỷ lệ sống và sinh trưởng ban đầu là các chỉ tiêu quan trọng đánh giá khả năng thích nghi của cây cúc đại đóa với điều kiện vườn ươm. Các yếu tố ảnh hưởng đến tỷ lệ sống bao gồm độ ẩm, ánh sáng, nhiệt độ và dinh dưỡng. Việc điều chỉnh các yếu tố này phù hợp sẽ giúp cây con vượt qua giai đoạn chuyển tiếp và phát triển khỏe mạnh.

5.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng thích nghi của cây cúc đại đóa

Nhiều yếu tố ảnh hưởng đến khả năng thích nghi của cây cúc đại đóa với điều kiện vườn ươm. Chất lượng cây giống in vitro, điều kiện môi trường vườn ươm và chế độ chăm sóc đều đóng vai trò quan trọng. Việc tối ưu hóa các yếu tố này sẽ giúp nâng cao tỷ lệ sống và sinh trưởng của cây con.

VI. Kết Luận và Hướng Phát Triển Nghiên Cứu Cúc Đại Đóa In Vitro

Nghiên cứu nhân giống in vitro cúc đại đóa đã đạt được những kết quả khả quan, mở ra tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong sản xuất nông nghiệp. Quy trình nhân giống được xây dựng có thể giúp tạo ra số lượng lớn cây giống chất lượng cao, đáp ứng nhu cầu thị trường. Tuy nhiên, cần tiếp tục nghiên cứu để hoàn thiện quy trình và tối ưu hóa chi phí sản xuất. Theo tác giả khóa luận, việc nghiên cứu và phát triển các giống cúc đại đóa mới có chất lượng cao là rất cần thiết.

6.1. Tóm tắt kết quả và ý nghĩa của nghiên cứu nhân giống cúc invitro

Nghiên cứu đã xác định được môi trường tối ưu cho giai đoạn nhân chồi và tạo cây hoàn chỉnh của cúc đại đóa. Các kết quả này có ý nghĩa quan trọng trong việc xây dựng quy trình nhân giống hiệu quả, góp phần nâng cao năng suất và chất lượng hoa cúc. Áp dụng quy trình nhân giống in vitro này có thể giúp phát triển cúc đại đóa Hà Nội.

6.2. Đề xuất hướng nghiên cứu tiếp theo về nhân giống invitro cúc

Cần tiếp tục nghiên cứu để tối ưu hóa quy trình nhân giống in vitro, giảm chi phí sản xuất và nâng cao khả năng thích nghi của cây con với điều kiện tự nhiên. Nghiên cứu sâu hơn về cơ chế di truyền của thoái hóa giống và phát triển các phương pháp phục tráng giống hiệu quả cũng là hướng đi quan trọng. Thêm vào đó, cần tập trung phát triển các giống cúc đại đóa mới có khả năng kháng bệnh tốt và chất lượng hoa vượt trội. Cuối cùng, cần nghiên cứu mở rộng về quy trình nhân giống invitro tại nhà để phục vụ nhu cầu sản xuất nhỏ lẻ.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Hoa cúc (Chrysanthemum sp., cụ thể là Chrysanthemum × morifolium, thuộc họ Cúc Asteraceae) là loài cây cảnh có giá trị thương mại lớn trên thị trường toàn cầu cũng như tại Việt Nam. Cây được trồng phổ biến dưới hai hình thức là hoa cắt cành và hoa trồng chậu. Trong các nhóm giống hoa cúc, cúc đại đóa chiếm vị trí ưu tiên lựa chọn của người sản xuất và tiêu dùng nhờ kích thước hoa lớn (đường kính hoa đạt từ 10–15 cm), màu sắc phong phú, độ bền hoa cao và khả năng phân cành tốt.

Tuy nhiên, thực trạng sản xuất hoa cúc đại đóa tại Việt Nam đang đối mặt với nhiều thách thức:

• Phương pháp nhân giống truyền thống chủ yếu là giâm cành có hệ số nhân thấp, cây giống dễ tích lũy mầm bệnh (đặc biệt là virus và vi khuẩn), đồng thời phụ thuộc chặt chẽ vào thời tiết (điều kiện nhiệt độ và ẩm độ cao trong mùa hè gây khó khăn lớn cho việc nhân giống ngoài đồng ruộng).
• Các giống cúc cũ và một số giống mới nhập nội đang trong tình trạng thoái hóa, giảm sút phẩm chất do nhân vô tính kéo dài qua nhiều thế hệ mà không được phục tráng định kỳ.

