LỜI MỞ ĐẦU Ngày nay, con người đang phải đối mặt với nhiều nguy cơ mắc những căn bệnh mãn tính nguy hiểm do tình trạng ô nhiễm môi trường, stress, tiếp xúc với hóa chất độc hại. Nguyên nhân của những căn bệnh này chính là gốc tự do- một thủ phạm tiềm tàng và nguy hiểm. Nhiều công trình nghiên cứu khoa học đã chỉ ra rằng việc sử dụng thường xuyên các chất kháng oxy hóa tự nhiên có khả năng ức chế sự hình thành gốc tự do, từ đó ngăn ngừa các căn bệnh nguy hiểm như: huyết áp, tim mạch, ung thư… Các hoạt chất kháng oxy hóa không chỉ chứa trong phần thịt quả, lá hay ngọn (phần ăn được)của các rau củ quả mà nó còn hiện diện cả trong vỏ, hạt, thân (phần phụ phẩm không ăn được), thậm chí ở một số loại rau quả hoạt chất trong phần phụ phẩm còn nhiều hơn phần có thể ăn được. Hiện nay phần lớn các phụ phẩm rau quả thải ra từ các nhà máy sản xuất chế biến nước hoa quả, bánh, mứt,…chỉ được tái sử dụng làm thức ăn chăn nuôi và làm phân bón, một số khác trở thành rác thải.
Bằng việc nghiên cứu hoạt tính kháng oxy hóa của các chất chiết xuất từ phụ phẩm ta có thể tận dụng được nguồn phụ phẩm dồi dào ấy nâng cao giá trị kinh tế, đồng thời nâng cao vai trò, giá trị sử dụng của chúng. Điều này không chỉ có ý nghĩa lớn về mặt y học, dinh dưỡng thực phẩm, kinh tế mà còn góp phần bảo vệ môi trường. Bởi việc tái sử dụng lượng lớn phụ phẩm rau quả sẽ tiết kiệm được nhiều chi phí, tránh việc thải ra môi trường một lượng rác sinh học và hơn thế các hoạt chất kháng oxy hóa mạnh từ chúng có giá trị phục vụ cho ngành công nghệ thực phẩm và y dược, góp phần phòng tránh những bệnh nan y và cải thiện sức khỏe con người tốt hơn. Bên cạnh đó, các phương pháp bảo quản dầu, mỡ hiện nay ở nước ta chủ yếu là sử dụng các phụ gia BHT (butylated hydroxytoluen), BHA (butylated hydroxyanisole)…Các phụ gia này đa số không có xuất xứ rõ ràng, hoặc chủ yếu xuất xứ từ Trung Quốc, một số ít có xuất xứ từ Tây Ban Nha, Nga…Việc sử dụng không đúng quy định, đúng liều lượng các loại phụ gia này gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe người tiêu dùng và vấn đề an toàn vệ sinh thực phẩm.
Từ thực tiễn đó, chúng tôi thực hiện đề tài: Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa của các phụ phẩm rau củ quả Việt Nam và ứng dụng bảo quản mỡ heo làm đề tài khóa luận tốt nghiệp. xxiii do an Mục tiêu của đề tài: Sàng lọc hoạt tính kháng oxy hoá của 44 mẫu phụ phẩm thực phẩm có nguồn gốc từ ba vùng Tây Nguyên, Ninh Thuận-Bình Thuận và Tây Nam Bộ bằng phương pháp thử hoạt tính ức chế H2O2. Lựa chọn các mẫu phụ phẩm có hoạt tính mạnh từ hai phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH và ức chế H2O2, từ đó nghiên cứu và ứng dụng bảo quản mỡ heo bằng các mẫu phụ phẩm này. Đối tƣợng nghiên cứu: 44 mẫu phụ phẩm trái cây vùng Tây Nguyên, Ninh Thuận- Bình Thuận và Tây Nam Bộ.
Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu Thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hoá bằng phương pháp ức chế H2O2. Từ đó lựa chọn ra mẫu có hoạt tính kháng oxy hoá mạnh. Nghiên cứu và ứng dụng bảo quản mỡ heo bằng các mẫu có hoạt tính mạnh đồng thời đanh giá các chỉ số acid, peroxide của mỡ heo qua thời gian bảo quản. Ý nghĩa mà đề tài đem lại Nghiên cứu khảo sát và sàng lọc hoạt tính kháng oxy hoá của các phụ phẩm rau quả vùng Tây Nguyên, Ninh Thuận-Bình Thuận và Tây Nam Bộ nhằm tìm ra các mẫu phụ phẩm có hoạt tính mạnh, phục vụ cho các đề tài nghiên cứu cô lập và định danh các hoạt chất kháng oxy hoá về sau.
Ngoài ra hướng nghiên cứu về phụ phẩm không chỉ tận dụng được nguồn nguyên liệu rẻ với số lượng tương đối lớn, mà còn giúp giải quyết phần nào về vấn đề môi trường. xxiv do an CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.Gốc tự do 1. Định nghĩa Gốc tự do (free radicals) được định nghĩa là những phân tử, nguyên tử, nhóm nguyên tử có chứa một hay nhiều electron tự do (electron độc thân) ở lớp ngoài cùng. Nonradical là những hợp chất dễ bị chuyển đổi thành những gốc tự do.[30] Các gốc tự do thường kém bền và có năng lượng cao.
Gốc tự do có thể cho hay nhận một electron từ những phân tử, nguyên tử khác và tham gia vào những phản ứng hoá học như phản ứng oxy hoá – khử…[23] 1. Phân loại Gốc tự do gồm 2 dạng hoạt động chính là: dạng hoạt động của nitrogen (RNS – reactive nitrogen species) và dạng hoạt động của oxygen (ROS – reactive oxygen species). Thuật ngữ RNS không chỉ bao gồm gốc tự do có trung tâm hoạt động là nitrogen (nitric oxide và nitrogen dioxide) mà còn bao gồm những dạng nonradical (acid peroxynitrous hay peroxynitrite). Các dạng hoạt động của nitrogen [5], [23], [28] Thời gian Các dạng hoạt động Ký hiệu Nguồn gốc tồn tại Vai trò rất quan trọng trong hệ ● Nitric oxide NO 1s thống thần kinh trung ương và Radicals ngoại biên.
Nitrogen Hình thành trong quá trình ô NO2● 1s dioxide nhiễm không khí Acid Khá ổn Được hình thành khi ONOO─ ONOOH peroxynitrous định nhận thêm 1 proton. Nonradicals ─ -3 Hoạt tính cao, hình thành từ NO● Peroxynitrite ONOO 10 s và O2●─ 1 do an Tương tự, thuật ngữ ROS là thuật ngữ dùng để chỉ những gốc có trung tâm hoạt động là oxygen (như superoxide, hydroxyl,…) và những hợp chất như hydrogen peroxide, acid hypoclorous,… Bảng 1. Các dạng hoạt động của oxygen[5], [23], [28] Thời Ký Các dạng hoạt động gian Hoạt động hiệu tồn tại Tạo ra trong ty thể (mitochondria), hệ Superoxide O2●─ 10-6s thống tim mạch và các bộ phận khác. Hoạt tính cao, được tạo ra trong tình Gốc hydroxyl HO● 10-9s trạng cơ thể dư chất sắt (phản ứng Radical Fenton) Alkoxyl RO● 1s Hoạt tính cao, được hình thành khi Gốc peroxyl ROO● 1s các đại phân tử bị gốc tự do tấn công Hydroperoxide Phản ứng với các ion kim loại chuyển ROOH Ổn định hữu cơ tiếp để tạo ra các dạng hoạt động.
