Luận án tiến sĩ nghiên cứu thành phần hóa học và xây dựng quy trình chế biến sản phẩm có tác dụng tăng cường sức khỏe từ cua lột scylla

Luận án tiến sĩ nghiên cứu thành phần hóa học và quy trình chế biến sản phẩm từ cua lột Scylla, mang lại lợi ích sức khỏe cho người tiêu dùng.

• Tác giả: Nguyễn Thị Phương Lan
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Quyết Chiến
• Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ
• Chuyên ngành: Kỹ thuật Hóa học
• Đề tài: Nghiên Cứu Hóa Học Và Quy Trình Chế Biến Sản Phẩm Từ Cua Lột Scylla Tăng Cường Sức Khỏe
• Loại tài liệu: luận án
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỤC LỤC
• DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG I: TỔNG QUAN VỀ CUA Scylla spp
• 1.1. Giới thiệu chung về cua
• 1.2. Giới thiệu về chi cua bùn Scylla
• 1.3. Giới thiệu chung về cua lột và nghề nuôi cua lột
• 1.4. Tình hình sử dụng, chế biến cua lột
• 1.5. Các nghiên cứu hóa học về cua
• 1.5.1. Nghiên cứu về thành phần hóa học các loài cua biển trên thế giới
• 1.5.2. Nghiên cứu về thành phần hóa học của các loài cua bùn Scylla
• 1.5.3. Nghiên cứu về các chất có hoạt tính sinh học của các loài cua
• 1.5.3.1. Hoạt tính chống oxy hóa
• 1.5.3.2. Hoạt tính kháng vi sinh vật
• 1.5.3.3. Các hoạt tính khác
• 1.5.3.4. Hoạt tính của lipid và phospholipid
• 1.6. Công nghệ thuỷ phân protein trong chế biến thực phẩm
• 1.6.1. Giới thiệu chung
• 1.6.2. Tính chất hóa lý của protein thủy phân
• 1.6.3. Hoạt tính sinh học của protein thủy phân
• 1.6.4. Ứng dụng của protein thủy phân
• 1.6.5. Các phương pháp thủy phân protein
• 1.7. Giới thiệu về quy hoạch thực nghiệm và tối ƣu hóa quy trình công nghệ hóa học
• 1.7.1. Giới thiệu về quy hoạch thực nghiệm (Phương pháp bề mặt đáp ứng – RSM)
• 1.7.2. Phần mềm quy hoạch thực nghiệm Design Expert 12
• 1.7.3. Định hƣớng nghiên cứu
• 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
• 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
• 2.2.1. Các phương pháp xác định thành phần hóa học
• 2.2.2. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học
• 2.2.3. Phương pháp thủy phân bằng công nghệ enzym
• 2.2.4. Phương pháp quy hoạch thực nghiệm và tối ưu hóa quy trình công nghệ
• 2.3. Sơ chế và xử lý mẫu cua lột
• 2.4. Sơ đồ nghiên cứu mẫu cua lột
• 2.5. Phân tích các thành phần hóa học cơ bản
• 2.5.1. Xác định hàm lượng ẩm
• 2.5.2. Xác định hàm lượng tro
• 2.5.3. Xác định hàm lượng protein
• 2.5.4. Xác định hàm lượng lipid t ng
• 2.6. Xác định khoáng chất
• 2.6.1. Xác định Ca, Mg, Na, K, P, Fe, Zn
• 2.6.2. Phương pháp xác định Cu, Mn
• 2.7. Xác định cholesterol, ecdysone
• 2.8. Phân tích thành phần và hàm lƣợng axit amin
• 2.9. Xác định thành phần và hàm lƣợng các axit béo
• 2.10. Xác định thành phần và hàm lƣợng các lớp chất lipid trong lipid tổng
• 2.11. Phân tích các dạng phân tử của lipid phân cực
• 2.12. Xác định các nhóm chất trong từng phân lớp lipid phân cực
• 2.13. Xác định các dạng phân tử của phân lớp phospholipid
• 2.14. Thử nghiệm hoạt tính sinh học
• 2.14.1. Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư
• 2.14.2. Thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp đo malondialdehyde (MDA)
• 2.14.3. Thử nghiệm hoạt tính kháng viêm
• 2.14.4. Thử nghiệm hoạt tính chống loãng xương của sản phẩm thủy phân cua lột và sản phẩm thực phẩm chức năng từ bột cua lột thuỷ phân
• 2.15. Nghiên cứu và tối ƣu hóa quá trình thủy phân cua lột bằng enzym
• 2.15.1. Thiết bị và nguyên liệu
• 2.15.2. Quy trình chung cho phản ứng thủy phân
• 2.15.3. Xác định độ thủy phân (phương pháp OPA) và hàm lượng peptid
• 2.15.4. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng
• 2.15.5. Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thủy phân
• 2.16. Nghiên cứu và tối ƣu hóa quá trình sấy phun
• 2.16.1. Thiết bị và nguyên liệu
• 2.16.2. Quy trình chung
• 2.16.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sấy phun
• 2.16.4. Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình sấy phun
• 2.17. Sản xuất bột cua lột thủy phân ở qui mô pilot
• 2.18. Sơ đồ định hƣớng nghiên cứu quy trình công nghệ tạo sản phẩm có tác dụng tăng cƣờng sức khỏe quy mô phòng thí nghiệm
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Thành phần hóa học của cua lột Scylla paramamosain
• 3.1.1. Các thành phần hóa học cơ bản
• 3.1.2. Hàm lượng ẩm và tro của cua lột
• 3.1.3. Hàm lượng protein
• 3.1.4. Hàm lượng lipid
• 3.1.5. Hàm lượng vitamin
• 3.1.6. Hàm lượng khoáng chất
• 3.2. Thành phần và hàm lượng các axit amin
• 3.3. Thành phần và hàm lượng các lớp chất lipid của cua lột
• 3.4. Thành phần và hàm lượng các axit béo
• 3.5. Xác định các dạng phân tử của lớp chất phospholipid
• 3.6. Hàm lượng cholesterol và ecdysone trong quá trình lột xác của cua lột
• 3.7. Kết quả đánh giá hoạt tính sinh học của các lớp chất lipid của cua lột
• 3.7.1. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng viêm
• 3.7.2. Kết quả đánh giá hoạt tính chống oxy hóa
• 3.7.3. Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư
• 3.8. Xây dựng và tối ƣu hóa quy trình thủy phân cua lột bằng enzym
• 3.8.1. Nghiên cứu lựa chọn enzym cho quá trình thủy phân
• 3.8.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của các đơn yếu tố đến hàm mục tiêu của quá trình
• 3.8.2.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH
• 3.8.2.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ
• 3.8.2.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nước bổ sung vào nguyên liệu
• 3.8.2.4. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ enzym/cơ chất (E/S)
• 3.8.2.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian thủy phân
• 3.8.3. Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thủy phân bằng phương pháp bề mặt đáp ứng
• 3.8.3.1. Thiết lập mô hình và xây dựng ma trận kế hoạch thực nghiệm
• 3.8.3.2. Kiểm tra sự có nghĩa của mô hình
• 3.8.3.3. Tối ưu hóa quy trình thủy phân
• 3.8.3.4. Kiểm tra lại mô hình tối ưu hóa
• 3.9. Xây dựng và tối ƣu hóa quy trình sấy phun sản phẩm thủy phân cua lột
• 3.9.1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm của quá trình sấy phun
• 3.9.1.1. Ảnh hưởng của tốc độ đầu phun đến chất lượng sản phẩm
• 3.9.2. Thiết lập mô hình và xây dựng ma trận kế hoạch thực nghiệm
• 3.9.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ khí sấy đầu vào đến chất lượng sản phẩm
• 3.9.4. Ảnh hưởng của tốc độ bơm dịch đến chất lượng sản phẩm
• 3.9.5. Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình sấy phun bằng phương pháp bề mặt đáp ứng
• 3.9.5.1. Kiểm tra sự có nghĩa của mô hình
• 3.9.5.2. Tối ưu hóa quy trình sấy phun
• 3.9.5.3. Kiểm tra lại mô hình tối ưu hóa
• 3.10. Sản xuất bột cua lột thủy phân ở quy mô pilot
• 3.10.1. Quy trình sản xuất
• 3.10.2. Thành phần hóa học của sản phẩm thủy phân cua lột
• 3.10.2.1. Thành phần và hàm lượng dinh dưỡng chính
• 3.10.2.2. Thành phần và hàm lượng khoáng chất
• 3.10.3. Hoạt tính chống loãng xương của sản phẩm thủy phân cua lột và sản phẩm thực phẩm chức năng Boness từ bột cua lột thuỷ phân
• 3.11. Bào chế sản phẩm có tác dụng tăng cƣờng sức khỏe từ bột cua lột thủy phân
• 3.11.1. Sản phẩm “Forté Kid” chống còi xương ở trẻ em
• 3.11.1.1. Các nguyên liệu chính sử dụng để bào chế sản phẩm Forté Kid
• 3.11.1.2. Quy trình bào chế bột dinh dưỡng Forté Kid
• 3.11.1.3. Đánh giá cảm quan kết quả của bột dinh dưỡng
• 3.11.1.4. Công thức sản phẩm Forté Kid
• 3.11.2. Sản phẩm “Boness” chống loãng xương
• 3.11.2.1. Các nguyên liệu chính sử dụng để bào chế sản phẩm Boness
• 3.11.2.2. Xác định tá dược độn
• 3.11.2.3. Quy trình bào chế sản phẩm chống loãng xương Boness
• 3.11.2.4. Công thức sản phẩm chống loãng xương Boness
• NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
• CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về cua lột Scylla