Ứng dụng công nghệ nhân giống in vitro (nuôi cấy mô tế bào thực vật) cho phép giải quyết triệt để các hạn chế trên, tạo ra số lượng lớn cây giống sạch bệnh, đồng nhất về mặt di truyền với hệ số nhân lý thuyết đạt từ $4 \times 10^4$ đến $6 \times 10^4$ cây giống/năm từ một nguồn mẫu cấy ban đầu. Khóa luận tốt nghiệp tập trung giải quyết yêu cầu kỹ thuật vi nhân giống cho hai giống cúc đại đóa cụ thể tại địa bàn Gia Lâm, Hà Nội.

Mục đích nghiên cứu

Xây dựng quy trình nhân giống cây Cúc đại đóa bằng phương pháp in vitro giai đoạn nhân nhanh chồi, tạo cây hoàn chỉnh trong phòng nuôi cấy mô và giai đoạn huấn luyện cây ngoài vườn ươm.

Yêu cầu nghiên cứu

1. Xác định được môi trường nhân nhanh thích hợp cho các giống Cúc đại đóa.
2. Xác định được môi trường ra rễ thích hợp cho các giống Cúc đại đóa.
3. Đánh giá được sự sinh trưởng của cây Cúc đại đóa in vitro ở vườn ươm.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

• Đối tượng nghiên cứu: Hai giống hoa Cúc đại đóa gồm giống Cúc đại đóa tím (ký hiệu T1) và giống Cúc đại đóa đỏ (ký hiệu Đ2), được cung cấp bởi Bộ môn Thực vật – Khoa Nông học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
• Phạm vi không gian: Phòng thí nghiệm Nuôi cấy mô tế bào – Bộ môn Thực vật – Khoa Nông học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam (Gia Lâm, Hà Nội) và khu vực vườn ươm thực nghiệm.
• Phạm vi thời gian: Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 01 năm 2022 đến tháng 07 năm 2022.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và mô hình sinh học

• Cơ sở sinh học tế bào: Nghiên cứu dựa trên nguyên lý về tính toàn năng của tế bào thực vật (totipotency) cùng quá trình phân hóa (differentiation) và phản phân hóa (dedifferentiation) tế bào dưới sự tương tác của môi trường dinh dưỡng và các chất điều hòa sinh trưởng.
• Học thuyết cân bằng phytohormone: Dựa trên khám phá của Skoog và Miller (1957) về tương quan tỷ lệ nồng độ Auxin/Cytokinin trong môi trường nuôi cấy để điều khiển sự phát sinh hình thái (tỷ lệ Auxin/Cytokinin thấp kích thích phát sinh chồi; tỷ lệ Auxin/Cytokinin cao kích thích phát sinh rễ).
• Các chất điều hòa sinh trưởng sử dụng:
  • Nhóm Cytokinin: 6-Benzylaminopurine (BAP) – chất kích thích phân bào, phá vỡ ưu thế ngọn và kích thích phát sinh chồi bên/chồi nách.
  • Nhóm Auxin: 1-Naphthaleneacetic acid (NAA) – chất kích thích kéo dài tế bào và kích thích cảm ứng tạo rễ bất định.
  • Hợp chất hữu cơ bổ sung: Nước dừa tự nhiên (chứa các phytohormone nội sinh, amino acid và vitamin kích thích sinh trưởng).
  • Than hoạt tính (Activated Charcoal - AC): Giúp hấp phụ các chất độc, ức chế ánh sáng ở phần gốc và tạo môi trường tối cục bộ kích thích rễ phát triển.
• Môi trường dinh dưỡng nền: Môi trường Murashige và Skoog (1962) giảm một nửa hàm lượng khoáng (1/2 MS), bổ sung 30 g/l đường sucrose và 6,5 g/l agar.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