Là tác nhân oxy hóa mạnh, dễ dàng Hydrogen H2O2 Bền nhận 1 electron để chuyển hóa thành peroxide gốc tự do HO● Hoạt tính cao, hình thành trong quá 1 Nonradical Singlet oxygen O2 10-6s trình quang học (photosensitization) và phản ứng hóa học Là 1 chất gây ô nhiễm trong khí Ozon O3 1s quyển, có thể phản ứng với các phân tử khác nhau để tạo ra 1O2. Hai gốc tự do quan trọng chứa nitrogen là NO• và ONOO─, trong đó NO• là gốc tự do được quan tâm nhiều nhất do nó có vai trò rất quan trọng trong hệ thống thần kinh trung ương, ngoại biên và là tác nhân điều hòa huyết áp.Ngược lại, các dạng hoạt động của oxygen là tác nhân nguy hiểm gây hơn 60 bệnh lý.Các dạng oxygen hoạt động này có năng lượng cao, rất kém bền và dễ dàng phản ứng với những đại phân tử sinh học như protein, lipid, DNA… gây rối loạn các quá trình sinh hóa trong cơ thể. Đồng thời khi một phân tử sống bị 2 do an các gốc tự do tấn công, nó sẽ mất điện tử và trở thành một gốc tự do mới, tiếp tục phản ứng với những phân tử khác tạo thành một chuỗi phản ứng thường gọi là phản ứng dây chuyền trong cơ thể, gây ra các biến đổi có tác hại đối với cơ thể. Nguồn phát sinh gốc tự do Gốc tự do được chính cơ thể tạo ra bởi quá trình sinh lý (quá trình hô hấp tế bào), quá trình bệnh lý (quá trình viêm nhiễm) hoặc bởi hệ thống enzyme thân oxy hoá (prooxydant enzyme) và sự có mặt của các ion kim loại chuyển tiếp trong cơ thể.
Ngoài ra gốc tự do còn phát sinh khi tiếp xúc với các nguồn bên ngoài như tia UV, ozone, hút thuốc lá, ô nhiễm không khí, và hóa chất công nghiệp [4], [30]. Gốc tự do cũng được hình thành trong quá trình chế biến thực phẩm giàu béo dưới nhiệt độ cao. a) Nguồn nội sinh Quá trình hô hấp của tế bào Một chuỗi những phản ứng oxy hóa–khử xảy ra trong quá trình hô hấp của tế bào, tạo ra sản phẩm trung gian là các gốc tự do. Hội chứng viêm nhiễm Khi các vi khuẩn hoặc các sinh vật lạ xâm nhập vào cơ thể sẽ bị bạch cầu đa nhân trung tính bao kín để làm nhiệm vụ thực bào.
Lúc này, enzyme NADPH oxidase ở màng bạch cầu được hoạt hóa, xúc tác phản ứng giữa O2 và NADPH tạo nên gốc tự do O2●─, từ đó tạo nhiều gốc tự do khác nhằm phân hủy các sinh vật lạ. Một phần các gốc tự do bị thoát ra ngoài bạch cầu, gây nên những phản ứng viêm. Các enzyme thân oxy hóa Một hệ thống các enzyme thân oxy hóa trong cơ thể có khả năng tạo gốc tự do như xanthine oxidase (XO), NADPH oxidase, nitric oxide synthase, myeloperoxidase … Gốc O2●─ và NO● là 2 gốc tự do chính được sinh ra dưới sự xúc tác của các enzyme thân oxy hóa này. Các ion kim loại chuyển tiếp Phản ứng Fenton giữa một ion kim loại chuyển tiếp (Fe, Cu, Co,…) và một hợp chất peroxide cũng góp phần sản sinh gốc tự do trong cơ thể.
Phản ứng phân hủy H2O2 thành gốc HO● dưới xúc tác ion sắt là một ví dụ điển hình (phản ứng 1.2) 3 do an Fe2+ + H2O2 HO- + HO● + Fe3+ (1.1) Fe3+ + H2O2 H+ + HOO● + Fe2+ (1.2) b) Nguồn ngoại sinh Gốc tự do được hình thành trong cơ thể bởi các yếu tố ngoại sinh như sự ô nhiễm môi trường, bức xạ, khói thuốc, ozon … Sự bức xạ Thành phần chủ yếu của cơ thể là nước, do đó các bức xạ có năng lượng cao (tia X, tia UV…) khi chiếu vào cơ thể sẽ phân hủy các phân tử nước thành các gốc tự do, có khả năng phản ứng rất mạnh. Dưới tác dụng của bức xạ, các gốc tự do như HO●, O2●─, HOO● được hình thành trong cơ thể. Điều này có thể giải thích vì sao sự lão hóa của da người sẽ tăng lên tại những vùng bị phơi bày dưới ánh sáng. Đó là do các bức xạ mặt trời, tia cực tím đã làm sản sinh những gốc tự do có khả năng tham gia quá trình peroxyde hóa lipid ở các tế bào da.
Bức xạ cũng có thể khơi mào những phản ứng gốc trong tế bào, chẳng hạn như sự tự oxy hóa các lipid.