Cua lột, thuộc chi Scylla, là một trong những loại hải sản có giá trị dinh dưỡng cao. Chúng được biết đến với hàm lượng protein và axit béo omega-3 phong phú, có tác dụng tích cực đến sức khỏe con người. Nghiên cứu cho thấy, cua lột không chỉ là nguồn thực phẩm ngon mà còn chứa nhiều chất chống oxy hóa, giúp bảo vệ cơ thể khỏi các tác nhân gây hại. Việc chế biến cua lột thành các sản phẩm dinh dưỡng có thể nâng cao giá trị sử dụng của chúng. Các sản phẩm từ cua lột có thể được phát triển thành thực phẩm chức năng, hỗ trợ tăng cường sức khỏe và phòng ngừa bệnh tật.

1.1. Đặc điểm sinh học của cua lột

Cua lột có đặc điểm sinh học đặc trưng, với lớp vỏ mềm sau khi lột xác. Điều này làm cho chúng dễ hấp thụ các chất dinh dưỡng từ môi trường. Các nghiên cứu hóa học cho thấy, cua lột chứa nhiều vitamin và khoáng chất, cần thiết cho sự phát triển và duy trì sức khỏe. Việc khai thác và chế biến cua lột cần được thực hiện một cách bền vững để bảo vệ nguồn tài nguyên này. Sự phát triển của công nghệ chế biến hiện đại có thể giúp tối ưu hóa quy trình chế biến, từ đó tạo ra các sản phẩm an toàn và chất lượng cao cho người tiêu dùng.

II. Nghiên cứu hóa học về cua lột

Nghiên cứu thành phần hóa học của cua lột Scylla đã chỉ ra rằng chúng chứa nhiều protein và lipid có giá trị dinh dưỡng cao. Các nghiên cứu đã xác định được hàm lượng cholesterol và ecdysone trong cua lột, cho thấy tiềm năng của chúng trong việc phát triển các sản phẩm chức năng. Việc phân tích các thành phần hóa học này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về giá trị dinh dưỡng của cua lột mà còn mở ra cơ hội cho việc phát triển các sản phẩm mới từ cua lột, như bột dinh dưỡng và thực phẩm chức năng. Các sản phẩm này có thể giúp tăng cường sức khỏe, hỗ trợ điều trị một số bệnh lý.

2.1. Thành phần dinh dưỡng của cua lột

Thành phần dinh dưỡng của cua lột rất phong phú, bao gồm các axit amin thiết yếu và các axit béo không bão hòa. Nghiên cứu cho thấy, cua lột có thể cung cấp một lượng lớn dinh dưỡng cho cơ thể, đặc biệt là trong việc hỗ trợ phát triển cơ bắp và tăng cường sức đề kháng. Các sản phẩm chế biến từ cua lột có thể được sử dụng như thực phẩm chức năng, giúp cải thiện sức khỏe tổng thể. Việc phát triển các sản phẩm này cần được chú trọng để đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của người tiêu dùng về thực phẩm an toàn và bổ dưỡng.

III. Quy trình chế biến sản phẩm từ cua lột

Quy trình chế biến sản phẩm từ cua lột bao gồm nhiều bước, từ sơ chế đến chế biến thành phẩm. Công nghệ chế biến hiện đại, đặc biệt là công nghệ enzym, được áp dụng để tối ưu hóa quy trình này. Việc sử dụng enzym trong chế biến không chỉ giúp bảo toàn các chất dinh dưỡng mà còn tạo ra các sản phẩm có hoạt tính sinh học cao. Các sản phẩm từ cua lột có thể được chế biến thành bột dinh dưỡng, thực phẩm chức năng, và các sản phẩm khác có tác dụng tăng cường sức khỏe. Điều này không chỉ nâng cao giá trị kinh tế của cua lột mà còn đáp ứng nhu cầu tiêu dùng ngày càng cao của thị trường.

3.1. Công nghệ chế biến và an toàn thực phẩm

Công nghệ chế biến cua lột cần đảm bảo an toàn thực phẩm, từ khâu thu hoạch đến chế biến. Việc áp dụng các tiêu chuẩn an toàn thực phẩm trong quy trình chế biến là rất quan trọng để đảm bảo chất lượng sản phẩm. Các sản phẩm từ cua lột cần được kiểm tra chất lượng định kỳ để đảm bảo không có chất độc hại và đáp ứng các tiêu chuẩn dinh dưỡng. Sự phát triển của công nghệ chế biến hiện đại sẽ giúp nâng cao chất lượng sản phẩm, từ đó tạo ra các sản phẩm an toàn và có giá trị dinh dưỡng cao cho người tiêu dùng.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ hóa học với đề tài "Nghiên cứu thành phần hóa học và xây dựng quy trình chế biến sản phẩm có tác dụng tăng cường sức khỏe từ cua lột (Scylla)" được nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Phương Lan thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Nguyễn Quyết Chiến và TS. Lê Tất Thành tại Học viện Khoa học và Công nghệ thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (bảo vệ năm 2021). Luận án thuộc chuyên ngành Kỹ thuật Hóa học, mã số 9.01.

Ở nước ta, cua bùn thuộc chi Scylla là đối tượng nuôi thủy sản truyền thống tại vùng nước mặn và lợ, mang lại giá trị kinh tế lớn cho cộng đồng ngư dân ven biển. Sự phát triển của kỹ thuật nuôi thương phẩm đã thúc đẩy nghề nuôi cua lột (cua vỏ mềm). So với cua thịt thông thường, cua lột có giá trị kinh tế cao gấp 3 lần và gấp 2 lần so với cua gạch. Tuy nhiên, sản phẩm cua lột ở Việt Nam chủ yếu chỉ dừng lại ở khâu sơ chế, đóng gói, cấp đông phục vụ tiêu dùng nội địa hoặc xuất khẩu dưới dạng thực phẩm tươi sống cho nhà hàng chế biến các món ăn nguyên con (như chiên bơ, chiên xù, ram me, bọc dừa, xào chua ngọt). Ngoài ra, trong kỹ thuật nuôi cua lột cải tiến (sử dụng thức ăn tổng hợp, nuôi rọ nhựa trong bể tuần hoàn), có tới khoảng 30% cua bị rụng chân và càng, dẫn đến giá trị thương mại suy giảm nghiêm trọng dù hàm lượng dinh dưỡng không thay đổi. Trước thời điểm nghiên cứu, chưa có công trình nào trong nước công bố về việc chế biến cua lột thành sản phẩm giá trị gia tăng hoặc thực phẩm chức năng bảo vệ sức khỏe bằng công nghệ enzym sạch.