• Vật liệu và mẫu cấy: Đoạn thân mang 1 mắt ngủ từ nguồn vật liệu in vitro vô trùng dùng cho giai đoạn nhân chồi; đoạn chồi in vitro đạt chiều dài 2 cm dùng cho giai đoạn tạo rễ; cây hoàn chỉnh đã ra rễ 10 ngày tuổi dùng cho giai đoạn vườn ươm.
• Bố trí thí nghiệm: Các thí nghiệm được thiết kế theo phương pháp hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD):
  • Thí nghiệm nhân chồi (TN1, TN2, TN3): Gồm 4 công thức, mỗi công thức cấy 5 bình (30 ml môi trường/bình, 6 mẫu cấy/bình), theo dõi ngẫu nhiên 3 bình/công thức (18 mẫu).
  • Thí nghiệm ra rễ (TN4, TN5): Gồm 4 công thức, mỗi công thức cấy 10 bình (30 ml môi trường/bình, 6 mẫu cấy/bình), theo dõi ngẫu nhiên 3 bình/công thức (18 mẫu).
  • Thí nghiệm vườn ươm (TN6): Trồng trên khay nhựa 104 lỗ với giá thể đất phù sa + peatmoss (tỷ lệ 1:1), bố trí 3 lần nhắc lại, mỗi lần 10 cây (theo dõi 15 cây/công thức).
• Điều kiện nuôi cấy tiêu chuẩn:
  • Cường độ chiếu sáng: 2000 lux (đèn neon), quang chu kỳ 10 giờ chiếu sáng / 14 giờ tối.
  • Nhiệt độ phòng nuôi: 25–26°C; độ ẩm không khí: 70–75%.
  • Môi trường được khử trùng bằng nồi hấp ở 121°C, áp suất 1,1 atm trong thời gian 20 phút, độ pH điều chỉnh ở mức 5,8.
• Chỉ tiêu theo dõi và xử lý số liệu:
  • Theo dõi hệ số nhân chồi (chồi/mẫu), tăng trưởng khối lượng cụm chồi (g/bình), chiều cao chồi (cm) sau 6 tuần; số rễ/chồi, chiều dài rễ (cm), tăng trưởng chiều cao sau 10 ngày; tỷ lệ sống (%), chiều cao cây (cm), số lá (lá/cây), đường kính tán (cm) sau 4 tuần tại vườn ươm.
  • Số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm Microsoft Excel 2016 và IRRISTAT, so sánh sai khác giữa các giá trị trung bình qua kiểm định LSD ở mức ý nghĩa $\alpha = 0,05$.

---

Nội dung chính theo từng chương

Phần 1: Mở đầu

Trình bày tính cấp thiết của đề tài nghiên cứu nhân giống in vitro hoa cúc đại đóa tại Gia Lâm, Hà Nội nhằm khắc phục tình trạng thoái hóa giống do giâm cành truyền thống; xác định rõ mục đích xây dựng quy trình trọn gói từ nhân chồi, ra rễ đến huấn luyện vườn ươm cùng 3 yêu cầu cụ thể tương ứng với từng giai đoạn công nghệ.

Phần 2: Tổng quan tài liệu

• Đặc điểm sinh học và giá trị cây hoa cúc: Hệ thống hóa vị trí phân loại của loài Chrysanthemum morifolium (chi Chrysanthemum, họ Asteraceae); mô tả các đặc điểm thực vật học (bộ rễ chùm phân bố ở tầng đất 5–20 cm; thân thảo nhiều đốt; lá đơn xẻ thùy lông chim với 30–50 lá/chu kỳ; cụm hoa đầu trạng gồm hoa cái hình lưỡi bên ngoài và hoa lưỡng tính hình ống ở tâm; quả bế khô dài 2–3 mm). Tổng kết yêu cầu ngoại cảnh (ánh sáng ngày ngắn với 10h sáng/ngày khi phân hóa mầm hoa; nhiệt độ thích hợp 15–20°C; ẩm độ đất 80–85%, ẩm độ không khí 70–80%). Đánh giá năng suất mô hình thực tiễn (16.000–18.000 bông/sào/vụ, tương đương 443.000–478.000 bông/ha/vụ).
• Cơ sở khoa học và các giai đoạn vi nhân giống: Tổng kết 5 giai đoạn vi nhân giống (Khử trùng mô nuôi cấy $\rightarrow$ Tái sinh mẫu cấy $\rightarrow$ Nhân nhanh chồi $\rightarrow$ Tạo cây hoàn chỉnh $\rightarrow$ Thích ứng cây ngoài vườn ươm); phân tích vai trò của thành phần khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin (thiamin, nicotinic acid, pyridoxine, myo-inositol), nguồn carbon (sucrose), chất bổ sung hữu cơ và các nhóm phytohormone.
• Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước: Tổng thuật các công trình nghiên cứu vi nhân giống cúc của Roest & Bokelmann (1973), Lazar & Cachita (1983), Khan & cs. (1994), Datta & cs. (2010), cùng các nghiên cứu trong nước của Đặng Phương Trâm (2003–2006), Nguyễn Thị Diệu Hương & Dương Tấn Nhựt (2004), Nguyễn Quang Thạch & Nguyễn Thị Lý Anh (2005), Lâm Ngọc Phương & Phạm Lê Tuấn (2007), Nguyễn Bá Nam & cs. (2012), Nguyen Van Viet (2017).

Phần 3: Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Mô tả chi tiết nguồn gốc vật liệu của 2 giống cúc T1 (Tím) và Đ2 (Đỏ); hóa chất thí nghiệm (MS, BAP, NAA, than hoạt tính, sucrose, agar); thiết kế chi tiết 6 khối thí nghiệm thực nghiệm; tiêu chuẩn hóa các công thức tính toán chỉ tiêu sinh trưởng và quy trình phân tích thống kê phương sai bằng phần mềm IRRISTAT.

Phần 4: Kết quả và thảo luận

1. Xác định môi trường thích hợp cho giai đoạn nhân chồi

• Ảnh hưởng của BAP đơn độc:
  • Đối với giống Cúc đại đóa tím (T1): Công thức 3 (1/2 MS + 0,5 mg/l BAP) cho hiệu quả nhân chồi cao nhất với hệ số nhân chồi đạt 1,33 chồi/mẫu (sai khác có ý nghĩa thống kê so với đối chứng 0,0 mg/l BAP chỉ đạt 1,00 chồi/mẫu và công thức 0,7 mg/l BAP đạt 1,00 chồi/mẫu); tăng trưởng khối lượng chồi đạt 1,34 g/bình; chiều cao chồi đạt 2,15 cm; chồi sinh trưởng mập, lá xanh đậm. Khi nồng độ BAP tăng lên 0,7 mg/l, hệ số nhân giảm còn 1,00 chồi/mẫu và chồi mảnh.
  • Đối với giống Cúc đại đóa đỏ (Đ2): Công thức 2 (1/2 MS + 0,3 mg/l BAP) cho kết quả tối ưu với hệ số nhân chồi đạt 1,83 chồi/mẫu (khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức $\alpha = 0,05$ so với đối chứng 1,00 chồi/mẫu, mức 0,5 mg/l đạt 1,27 chồi/mẫu và mức 0,7 mg/l đạt 1,11 chồi/mẫu); tăng trưởng khối lượng chồi cao nhất đạt 1,83 g/bình; chiều cao chồi đạt 2,17 cm; chồi mập khỏe.

Giống	Công thức BAP (mg/l)	Tăng trưởng khối lượng (g/bình)	Hệ số nhân chồi (chồi/mẫu)	Chiều cao chồi (cm)	Đặc điểm hình thái chồi
Cúc đại đóa tím (T1)	CT1: 0,0 (ĐC)	1,60	1,00	4,04	Chồi xanh nhạt, thân mảnh
	CT2: 0,3	1,10	1,13	2,22	Chồi xanh, mập
	CT3: 0,5	1,34	1,33	2,15	Chồi xanh, mập, khỏe
	CT4: 0,7	0,91	1,00	1,80	Chồi xanh, mảnh
Cúc đại đóa đỏ (Đ2)	CT1: 0,0 (ĐC)	1,53	1,00	3,84	Chồi xanh nhạt, thân mảnh
	CT2: 0,3	1,83	1,83	2,17	Chồi xanh, mập, khỏe
	CT3: 0,5	1,30	1,27	1,58	Chồi xanh, mập
	CT4: 0,7	1,34	1,11	1,73	Chồi xanh, mảnh