Luận án xác định 3 mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

1. Nghiên cứu xác định được thành phần hóa học, hoạt tính sinh học của cua lột.
2. Xây dựng và tối ưu hóa quy trình công nghệ thủy phân cua lột bằng enzym, sấy phun để tạo sản phẩm bột cua lột thủy phân có tác dụng tăng cường sức khỏe.
3. Đánh giá hoạt tính của sản phẩm thủy phân cua lột và chế phẩm bảo vệ sức khỏe từ bột cua lột thủy phân.

Đối tượng nghiên cứu là loài cua bùn Scylla paramamosain ở giai đoạn lột xác, trọng lượng 100–120 g/con, chiều rộng mai 80–90 mm, cơ thể căng phồng mềm hoàn toàn, đạt chuẩn cảm quan và mùi vị đặc trưng, do TS. Nguyễn Thị Bích Ngọc (Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản III) giám định tên khoa học. Cua được nuôi từ cỡ giống 50–60 g/con trong 30 ngày tại hệ thống tuần hoàn lọc sinh học (pH 7,6–7,7; DO 6–6,8 mg/l; NH3/NH4+ từ 0,004–0,008 mg/l; NO2- từ 0,012–0,014 mg/l), sử dụng thức ăn công nghiệp bổ sung 2% dịch cá thủy phân, 0,2% chitosan (50 kDa), enzym protease và amylase (1,5 U/100 mg thức ăn) cùng 0,1% cholesterol. Mẫu sau thu hoạch được cấp đông và vận chuyển ra Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên (Hà Nội). Luận án được thực hiện trong giai đoạn đến năm 2021 với sự phối hợp phân tích từ Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia và Cục An toàn thực phẩm.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án tổng quan hệ thống phân loại học chi Scylla. Ban đầu chi này chỉ ghi nhận loài S. serrata (Forskal, 1775). Năm 1949, Estampador phân lập 3 loài và 1 thứ tại Philippines. Năm 1952, Serene nghiên cứu mẫu vật tại miền Nam Việt Nam và phân thành 4 loài. Đến năm 1998, Keenan và cộng sự đã chuẩn hóa phân loại chi Scylla thành 4 loài thông qua điện di allozym, giải trình tự ADN ti thể và hình thái học: Scylla serrata, Scylla tranquebarica, Scylla paramamosain và Scylla olivacea. Tại Việt Nam, Clive P. Keenan xác định cua xanh vùng cửa sông Mê Kông là S. paramamosain; kết quả khảo sát của Nguyễn Cơ Thạch cho thấy S. paramamosain chiếm trên 90% trong tổng số 3.000 mẫu cua bùn thu thập tại miền Trung.

Tên loài	Đặc điểm gai thùy trán	Đặc điểm gai cổ chân và cẳng chân	Hoa văn đa giác
Scylla serrata	Gai cao, nhọn	Các cặp gai lớn rõ ràng trên cổ chân và cẳng chân	Xuất hiện rõ ràng trên tất cả các phần phụ
Scylla tranquebarica	Gai vừa phải, không nhọn	Các cặp gai lớn rõ ràng trên cổ chân và cẳng chân	Xuất hiện ở hai cặp chân cuối, mờ hoặc không có ở phần khác
Scylla paramamosain	Hình tam giác, cao vừa phải	Đôi gai lớn rõ trên cổ chân; cẳng chân không có gai trong, ít gai ngoài	Xuất hiện trên hai cặp chân cuối, mờ hoặc không có ở phần khác
Scylla olivacea	Gai thấp và tròn	Cặp gai giảm rõ rệt trên cổ chân; cẳng chân không gai trong, ít gai ngoài	Không xuất hiện trên các phần phụ

Về thành phần hóa học cua biển, tác giả điểm lại các công trình tiêu biểu: Spindler (1986) nghiên cứu nồng độ ecdysteroid ở ấu trùng cua nhện Hyas aruneus L. (zoea I: 93 pg, zoea II: 137 pg, megalopa: 16,5 pg; ecdysteroid chính là 20-hydroxyecdysone). MacPherson (1998) xác định 26 axit béo và 6 dạng phospholipid trên cua móng ngựa Limulus polyphemus, trong đó phosphatidylethanolamine (PE) chiếm 42,2% và phosphatidylcholine (PC) chiếm 36,3%. Mehmet (2004) phân tích axit béo trên Charybdis cruciate và Potamon potamon, ghi nhận axit arachidonic (20:4 n-6) đạt cao nhất trong gan tụy. Vilasoa-Martinez (2007) phân tích mai và thịt cua tuyết Chionoecetes opilio, xác định hàm lượng protein đạt 35,5 và 33,0 g/100g mẫu khô với arginin và lysin chiếm ưu thế. Wu và cộng sự (2010) khảo sát Portunus pelagicus, ghi nhận axit béo không no ở thịt đạt 36–39%, cao hơn gan tụy (16–18%). Sakthivel (2014) tìm thấy canxi (209,3 mg/100g), kali (115,3 mg/100g) và vitamin A (19,64 mg/100g) ở Sesarma brockii. Ke-Ji Jiang (2014) khảo sát S. paramamosain, P. trituberculatus, E. sinensis, ghi nhận axit amin thịt chiếm 72% khối lượng khô. Ramamoorthy (2016) công bố protein của Charybdis lucifera đạt 22,57%.

Đối với chi Scylla, Alava (2007) ghi nhận lipid buồng trứng S. serrata tăng từ 82,7 lên 337,8 mg/g ở cua tự nhiên và 118,2 lên 450,2 mg/g ở cua nuôi lồng trong quá trình thành thục. Anas (2009) xác định lipid tổng của S. serrata hoang dã là 0,65% và cua nuôi là 0,56%. Mohapatra (2009) chứng minh khoáng K, Ca, Mn, Cu tái hấp thu từ mai vào thịt trong quá trình lột xác, trong khi kim loại độc Pb bị giữ lại ở mai cứng. Sarower (2013) phân tích S. serrata ở Bangladesh, xác định protein trứng cua cái đạt 43,38%. Fantong Meng (2017) khảo sát S. paramamosain tại Hải Nam, ghi nhận protein trong bộ phận sinh dục đạt 33,10–35,53% và thịt càng đạt 17,80–21,66%.

Về hoạt tính sinh học, tác giả điểm lại hệ enzym chống oxy hóa (SOD, CAT, GR, GPx) cùng các phân tử nhỏ (glutathione, acid ascorbic, acid uric, carotenoid, chitosan). Các peptide kháng khuẩn (AMP) được ghi nhận gồm Scygonadin (Imjongjirak, 2009), SSAP (Yedery và Reddy, 2009), ALF và crustin (Sun, 2015), Ab-Hcy (Velayutham và Munusamy, 2016). Về độc tính tế bào, Rethna Priya (2013) ghi nhận dịch chiết lipid cua P. vigil, P. sanguinolentus, C. feriatus ức chế 5 dòng tế bào ung thư với IC50 từ 75–100 µg/ml. Hoạt tính kháng khuẩn của lipid biển được Pravat M. (2013) kiểm chứng trên hải miên Fasciospongia cavernosa (MIC 25 µg). Oshima và Segawa chỉ ra khả năng chống oxy hóa hiệp đồng giữa phospholipid (PE, PC) và tocopherol.

Về công nghệ enzym, Sara A. thủy phân phụ phẩm cua xanh Callinectes sapidus bằng alcalase 750L và bromelain. Tại Việt Nam, Nguyễn Thị Mỹ Hương (2013) dùng Protamex thủy phân đầu cá ngừ vây vàng và phối hợp Protamex với Flavourzyme thủy phân sò lông; Trần Thị Bích Thủy (2016) thủy phân cá trích bằng Protamex đạt độ thủy phân 70,87%; Vũ Ngọc Bội (2015) dùng alcalase và bromelain thủy phân moi biển thu dịch đạm 24,73 gN/l; Lý Thị Minh Phương (2008) dùng allzyme FD thủy phân hàu biển.