• Ảnh hưởng của BAP kết hợp NAA: Kết quả thử nghiệm phối hợp BAP và NAA trên giống tím T1 cho thấy bổ sung NAA vào môi trường nhân chồi không mang lại hiệu quả tăng hệ số nhân. Công thức đối chứng không bổ sung NAA (0,5 mg/l BAP) đạt hệ số nhân cao nhất là 1,44 chồi/mẫu và chiều cao chồi 2,50 cm, sai khác có ý nghĩa so với các công thức có bổ sung NAA (CT2: 0,3 BAP + 0,1 NAA đạt 1,05 chồi/mẫu; CT3: 0,5 BAP + 0,1 NAA đạt 1,16 chồi/mẫu; CT4: 0,7 BAP + 0,3 NAA đạt 1,16 chồi/mẫu). Việc bổ sung NAA làm giảm chiều cao chồi (xuống còn 1,33–1,46 cm) và khiến chồi có xu hướng lùn, yếu.
• Ảnh hưởng của BAP kết hợp nước dừa: Việc bổ sung dịch chiết hữu cơ nước dừa giúp gia tăng rõ rệt chất lượng và hệ số nhân chồi:
  • Giống tím (T1): Môi trường 1/2 MS + 0,5 mg/l BAP + 10% nước dừa là thích hợp nhất, cho tăng trưởng khối lượng chồi đạt 2,02 g/bình, hệ số nhân chồi đạt 1,56 chồi/mẫu, chiều cao chồi đạt 2,32 cm; chồi mập, lá xanh đậm.
  • Giống đỏ (Đ2): Môi trường 1/2 MS + 0,3 mg/l BAP + 5% nước dừa cho hiệu quả cao nhất, tăng trưởng khối lượng chồi đạt 1,65 g/bình, hệ số nhân chồi đạt 2,16 chồi/mẫu, chiều cao chồi đạt 1,47 cm; chồi sinh trưởng khỏe.

2. Xác định môi trường thích hợp cho giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh (ra rễ)

• Ảnh hưởng của NAA: Môi trường bổ sung NAA thúc đẩy cảm ứng ra rễ, trong đó mức 0,3 mg/l NAA thích hợp cho giống tím và mức 0,5 mg/l NAA thích hợp cho giống đỏ.
• Ảnh hưởng của than hoạt tính (AC): Việc sử dụng than hoạt tính đem lại tỷ lệ ra rễ đạt tuyệt đối 100%, chất lượng bộ rễ vượt trội so với môi trường chỉ dùng auxin đơn thuần:
  • Giống tím (T1): Môi trường 1/2 MS + 0,3 g/l AC cho tỷ lệ ra rễ đạt 100%, số rễ đạt 6,55 rễ/cây, chiều dài rễ đạt 3,05 cm.
  • Giống đỏ (Đ2): Môi trường 1/2 MS + 0,5 g/l AC cho tỷ lệ ra rễ đạt 100%, số rễ đạt 5,50 rễ/cây, chiều dài rễ đạt 2,59 cm.

3. Khả năng sinh trưởng của cây in vitro giai đoạn vườn ươm

Sau 4 tuần chuyển cây con in vitro ra khay 104 lỗ sử dụng giá thể đất phù sa + peatmoss (1:1):

• Cây Cúc đại đóa tím (T1): Nguồn cây xuất phát từ môi trường ra rễ bổ sung 0,3 mg/l NAA đạt sinh trưởng tốt nhất với tỷ lệ sống 90,00%, chiều cao cây đạt 4,08 cm, số lá đạt 9,53 lá/cây, đường kính tán đạt 4,47 cm.
• Cây Cúc đại đóa đỏ (Đ2): Nguồn cây xuất phát từ môi trường ra rễ bổ sung 0,5 mg/l NAA sinh trưởng vượt trội với tỷ lệ sống đạt 96,67%, chiều cao cây đạt 3,61 cm, số lá đạt 8,06 lá/cây, đường kính tán đạt 3,65 cm.

Phần 5: Kết luận và kiến nghị

Tổng kết toàn bộ quy trình vi nhân giống hoàn chỉnh cho 2 giống cúc đại đóa; kiến nghị triển khai quy trình vào hệ thống sản xuất giống hoa thương phẩm nhằm nâng cao hệ số nhân giống và chất lượng cây con sạch bệnh.