Khoảng trống được luận án lựa chọn giải quyết là: Chưa có nghiên cứu toàn diện nào về thành phần hóa học chi tiết (nhất là các dạng phân tử phospholipid phân cực bằng khối phổ phân giải cao), biến động ecdysone - cholesterol trong chu kỳ lột xác của S. paramamosain tại Việt Nam; chưa có quy trình công nghệ kết hợp enzym protease (bromelain) và chitinase để thủy phân hoàn toàn nguyên con cua lột; chưa áp dụng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) để tối ưu hóa đồng thời quá trình thủy phân và sấy phun; chưa đánh giá hoạt tính chống loãng xương in vitro trên dòng tế bào MC3T3-E1 của sản phẩm bột thủy phân để ứng dụng sản xuất thực phẩm chức năng dạng bột dinh dưỡng và viên nén.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án dựa trên cơ sở lý thuyết về phản ứng thủy phân protein bằng enzym theo phương trình động học xúc tác: $$\text{E} + \text{S} \rightleftharpoons \text{ES} \rightarrow \text{P} + \text{E}$$ trong đó E là enzym, S là cơ chất, ES là phức hợp enzym - cơ chất và P là sản phẩm phân giải (polypeptid, oligopeptid, axit amin). Độ thủy phân (Degree of Hydrolysis - DH) được xác định theo phương pháp đo nhóm $\alpha$-amino bậc 1 tự do bằng thuốc thử ortho-phthalic aldehyde (OPA) với chất chuẩn L-glutathion: $$\text{DH} = \left(\frac{h}{h_{tot}}\right) \times 100%$$ với $h$ là số mol nhóm $\alpha$-amino giải phóng trên 1 kg protein và $h_{tot}$ là số mol nhóm $\alpha$-amino tối đa khi thủy phân hoàn toàn cơ chất.

Cơ sở tối ưu hóa quy trình dựa trên lý thuyết quy hoạch thực nghiệm theo Phương pháp Bề mặt Đáp ứng (Response Surface Methodology - RSM) với các mô hình Box-Wilson, Box-Hunter hoặc Box-Behnken, xử lý thống kê bằng phần mềm Design Expert 12.0 của hãng Stat-Ease. Mô hình toán học hồi quy bậc 2 được đánh giá thông qua phân tích phương sai ANOVA, hệ số tương quan và kiểm chứng thực nghiệm.

Hệ thống phương pháp phân tích thành phần hóa học bao gồm:

• Độ ẩm xác định theo TCVN 3700-90; tro toàn phần theo TCVN 5105:2009; protein tổng số xác định bằng phương pháp Kjeldahl theo TCVN 3705:1990.
• Thành phần axit amin được định lượng bằng hệ thống HPLC Agilent 1200, cột tách ZORBAX Eclipse-AAA, tạo dẫn xuất tự động với OPA và FMOC-Cl qua bộ lấy mẫu G1329B, phát hiện bằng đầu dò huỳnh quang FLD G1315B.
• Hàm lượng lipid tổng xác định theo phương pháp trích ly Bligh & Dyer cải tiến có hỗ trợ siêu âm. Các lớp chất lipid được phân tách bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) và định lượng mật độ quang trên máy Sorbfil TLC Videodensitometer (LB Nga) theo Imbs A.
• Thành phần axit béo được chuyển thành dạng methyl ester (FAME) bằng tác nhân H2SO4/MeOH 2% theo Carreau & Dubacq (1978) và phân tích trên GC/GC-MS theo tiêu chuẩn ISO/FDIS 5590:1998.
• Các dạng phân tử lipid phân cực và phospholipid được xác định bằng hệ thống HPLC ghép khối phổ phân giải cao (HPLC-HRMS) theo phương pháp của Imbs (2015) và Sikorskaya (2018).
• Khoáng đa lượng và vi lượng (Ca, Mg, Na, K, P, Fe, Zn) phân tích bằng quang phổ phát xạ plasma cảm ứng ICP-OES theo AOAC 2011.14; Cu và Mn phân tích theo AOAC 2015.01.
• Vitamin A, D, E phân tích bằng LC-MS/MS theo AOAC 992.06; vitamin K theo TCVN 8974:2011; vitamin B2, B3 theo AOAC 2015.
• Cholesterol định lượng theo TCVN 12385:2018 và phương pháp của Maria A. Hormon ecdysone phân tích bằng HPLC theo quy trình của Soumoff (1985) và Lafont R. (1994).

Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học:

• Hoạt tính kháng viêm in vitro: Đánh giá khả năng ức chế sản sinh oxit nitric (NO) trên dòng tế bào đại thực bào RAW 264.7 bị kích hoạt bởi lipopolysaccharide (LPS) theo phương pháp của Liao H.
• Hoạt tính chống oxy hóa: Xác định mức độ ức chế peroxy hóa lipid thông qua định lượng malondialdehyde (MDA assay) theo Jelili A.
• Độc tính tế bào: Đánh giá trên các dòng tế bào ung thư (HepG-2, HL-60, HT-29, LU-1, MCF-7, SK-Mel 2, SW-480, LNCaP) bằng phương pháp đo độ hấp thụ MTT hoặc nhuộm protein Sulforhodamine B (SRB).
• Hoạt tính chống loãng xương in vitro: Thử nghiệm trên dòng tế bào tiền nguyên bào xương MC3T3-E1 theo Alcantara E., đo 3 chỉ số đặc trưng: hoạt độ enzym alkaline phosphatase (ALP), mức độ tổng hợp collagen ngoại bào và khả năng khoáng hóa (lắng đọng khoáng).

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan về cua Scylla spp.

Chương 1 tổng thuật các đặc điểm sinh học, phân loại, kỹ thuật nuôi và các công bố hóa học - sinh học về chi cua bùn Scylla. Cua bùn trải qua 3 giai đoạn chính trong chu kỳ lột xác: tiền lột xác (premolt), giữa chu kỳ (intermolt) và sau lột xác (postmolt). Chu kỳ này chịu sự điều hòa chặt chẽ của hormon nội sinh (ecdysone) và các yếu tố môi trường. Tại Thái Lan, tỉnh Ranong đã chuyển đổi từ kỹ thuật cắt chân (tỷ lệ chết 50%) sang nuôi cua trong từng rổ riêng biệt (tỷ lệ chết giảm còn 20–30%), đạt sản lượng 150–200 tấn cua lột/tháng. Tại Việt Nam, nghiên cứu của Nguyễn Thị Bích Ngọc (2016) trên hệ thống nước chảy tuần hoàn đạt tỷ lệ lột trên 90%, năng suất 200–300 kg/100 m2/tháng với chu kỳ nuôi 25–35 ngày.

Chương này cũng phân tích tổng quan các công bố quốc tế về hàm lượng protein, lipid, axit béo không no cao phân tử (EPA, DHA, AA), các enzym chống oxy hóa, các peptit kháng khuẩn (AMP) của cua biển; đồng thời làm rõ cơ sở lý thuyết của công nghệ thủy phân protein bằng enzym protease, động học phản ứng, các yếu tố ảnh hưởng (nhiệt độ, pH, tỷ lệ E/S, thời gian) và ứng dụng phương pháp bề mặt đáp ứng RSM cùng phần mềm Design Expert 12.0 trong tối ưu hóa các quá trình công nghệ.

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết nguồn nguyên liệu cua lột Scylla paramamosain thu thập từ mô hình nuôi tuần hoàn kiểm soát nghiêm ngặt. Cua nguyên liệu được xử lý sơ chế: rửa sạch, làm ngất nhiệt, tách bỏ mang, phân chia các phần mẫu phục vụ phân tích hóa học và công nghệ chế biến.

Chương này xây dựng toàn bộ quy trình thực nghiệm: thiết lập đường chuẩn L-glutathion xác định độ thủy phân DH qua OPA; quy trình chiết tách và dẫn xuất hóa FAME cho GC/GC-MS; điều kiện sắc ký lỏng HPLC-HRMS trên cột Diol để phân tách các phân lớp lipid phân cực; các tiêu chuẩn quốc gia và quốc tế (TCVN, AOAC, ISO) cho phân tích ẩm, tro, protein, khoáng chất và vitamin. Đồng thời, chương 2 thiết lập quy trình bố trí thí nghiệm đơn yếu tố và quy hoạch RSM (Box-Behnken) cho hai công đoạn công nghệ cốt lõi: thủy phân bằng tổ hợp enzym (bromelain và chitinase) và sấy phun tạo bột; cuối cùng là giao thức nuôi cấy và thử nghiệm sinh học in vitro trên tế bào RAW 264.7, MC3T3-E1 cùng các dòng tế bào ung thư.

Kết quả và thảo luận

Kết quả nghiên cứu của luận án được trình bày tập trung trong 6 phân đoạn chính từ mục 4.1 đến mục 4.6:

1. Thành phần hóa học của cua lột Scylla paramamosain

Phân tích thành phần cơ bản của cua lột cho thấy hàm lượng protein và khoáng chất chiếm tỷ lệ cao trong chất khô. Cua lột chứa đầy đủ các vitamin thiết yếu (A, D, E, K, B2, B3) và các khoáng chất đa lượng, vi lượng gồm Ca, Mg, P, Na, K, Fe, Zn, Cu, Mn (Bảng 4.1, 4.2, 4.3). Mai mềm sau lột xác tích lũy lượng canxi và phospho hữu cơ dễ tiêu hóa.

Phân tích axit amin (Bảng 4.4) xác định được các axit amin thiết yếu (EAA) và không thiết yếu (NEAA), trong đó các axit amin tạo vị ngọt và hương vị đậm đà (axit glutamic, axit aspartic, arginin, alanin, glycin, leucin, lysin) chiếm tỷ trọng lớn.

Phân tích lipid tổng (Bảng 4.5, 4.6) ghi nhận sự có mặt của lipid không phân cực (NL) và lipid phân cực (Pol). Thành phần axit béo gồm các axit béo no (SFA như 16:0, 18:0), axit béo không no một nối đôi (MUFA như 18:1n-9) và axit béo không no đa nối đôi (PUFA/HUFA) có giá trị sinh học cao như axit arachidonic (AA, 20:4n-6), axit eicosapentaenoic (EPA, 20:5n-3) và axit docosahexaenoic (DHA, 22:6n-3).

Bằng kỹ thuật HPLC-HRMS, tác giả lần đầu tiên làm rõ các phân lớp phospholipid phân cực và xác định chính xác công thức phân tử, cấu trúc phân mảnh của từng dạng phân tử (Bảng 4.7–4.12, Hình 4.2–4.8):

• Phosphatidylethanolamine: xác định PE 38:5 [C43H76NO7P], PE 38:6 [C43H74NO8P].
• Phosphatidylcholine: xác định PC 34:1 [C42H82NO8P].
• Phosphatidylserine: xác định PS 38:5 [C44H76NO10P].
• Phosphatidylinositol: xác định PI 38:5 [C47H81O13P].
• Các dạng lyso-phospholipid: LPE 20:5 [C25H42NO7P] và LPC 20:5 [C28H48NO7P].

Luận án làm sáng tỏ quy luật biến động tương quan giữa hàm lượng cholesterol và hormon ecdysone trong các pha của chu kỳ lột xác cua bùn (Bảng 4.13, Hình 4.9, 4.10).

2. Hoạt tính sinh học của các lớp chất lipid

Các phân đoạn lipid từ cua lột thể hiện các hoạt tính sinh học rõ rệt:

• Kháng viêm: Ức chế phụ thuộc nồng độ sự sản sinh NO trên tế bào RAW 264.7 kích thích bằng LPS (Bảng 4.14).
• Chống oxy hóa: Ức chế mạnh quá trình peroxy hóa lipid màng thông qua thử nghiệm định lượng malondialdehyde (MDA) (Bảng 4.15).
• Độc tính tế bào ung thư: Khảo sát trên 5 dòng tế bào ung thư (HepG-2, HL-60, HT-29, LU-1, MCF-7) cho thấy phân đoạn lipid thể hiện khả năng ức chế sinh trưởng tế bào ở các mức độ khác nhau (Bảng 4.16).

3. Xây dựng và tối ưu hóa quy trình thủy phân cua lột bằng enzym

Luận án lựa chọn tổ hợp enzym protease thực vật (bromelain) kết hợp chitinase để phân giải đồng thời khối cơ thịt và lớp vỏ mai mềm chitin mỏng. Khảo sát đơn yếu tố xác định khoảng ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, tỷ lệ nước/nguyên liệu, nồng độ bromelain, nồng độ chitinase và thời gian phản ứng đến độ thủy phân DH và hàm lượng peptid hòa tan (Hình 4.11–4.17).

Sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng RSM trên phần mềm Design Expert 12.0 (Bảng 4.18–4.21, Hình 4.18–4.20), tác giả thiết lập ma trận thực nghiệm, phân tích phương sai ANOVA khẳng định độ tin cậy của mô hình hồi quy bậc 2 và xác định bộ thông số công nghệ tối ưu cho quá trình thủy phân. Kết quả thực nghiệm kiểm chứng tại điều kiện tối ưu hoàn toàn phù hợp với giá trị dự đoán lý thuyết (Bảng 4.22). Phân tích khoáng chất của mai và vỏ mềm trước và sau thủy phân (Bảng 4.17) chứng minh khoáng canxi và phospho được chuyển giao hiệu quả vào dịch đạm thủy phân.

4. Xây dựng và tối ưu hóa quy trình sấy phun sản phẩm thủy phân

Để làm khô dịch thủy phân mà vẫn bảo toàn dinh dưỡng và hoạt tính sinh học, công nghệ sấy phun ly tâm được áp dụng. Tác giả khảo sát ảnh hưởng của 3 biến công nghệ: tốc độ đĩa phun, nhiệt độ không khí sấy đầu vào và tốc độ bơm nạp dịch đến hai hàm mục tiêu là hàm lượng protein tổng (Y1) và độ ẩm sản phẩm bột (Y2) (Bảng 4.23, 4.26, 4.27).

Ứng dụng mô hình tối ưu hóa RSM đa mục tiêu (Bảng 4.24, 4.25, 4.28, 4.29, Hình 4.21–4.23) đã xác định được chế độ sấy phun tối ưu, giúp thu nhận bột cua lột thủy phân có độ ẩm đạt chuẩn bảo quản thấp, hàm lượng protein hòa tan cao và màu sắc cảm quan đồng đều (Bảng 4.30).

5. Sản xuất bột cua lột thủy phân ở quy mô pilot

Luận án hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất bột cua lột thủy phân ở quy mô pilot (Hình 4.24). Sản phẩm bột thu được có hàm lượng axit amin toàn phần cân đối (Bảng 4.31) và giàu khoáng canxi, magie, phospho sinh học (Bảng 4.32).

Thử nghiệm hoạt tính chống loãng xương in vitro trên dòng tế bào tiền nguyên bào xương MC3T3-E1 (Bảng 4.33–4.36) chứng minh:

• Bột thủy phân không gây độc và thúc đẩy sự phát triển của tế bào MC3T3-E1.
• Kích thích gia tăng rõ rệt hoạt độ enzym alkaline phosphatase (ALP).
• Tăng cường sinh tổng hợp mạng lưới collagen ngoại bào.
• Gia tăng đáng kể mật độ lắng đọng khoáng (tạo mầm khoáng hóa xương).