---

Kết quả và đóng góp

Bảng tổng hợp thông số kỹ thuật tối ưu theo quy trình

Giai đoạn kỹ thuật	Chỉ tiêu / Thông số	Giống Cúc đại đóa tím (T1)	Giống Cúc đại đóa đỏ (Đ2)
Nhân nhanh chồi	Thành phần môi trường tối ưu	1/2 MS + 0,5 mg/l BAP + 10% nước dừa	1/2 MS + 0,3 mg/l BAP + 5% nước dừa
	Tăng trưởng khối lượng chồi	2,02 g/bình	1,65 g/bình
	Hệ số nhân chồi	1,56 chồi/mẫu	2,16 chồi/mẫu
	Chiều cao chồi	2,32 cm	1,47 cm
	Đặc điểm hình thái	Chồi khỏe, mập, xanh đậm	Chồi khỏe, mập, xanh đậm
Tạo cây hoàn chỉnh	Thành phần môi trường tối ưu	1/2 MS + 0,3 g/l Than hoạt tính (AC)	1/2 MS + 0,5 g/l Than hoạt tính (AC)
	Tỷ lệ ra rễ	100%	100%
	Số rễ trung bình	6,55 rễ/cây	5,50 rễ/cây
	Chiều dài rễ trung bình	3,05 cm	2,59 cm
Thích nghi vườn ươm	Nguồn gốc xử lý ra rễ tối ưu	Môi trường 1/2 MS + 0,3 mg/l NAA	Môi trường 1/2 MS + 0,5 mg/l NAA
	Giá thể nuôi dưỡng	Đất phù sa + Peatmoss (1:1)	Đất phù sa + Peatmoss (1:1)
	Tỷ lệ cây sống sau 4 tuần	90,00%	96,67%
	Chiều cao cây	4,08 cm	3,61 cm
	Số lá trung bình	9,53 lá/cây	8,06 lá/cây
	Đường kính tán	4,47 cm	3,65 cm

Giải pháp và kiến nghị của tác giả

• Ứng dụng công thức môi trường chuyên biệt theo từng kiểu gen giống: Không áp dụng một nồng độ BAP cố định cho mọi giống cúc mà phân hóa cụ thể (0,5 mg/l BAP đối với cúc tím; 0,3 mg/l BAP đối với cúc đỏ).
• Kết hợp nước dừa (5–10%) ở giai đoạn nhân chồi nhằm tăng cường sức sống mô nuôi cấy và giảm sự phụ thuộc vào các chất điều hòa sinh trưởng đắt tiền.
• Sử dụng than hoạt tính (0,3–0,5 g/l) ở giai đoạn ra rễ in vitro để thu được tỷ lệ ra rễ 100% với bộ rễ khỏe mạnh trước khi chuyển ra vườn ươm.

Đóng góp của đề tài

• Xác lập quy trình vi nhân giống in vitro khép kín có độ tin cậy thực nghiệm cao cho 2 giống hoa cúc đại đóa Tím và Đỏ tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
• Cung cấp dẫn liệu thực nghiệm chi tiết chứng minh sự khác biệt về nhu cầu cytokinin ngoại sinh giữa các giống trong cùng một loài Chrysanthemum morifolium.
• Đánh giá định lượng khả năng thích nghi và tỷ lệ sống cao (>90%) của cây con in vitro khi đưa ra ngoài vườn ươm trên giá thể phối trộn đất phù sa và peatmoss.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế: Phạm vi thí nghiệm giới hạn trên 2 giống cúc đại đóa cụ thể (T1 và Đ2); các đánh giá ở giai đoạn vườn ươm mới dừng lại ở thời điểm 4 tuần tuổi với một công thức phối trộn giá thể duy nhất (đất phù sa + peatmoss tỷ lệ 1:1), chưa khảo sát các tổ hợp giá thể hữu cơ bản địa khác. Đề tài chưa theo dõi các giai đoạn sinh trưởng sinh thực tiếp theo ngoài đồng ruộng (phân hóa mầm hoa, nở hoa, chất lượng cành hoa thương phẩm).
• Hướng nghiên cứu tiếp: Thử nghiệm mở rộng quy trình trên các giống cúc đại đóa có màu sắc khác (trắng, vàng); khảo sát các loại giá thể vườn ươm thay thế có chi phí thấp (mụn xơ dừa, trấu hun); đánh giá đầy đủ các chỉ tiêu nông học, năng suất và độ bền hoa khi trồng thương phẩm trên đồng ruộng.

---

Giá trị tham khảo

• Đối tượng tham khảo:
  • Sinh viên, học viên cao học chuyên ngành Nông học, Khoa học cây trồng, Công nghệ sinh học thực vật và Làm vườn.
  • Cán bộ nghiên cứu, kỹ thuật viên vận hành các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật thương mại quy mô vừa và lớn.
• Nội dung giá trị:
  • Phương pháp thiết kế, bố trí thí nghiệm CRD và xử lý thống kê dữ liệu vi nhân giống bằng IRRISTAT.
  • Bảng nồng độ chuẩn xác của BAP, NAA, than hoạt tính và nước dừa cho từng giai đoạn phát sinh hình thái cây cúc.
  • Quy trình kỹ thuật thuần dưỡng và luyện cây con in vitro thích ứng điều kiện vườn ươm.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Môi trường tối ưu cho giai đoạn nhân nhanh chồi của giống Cúc đại đóa tím (T1) gồm những thành phần nào và đạt kết quả ra sao?

Môi trường tối ưu là 1/2 MS + 30 g/l sucrose + 6,5 g/l agar + 0,5 mg/l BAP + 10% nước dừa (pH 5,8). Sau 6 tuần nuôi cấy, môi trường này cho tăng trưởng khối lượng chồi đạt 2,02 g/bình, hệ số nhân chồi đạt 1,56 chồi/mẫu, chiều cao chồi đạt 2,32 cm; chồi mập, khỏe và có màu xanh đậm.

2. Giữa giống cúc tím (T1) và cúc đỏ (Đ2) có sự khác biệt như thế nào về nồng độ BAP và nước dừa trong giai đoạn nhân chồi?

Giống tím T1 có nhu cầu cytokinin và chất hữu cơ bổ sung cao hơn: tối ưu ở nồng độ 0,5 mg/l BAP kết hợp 10% nước dừa (nếu dùng BAP đơn thì mức 0,5 mg/l đạt 1,33 chồi/mẫu). Trong khi đó, giống đỏ Đ2 đáp ứng ở ngưỡng thấp hơn: tối ưu ở nồng độ 0,3 mg/l BAP kết hợp 5% nước dừa (nếu dùng BAP đơn thì mức 0,3 mg/l đã cho hệ số nhân 1,83 chồi/mẫu, việc tăng BAP lên 0,5–0,7 mg/l làm giảm hệ số nhân của giống đỏ).

3. Việc kết hợp NAA vào môi trường chứa BAP ở giai đoạn nhân chồi có mang lại hiệu quả cao hơn không?

Không. Kết quả thí nghiệm trên giống tím T1 cho thấy bổ sung NAA (0,1–0,3 mg/l) kết hợp với BAP không làm tăng hệ số nhân chồi mà ngược lại làm giảm hệ số nhân (từ 1,44 chồi/mẫu ở công thức chỉ có BAP xuống còn 1,05–1,16 chồi/mẫu ở các công thức bổ sung NAA), đồng thời làm giảm chiều cao chồi và khiến chồi có biểu hiện lùn, yếu.

4. Vai trò của than hoạt tính (AC) trong giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh được ghi nhận như thế nào?

Than hoạt tính giúp môi trường đạt tỷ lệ ra rễ tuyệt đối 100% sau 10 ngày cấy:

• Giống tím T1 tối ưu trên môi trường 1/2 MS + 0,3 g/l AC, tạo ra 6,55 rễ/cây với chiều dài rễ trung bình 3,05 cm.
• Giống đỏ Đ2 tối ưu trên môi trường 1/2 MS + 0,5 g/l AC, tạo ra 5,50 rễ/cây với chiều dài rễ trung bình 2,59 cm.

5. Khả năng sống sót và sinh trưởng của cây con ngoài vườn ươm đạt kết quả cụ thể như thế nào sau 4 tuần?

Trên giá thể đất phù sa + peatmoss (1:1), cây con đạt tỷ lệ sống và phát triển rất cao:

• Cây giống tím T1 (từ môi trường ra rễ 0,3 mg/l NAA) đạt tỷ lệ sống 90,00%, chiều cao 4,08 cm, số lá 9,53 lá/cây và đường kính tán 4,47 cm.
• Cây giống đỏ Đ2 (từ môi trường ra rễ 0,5 mg/l NAA) đạt tỷ lệ sống 96,67%, chiều cao 3,61 cm, số lá 8,06 lá/cây và đường kính tán 3,65 cm.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Dương Thị Quỳnh đã hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro và thuần dưỡng vườn ươm cho hai giống Cúc đại đóa tím và Cúc đại đóa đỏ tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Nghiên cứu đã xác định rõ sự khác biệt về nhu cầu dinh dưỡng và chất điều hòa sinh trưởng giữa hai giống ở giai đoạn nhân chồi (0,5 mg/l BAP + 10% nước dừa cho giống tím; 0,3 mg/l BAP + 5% nước dừa cho giống đỏ), giai đoạn tạo rễ bằng than hoạt tính và giai đoạn vườn ươm. Kết quả đạt tỷ lệ ra rễ 100% cùng tỷ lệ sống ngoài vườn ươm từ 90,00% đến 96,67%, cung cấp quy trình kỹ thuật hoàn chỉnh phục vụ công tác sản xuất cây giống hoa cúc thương phẩm sạch bệnh và chất lượng cao.