6. Bào chế sản phẩm có tác dụng tăng cường sức khỏe

Từ bột cua lột thủy phân giàu dinh dưỡng và có hoạt tính chống loãng xương, luận án xây dựng công thức và quy trình bào chế 2 dòng sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe:

• Sản phẩm bột dinh dưỡng "Forté Kid": Dùng hỗ trợ chống còi xương ở trẻ em. Tác giả khảo sát tỷ lệ phối trộn các thành phần bột dinh dưỡng đạt chỉ tiêu cảm quan tối ưu (Bảng 4.37), xây dựng quy trình bào chế (Hình 4.25) và tiêu chuẩn cơ sở kiểm tra chất lượng (Bảng 4.38).
• Sản phẩm viên "Boness": Hỗ trợ chống loãng xương cho người lớn tuổi. Tác giả khảo sát lựa chọn tá dược độn, tá dược dính, tá dược trơn phù hợp (Bảng 4.39), hoàn thiện quy trình bào chế dạng viên (Hình 4.27) và công bố tiêu chuẩn chất lượng thành phẩm (Bảng 4.40).

Kết quả và những đóng góp mới

Luận án của NCS. Nguyễn Thị Phương Lan mang lại các đóng góp mới về mặt khoa học lý luận và thực tiễn công nghệ:

Về lý luận và khoa học cơ bản:

• Cung cấp bộ dữ liệu khoa học đầy đủ, có hệ thống đầu tiên tại Việt Nam về thành phần hóa học cơ bản, khoáng chất vi lượng, axit amin, axit béo không no (EPA, DHA, AA) và các nhóm vitamin của cua bùn Scylla paramamosain ở giai đoạn lột xác.
• Lần đầu tiên phân lập và nhận dạng cấu trúc phân tử chính xác của 6 phân lớp phospholipid phân cực (PE, PC, PS, PI, LPE, LPC) từ cua lột bằng phương pháp HPLC-HRMS hiện đại.
• Phát hiện quy luật biến động hàm lượng và mối tương quan giữa cholesterol và ecdysone trong chu kỳ lột xác của cua bùn Scylla paramamosain.
• Cung cấp bằng chứng thực nghiệm in vitro chứng minh dịch chiết lipid có hoạt tính kháng viêm (ức chế NO trên RAW 264.7), ức chế peroxy hóa lipid (MDA) và gây độc tế bào ung thư; bột đạm thủy phân có hoạt tính kích thích tế bào tiền nguyên bào xương MC3T3-E1 thông qua kích hoạt ALP, tổng hợp collagen và khoáng hóa.

Về công nghệ và thực tiễn ứng dụng:

• Xây dựng thành công quy trình công nghệ thủy phân cua lột bằng tổ hợp enzym protease (bromelain) và chitinase, phân giải triệt để cả phần thịt và vỏ mai mềm chitin mỏng.
• Tối ưu hóa thành công các thông số công nghệ của hai quá trình thủy phân enzym và sấy phun bằng phương pháp bề mặt đáp ứng RSM (phần mềm Design Expert 12.0).
• Thiết lập quy trình sản xuất bột cua lột thủy phân ở quy mô pilot ổn định, kiểm soát được các chỉ tiêu dinh dưỡng và an toàn vệ sinh thực phẩm.
• Bào chế thành công 2 sản phẩm thực phẩm chức năng bảo vệ sức khỏe có tính khả thi thương mại cao: bột dinh dưỡng "Forté Kid" hỗ trợ phòng chống còi xương ở trẻ em và viên "Boness" hỗ trợ phòng ngừa loãng xương ở người cao tuổi.

Kiến nghị từ luận án:

• Cần tiếp tục nghiên cứu thử nghiệm tiền lâm sàng (in vivo trên mô hình động vật thực nghiệm) và thử nghiệm lâm sàng trên người đối với hai chế phẩm Forté Kid và Boness để củng cố đầy đủ hồ sơ y dược học.
• Đề xuất chuyển giao quy trình công nghệ sấy phun và thủy phân enzym quy mô pilot cho các cơ sở công nghiệp chế biến thực phẩm nhằm đa dạng hóa sản phẩm giá trị gia tăng từ ngành nuôi cua lột trong nước.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Về mặt hạn chế:

• Các đánh giá hoạt tính sinh học (chống loãng xương, kháng viêm, chống peroxy hóa lipid và độc tính tế bào ung thư) trong luận án hoàn toàn thực hiện ở mức độ in vitro trên các dòng tế bào nuôi cấy mô, chưa triển khai đánh giá in vivo trên động vật sống.
• Quy mô sản xuất thực nghiệm mới dừng lại ở mức pilot trong phòng thí nghiệm và xưởng thực nghiệm bán công nghiệp, chưa tiến hành sản xuất liên tục ở quy mô đại trà công nghiệp.
• Mẫu cua nghiên cứu tập trung duy nhất vào loài Scylla paramamosain thu thập từ mô hình nuôi tuần hoàn kiểm soát tại miền Trung, chưa so sánh mở rộng với các loài cua bùn khác (S. serrata, S. olivacea, S. tranquebarica) hoặc các vùng sinh thái tự nhiên khác nhau.

Hướng nghiên cứu tiếp theo:

• Tiến hành các thử nghiệm in vivo đánh giá khả năng cải thiện mật độ xương trên mô hình chuột bị gây loãng xương (cắt buồng trứng) hoặc chuột còi xương.
• Hoàn thiện hồ sơ tiêu chuẩn cơ sở, đánh giá độ ổn định và thời hạn bảo quản (hạn dùng) dài hạn của hai sản phẩm Forté Kid và Boness theo quy định của Bộ Y tế để phục vụ cấp phép lưu hành.
• Nghiên cứu mở rộng việc ứng dụng tổ hợp enzym bromelain - chitinase trên các phụ phẩm giáp xác lột vỏ khác.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo có giá trị chuyên môn cao cho nhiều nhóm đối tượng:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên các ngành Kỹ thuật Hóa học, Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Công nghệ Thực phẩm, Công nghệ Sinh học và Nuôi trồng Thủy sản có thể tham khảo phương pháp luận quy hoạch thực nghiệm RSM, cách thức phân tích định lượng phân lớp phospholipid bằng HPLC-HRMS và quy trình thử nghiệm tế bào MC3T3-E1.
• Giảng viên và cán bộ nghiên cứu tại các trường đại học, viện nghiên cứu chuyên ngành có thể sử dụng các số liệu về thành phần axit amin, axit béo, khoáng chất của cua lột làm dẫn liệu giảng dạy và so sánh học thuật.
• Các doanh nghiệp chế biến thủy sản và sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe có thể kế thừa quy trình thủy phân bằng enzym bromelain - chitinase và kỹ thuật sấy phun quy mô pilot để ứng dụng chế biến các sản phẩm giá trị gia tăng, giải quyết bài toán tiêu thụ cua lột loại 2 (cua rụng càng, rụng chân).
• Người làm chính sách và quản lý ngành thủy sản ven biển có cơ sở khoa học để định hướng quy hoạch, khuyến khích phát triển nghề nuôi cua lột tuần hoàn bền vững gắn liền với chuỗi chế biến sâu.

Câu hỏi thường gặp

1. Vì sao luận án lại sử dụng tổ hợp enzym bromelain và chitinase thay vì chỉ dùng một loại protease thông thường để thủy phân cua lột?
Cua lột tuy đã rụng lớp vỏ mai cứng nhưng toàn bộ cơ thể vẫn được bao bọc bởi một lớp vỏ mềm mỏng cấu tạo từ mạng lưới polyme chitin liên kết với protein và khoáng chất. Nếu chỉ sử dụng protease (như bromelain), enzym chỉ phân giải được các mô cơ thịt mà không thể phá vỡ hoàn toàn lớp màng chitin, dẫn đến hiệu suất thu hồi đạm và khoáng bị hạn chế. Việc phối hợp bromelain (protease) với chitinase giúp phân cắt đồng thời liên kết peptide của protein và liên kết $\beta$-1,4-glycoside của chitin, giải phóng tối đa các axit amin, peptid hòa tan cùng các khoáng chất canxi, phospho vào dịch đạm thủy phân.

2. Kỹ thuật nào đã được tác giả sử dụng để nhận dạng chính xác từng phân tử phospholipid trong cua lột?
Tác giả đã sử dụng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ phân giải cao (HPLC-HRMS) trên cột Diol. Phương pháp này cho phép phân tách các phân lớp lipid phân cực (PE, PC, PS, PI, LPE, LPC) và dựa vào các tín hiệu phổ khối ion hóa phun mù điện tử (ESI) cùng dữ liệu phân mảnh ion để xác định chính xác công thức phân tử, chiều dài chuỗi carbon và số lượng liên kết đôi của từng gốc axit béo gắn trên khung glycerol (ví dụ PE 38:5, PC 34:1, LPC 20:5).

3. Khả năng chống loãng xương của bột cua lột thủy phân được chứng minh thông qua các chỉ tiêu sinh học nào?
Hoạt tính chống loãng xương được đánh giá in vitro trên dòng tế bào tiền nguyên bào xương MC3T3-E1 qua 3 chỉ tiêu:

• Khả năng kích thích sinh tổng hợp enzym alkaline phosphatase (ALP) – dấu ấn sinh học của giai đoạn đầu biệt hóa nguyên bào xương.
• Mức độ kích thích tăng sinh tổng hợp mạng lưới collagen ngoại bào – khung chất nền protein của mô xương.
• Mức độ thúc đẩy lắng đọng khoáng (khoáng hóa xương) – giai đoạn hoàn thiện tạo khuôn xương cứng chắc.

4. Luận án đã bào chế thành công những dạng sản phẩm nào và hướng đến các đối tượng người dùng nào?
Luận án đã xây dựng công thức và quy trình bào chế cho 2 sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe:

• Sản phẩm "Forté Kid": Dạng bột dinh dưỡng hòa tan, công thức phối trộn cân đối giàu canxi, phospho, đạm peptid và axit amin, hướng đến đối tượng trẻ em bị còi xương, suy dinh dưỡng hoặc đang trong giai đoạn phát triển chiều cao.
• Sản phẩm "Boness": Dạng viên nén/nang chứa bột cua lột thủy phân phối hợp các tá dược chuẩn hóa, hướng đến đối tượng người cao tuổi, phụ nữ tiền mãn kinh cần phòng ngừa và hỗ trợ điều trị bệnh loãng xương, thoái hóa xương khớp.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của NCS. Nguyễn Thị Phương Lan đã giải quyết một cách toàn diện và có hệ thống từ nghiên cứu cơ bản về thành phần hóa học, đặc điểm phân tử phospholipid và hoạt tính sinh học của cua bùn Scylla paramamosain giai đoạn lột xác đến nghiên cứu công nghệ chế biến sâu. Bằng việc kết hợp tổ hợp enzym bromelain - chitinase và tối ưu hóa hai công đoạn thủy phân - sấy phun qua phương pháp bề mặt đáp ứng RSM, công trình đã làm chủ quy trình sản xuất bột cua lột thủy phân giàu dinh dưỡng ở quy mô pilot. Hoạt tính chống loãng xương trên tế bào MC3T3-E1 cùng hai sản phẩm thành phẩm Forté Kid và Boness là minh chứng rõ nét cho định hướng chuyển giao khoa học công nghệ, nâng cao giá trị chuỗi sản xuất cua lột tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Ở nước ta, cua bùn (Scylla spp.) là một Ďối tượng nuôi thủy sản nước mặn-lợ truyền thống, có giá trị kinh tế-xã hội quan trọng trong cộng Ďồng ngư dân ven biển và là nguồn thực phẩm ưa thích của số Ďông người Việt. Nghề nuôi cua bùn thương phẩm phát triển kéo theo sự phát triển của nghề nuôi cua lột Ďã làm tăng lên giá trị kinh tế của Ďối tượng này và làm Ďa dạng hơn nghề nuôi thủy sản. Nuôi cua lột cũng là một nghề truyền thống mà sản phẩm là những con cua vỏ mềm (Ďược gọi là cua lột), sau khi Ďã lột bỏ lớp vỏ cứng thay bằng lớp màng chitin mềm mại bao bọc cơ thể. Cho Ďến nay, sản phẩm cua lột chỉ Ďược sử dụng như một thực phẩm “ăn liền”, nghĩa là chỉ dừng ở việc sơ chế, Ďóng gói, bảo quản cấp Ďông rồi tiêu thụ nội Ďịa hoặc xuất khẩu Ďể làm nguyên liệu cho các nhà hàng chế biến ra hàng loạt các món ăn.

Các nghiên cứu về thành phần hóa học, hoạt tính sinh học của cua lột cũng như công nghệ chế biến làm tăng giá trị, bào chế các sản phẩm có chất lượng cao còn rất hạn chế. Trong những năm gần Ďây, người tiêu dùng Việt Nam ngày càng quan tâm nhiều hơn Ďến các thực phẩm chức năng an toàn, có lợi cho sức khỏe. Những minh chứng xác thực về vai trò quan trọng của thực phẩm chức năng trong việc giảm thiểu bệnh và cải thiện sức khỏe Ďã và Ďang là Ďộng lực cộng hưởng thúc Ďẩy công nghệ chế biến trong lĩnh vực này phát triển mạnh mẽ. Trong Ďó, công nghệ enzym Ďược xếp hạng là một trong những công nghệ “xanh-sạch”, giữ vị trí tiên quyết tạo ra các hợp chất có thành phần giàu dinh dưỡng, hoạt tính sinh học cao, bao gồm các protein và peptid, các axit béo không no bão hòa (PUFAs), các probiotic và prebiotic, các chất xơ, các chất khoáng, Ďược sử dụng có Ďịnh hướng trong sản xuất các sản phẩm bảo vệ sức khỏe chất lượng cao.

Những năm qua, nhiều sản phẩm của công nghệ enzym Ďã Ďược sản xuất ở quy mô công nghiệp và Ďược thương mại hóa nhờ vào những ưu Ďiểm nổi trội của xúc tác enzym như tốc Ďộ phản ứng nhanh, có tính chuyên hóa cao, Ďiều kiện phản ứng Ďơn giản, không cần loại bỏ hóa chất dư thừa sau phản ứng ra khỏi sản phẩm cuối cùng và dễ dàng mở rộng quy mô sản xuất. Động vật thủy sản nói chung, các loài cua biển nói riêng là những thực phẩm có mùi vị, giá trị dinh dưỡng và giá trị kinh tế cao, cần Ďược nghiên cứu sâu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học. Với hàm lượng protein cao, chúng có thể Ďược sử dụng như một nguồn nguyên liệu lý tưởng Ďể thu nhận các sản phẩm có hoạt tính sinh học Ďa dạng bằng công nghệ enzym nhằm phục vụ phát triển sản xuất các loại thực phẩm chức năng có giá trị gia tăng. luan an 2 CHƢƠNG I.

Tổng quan về cua Scylla spp. Giới thiệu chung về cua Động vật dạng cua (Cua) hay còn gọi là Phân thứ bộ Cua (danh pháp khoa học: Brachyura) là nhóm các loài Ďộng vật giáp xác, thân rộng hơn bề dài, mười chân có khớp, hai chân trước tiến hóa trở thành hai càng, vỏ xương bọc ngoài thịt, phần bụng nằm bẹp dưới hoàn toàn Ďược che bởi phần ngực, Ďầu cua và thân Ďược nối liền nhau vào một khối có lớp mai bọc bên ngoài. Hiện nay, theo thống kê của Walters và Johnson trên thế giới Ďã phát hiện khoảng gần 6. Tên gọi phổ biến của chúng bằng tiếng Việt khá Ďa dạng như cua, cáy, còng, Ďam, rạm, dã tràng, ghẹ, cà ra,.

Các tên gọi này chỉ Ďơn thuần dựa theo hình thái hoặc môi trường sống của chúng. Cua có nhiều tại tất cả các vùng biển, Ďại dương. Nhiều loài cua lại sống trong sông, suối, Ďồng ruộng, chẳng hạn như các loài trong họ Cua núi (Potamidae), hay họ Cua Ďồng (Parathelphusidae) và một số loài sống trên cạn (họ Gecarcinidae). Cua bùn (mud crabs), hay cua vùng ngập mặn (mangrove crabs), là tên thường gọi của một số loài cua sống trong bùn vùng ngập mặn, bao gồm các loài thuộc chi Scylla và một số loài cua thuộc họ Panopeidae và Xanthidae.