Trích đoạn nội dung tài liệu

mở đầu cũng nghiệp vi nhân giống thực vật. 8 Năm 1960, Cocking lần đầu tiên sử dụng enzym phân giải thành tế bào và đã tạo ra số lượng lớn tế bào trần. Kỹ thuật này sau đó đã được hoàn thiện để tách nuôi tế bào trần ở nhiều cây trồng khác nhau. đã tái sinh được cây từ tế bào trần mô thịt lá (mesophyll cell) ở thuốc lá.

Năm 1972, Carlson và cộng sự lần đầu tiên thực hiện lại tế bào sôma giữa các loài, tạo được cây từ dung hợp tế bào trần của 2 loại thuốc lá Nicotiana glauca và N. tạo được cây lai soma “cà chua thuốc lá” bằng lai xa tế bào trần của 2 cây này. Đến nay, việc tái sinh cây hoàn chỉnh từ tế bào trần hoặc từ lai tế bào trần đã thành công ở nhiều loài thực vật. Năm 1964, Guha và Maheshwari lần đầu tiên thành công trong tạo được cây đơn bội từ nuôi cấy bao phấn của cây cà Datura.

Kỹ thuật này sau đó đã được nhiều tác giả phát triển và ứng dụng rộng rãi trong tạo dòng đơn bội (1x), dòng thuần nhị bội kép (2x), cố định ưu thế lai (nuôi cấy bao phấn hoặc hạt phấn của dòng lai F1 để tạo giống thuần mang tính trạng ưu thế lai). Năm 1985 Flores và Filner lần đầu tiên sản xuất chất trao đổi thứ cấp từ nhân nuôi rễ tơ ở Hyoscyamus mutics. Những rễ này sản xuất nhiều hoạt chất hyoscyamine hơn cây tự nhiên. Hiện nay, công nghệ nuôi cấy tế bào và mô (ví dụ mô rễ của nhân sâm) trong các bioreactor dung tích lớn đã được thương mại hoá ở mức công nghiệp để sản xuất sinh dược.Cơ sở khoa học của nhân giống in vitro Theo Đặng Ngọc Hùng (2009), nguyên lý cơ bản của nhân giống nuôi cấy mô tế bào là tính toàn năng của tế bào thực vật.

Mỗi tế bào bất kỳ của cơ thể thực vật đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đầy đủ của thực vật đó còn gọi là bộ gen. Đặc tính của thực vật được thể hiện ra kiểu hình cụ thể trong từng thời kỳ của quá trình phát triển phụ thuộc vào sự giải mã các thông tin di truyền tương ứng trong hệ gen của tế bào. Do đó, khi gặp điều kiện thích hợp, trong mối tương tác qua lại với điều kiện môi trường, cơ quan, mô hoặc tế 9 bào đều có thể phát triển thành một cá thể mới hoàn chỉnh mang những đặc tính di truyền giống như cây mẹ. Sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào: Sự phân hóa: là tiến trình quy định biến đổi tế bào phôi sinh thành tế bào chuyên hóa.

Sự phản phân hóa tế bào: là quá trình chuyển tế bào chuyên hóa về một chức năng nào đó về trạng thái phôi sinh ban đầu và phân chia mạnh mẽ. Giai đoạn nhân giống invitro Theo Nguyễn Thị Lý Anh & Nguyễn Quang Thạch (2005) sự thành công của việc nhân giống in vitro chỉ đạt được khi trải qua các giai đoạn: Giai đoạn 1: Khử trùng mô nuôi cấy Đây là giai đoạn tối quan trọng quyết định toàn bộ quá trình nhân giống in vitro. Mục đích của giai đoạn này là phải tạo ra được nguyên liệu vô trùng để đưa vào nuôi cấy in vitro. Vô trùng mô cấy là một thao tác khó, ít khi thành công ngay lần đầu tiên.

Tuy vậy, nếu kiên trì tìm được nồng độ và thời gian vô trùng thích hợp thì sau vài lần thử chắc chắn sẽ đạt kết quả. Giai đoạn 2: Tái sinh mẫu nuôi cấy Mục đích của các giai đoạn này là sự tái sinh một cách định hướng các mô nuôi cấy. Quá trình này được điều khiển chủ yếu dựa vào tỷ lệ của các hợp chất auxin, cytokynin ngoại sinh đưa vào môi trường nuôi cấy.