Giới thiệu về chi cua bùn Scylla Chi cua bùn Scylla là một chi (giống) cua biển thuộc họ Cua bơi (Portunidae), Liên họ Portunidae, Phân thứ bộ Brachyura, Phân bộ Pleocyemata, Bộ Decapoda, Lớp Malacostraca, Phân ngành Crustacea, Ngành Arthropoda, và Giới Animalia [2]. Trước Ďây, nhiều tác giả cho rằng giống cua Scylla chỉ có một loài S. serrata (Forskal, 1775) nhưng từ năm 1949, Estampador Ďã dựa trên tập tính Ďào bới bùn Ďất, màu sắc, các Ďặc trưng hình thái và cấu trúc nhiễm sắc thể Ďể công nhận 3 loài và 1 thứ trong chi Scylla có ở Philippines bao gồm: S. Năm 1952, Serene dựa vào mẫu thu Ďược ở miền Nam Việt Nam Ďã tách giống cua Scylla thành 4 loài: S.

cho rằng loài cua bùn ở Vịnh Bắc bộ là loài S. Gần Ďây hơn, các nghiên cứu xác Ďịnh hình thái và allozym (dị enzym) Ďã chỉ ra sự hình luan an 3 thành loài trong phạm vi chi này. Điều này Ďã Ďược xác nhận trong sửa Ďổi phân loại chi Scylla thành 4 loài: S. paramamosain dựa trên Ďiện di allozym, xác lập trình tự ADN ti thể và phân tích hình thái.

Ngoài ra, nghiên cứu này cũng kết luận rằng 4 loài có thể chia tách dựa trên cơ sở các Ďặc trưng hình thái, hình dạng của các răng cửa, sự phân bố gai trên khối xương cổ chân (carpus) và cẳng chân (propodus) của chân kẹp (càng) và màu sắc [4]. Đặc điểm hình thái Theo nhóm tác giả Nguyễn Cơ Thạch [5], cua bùn Scylla spp. có các Ďặc Ďiểm sau: - Màu sắc: mặt lưng cua có màu xanh của lá sú vẹt già hay gần giống với màu xanh bùn (nên còn gọi là cua bùn), mặt bụng có màu vàng trắng xen lẫn chấm xanh Ďen, Ďôi chân bò thứ nhất (Ďôi càng) có kích thước bằng nhau, mặt lưng của càng có màu xanh bùn. - Kích thước và trọng lượng: cua tham gia sinh sản thường có trọng lượng từ 250-600 g tương ứng với chiều rộng giáp Ďầu ngực từ 10-12,5 cm.

- Hình thái và cấu tạo: cơ thể cua dẹp theo hướng lưng bụng, toàn bộ cơ thể Ďược bao bọc trong lớp vỏ chitin dày. Cơ thể cua gồm 2 phần. Phần Ďầu và ngực cua dính liền nhau, ranh giới giữa các Ďốt không rõ ràng, Ďầu gồm 5 Ďốt, ngực có 8 Ďốt. Mé trước của giáp Ďầu ngực chia thành 3 Ďoạn phân cách bởi hai hố mắt, hai Ďoạn mé bên có chiều dài bằng nhau, mỗi bên mé có 9 gai nhọn có kích thước lớn dần theo thứ tự từ hốc mắt, Ďoạn giữa hai hốc mắt có 6 gai nhọn Ďều nhau.

Phần bụng dạng phiến mỏng có 7 Ďốt, gập vào phần giáp Ďầu ngực (yếm cua), chân bụng bị thoái hóa không làm chức năng bơi lội. Ở con Ďực Ďôi chân bụng Ďầu tiên thoái hóa biến thành Ďôi gai giao cấu hình mũi kiếm; riêng Ďối với con cái, chân bụng phân thành hai nhánh có nhiều lông tơ Ďể kết dính trứng sau khi Ďẻ. Keenan mô tả hình thái của 4 loài cua bùn Scylla như sau (Bảng 1.4) [4]: luan an 4 Bảng 1. Đặc Ďiểm hình thái của 4 loài cua bùn Scylla [4] Tên loài Đặc điểm hình thái Gai thuỳ trán cao, nhọn, các cặp gai lớn rõ ràng trên cổ chân S.

serrata và cẳng chân của chân kẹp (càng); hoa văn Ďa giác xuất hiện rõ ràng trên tất cả các phần phụ Gai thùy trán vừa phải, không nhọn; các cặp gai lớn rõ ràng trên cổ chân và cẳng chân của chân kẹp (càng); hoa văn Ďa S. tranquebarica giác xuất hiện ở hai cặp chân cuối cùng, hoa văn này mờ hoặc không có ở các phần phụ khác Gai ở thùy trán hình tam giác, cao vừa phải; Ďôi gai lớn rõ ràng trên cổ chân của càng, trên cẳng chân của chân kẹp S. paramamosain (càng): không có gai phía bên trong, bên ngoài ít gai; hoa (cua xanh, cua sen) văn Ďa giác xuất hiện trên hai cặp chân cuối cùng, hoa văn này mờ hoặc không có ở các phần phụ khác Gai thùy trán thấp và tròn; cặp gai giảm rõ rệt trên cổ chân S. olivacea của càng, trên cẳng chân của chân kẹp (càng): không có gai (cua lửa) phía bên trong và ít gai ở phía ngoài; hoa văn Ďa giác không xuất hiện ở các phần phụ Hình 1.

Cua Scylla serata Hình 1. Cua Scylla tranquebarica luan an 5 Hình 1. Cua Scylla paramamosain Hình 1. Cua Scylla olivacea Đặc tính sinh học Thời kỳ phát triển, phôi Ďược cua mẹ mang và phát triển ở vùng biển ven bờ, ấu trùng nở ra sống phù du ở Ďây.

Cua bột mới nở ra theo thuỷ triều dạt vào vùng nước lợ: những bãi lầy rừng sú vẹt ven bờ biển, cửa sông, nơi có Ďáy bùn, bùn cát hoặc Ďất thịt pha cát mịn giầu mùn bã hữu cơ thuộc vùng trung hạ triều. Cua sinh trưởng ở Ďây cho Ďến lúc thành thục sinh dục thì di cư ra vùng biển gần bờ. Để sinh trưởng và phát triển, cua bùn cũng như tất cả các loài giáp xác khác, khi tích lũy Ďầy Ďủ vật chất và năng lượng Ďều trải qua quá trình lột vỏ Ďể tăng về kích thước. Một chu kỳ lột xác của cua bao gồm 3 giai Ďoạn chính: sau lột xác (postmolt), giữa chu kỳ lột xác (intermolt) và tiền lột xác (premolt).

Chu kỳ lột xác của cua thay Ďổi theo từng thời gian phát triển, càng về sau thời gian giữa 2 lần lột xác càng kéo dài và chịu tác Ďộng tương tác giữa yếu tố nội sinh và ngoại sinh như nhiệt Ďộ, dinh dưỡng, ánh sáng, giới tính và hormon. Phân bố Các Ďại diện của chi Scylla Ďược tìm thấy sinh sống trong khu vực Ấn Độ Dương - Tây Thái Bình Dương, chủ yếu trong khu vực cửa sông hay các khu vực rừng Ďước [8]. Sự phân bố của từng loài cua trong chi Scylla có sự khác biệt (bảng 1. serrata có sự phân bố rộng nhất và là loài duy nhất Ďược ghi nhận ở Tây Ấn luan an 6 Độ Dương, Nhật Bản và các Ďảo trên Thái Bình Dương.

olivacea có sự phân bố tập trung ở biển Đông, trải rộng vào Ấn Độ Dương và Tây Thái Bình Dương, trong khi loài S. paramamosain dường như có sự phân bố hẹp hơn nhiều, chủ yếu hạn chế trong khu vực biển Đông và biển Java. Khu vực phân bố của các loài cua bùn Scylla [8] TT Tên loài Khu vực phân bố Ấn Độ Dương-Tây Thái Bình Dương: Nam Phi, biển Đỏ, Australia, Philippines, các Ďảo trên Thái Bình 1 S.