MỞ ĐẦU Việt Nam là nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa nên có sự đa dạng phong phú về các loài thực vật, động vật và có nền nông nghiệp phát triển. Tuy nhiên, điều kiện khí hậu trên cũng là điều kiện tốt để sâu bệnh hại phát sinh, phát triển quanh năm. Có thể nói, đây là một trong những trở ngại lớn nhất trong sản xuất nông nghiệp của nước ta. Hàng năm, các côn trùng gây hại làm giảm đến 40-50% sản lượng của sản xuất nông nghiệp (Phạm Văn Lực et al, 1999).
Để bảo vệ năng suất cây trồng, người nông dân đã sử dụng rất nhiều loại thuốc trừ sâu hóa học khác nhau, mặc dù đem lại hiệu quả nhanh, dễ sử dụng, giá thành thấp, nhưng lại gây ra những hậu quả tiêu cực đối với môi trường sống, gây hại đến sức khỏe người và động vật nuôi, đồng thời tạo nên tính kháng thuốc của nhiều loài dịch hại. Đặc biệt, thuốc hóa học còn tiêu diệt nhiều loài sinh vật có ích làm giảm tính đa dạng trong tự nhiên gây mất cân bằng sinh thái. Hướng đến phát triển nền nông nghiệp sinh thái bền vững, không gây ô nhiễm môi trường, không ảnh hưởng đến sức khỏe con người, vật nuôi và các sinh vật có ích, đảm bảo được tính đa dạng sinh học và tính cân bằng sinh thái trong tự nhiên, việc nghiên cứu lựa chọn biện pháp phòng trừ tổng hợp trong đó có biện pháp sinh học đã và đang được nhiều nhà khoa học quan tâm đặc biệt, được nghiên cứu, phát triển rộng rãi nhằm hạn chế sử dụng và tiến tới thay thế một phần thuốc hóa học trừ sâu được dùng trong nông nghiệp hiện nay. Hiện nay, phương pháp phòng trừ sinh học, đã được nghiên cứu và ứng dụng nhiều trong thực tế, một số kết quả đạt được như sử dụng thiên địch tự nhiên như ong mắt đỏ ký sinh, bọ rùa, bọ xít bắt mồi, nhện bắt mồi ăn thịt,… để không chế dịch hại.
Ngoài ra vi khuẩn, nấm và virut đa nhân cũng đã được nghiên cứu, ứng dụng cho phòng trừ sâu hại cây trồng. Đặc biệt gần đây, các loài tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng cũng được nhanh chóng nghiên cứu, áp dụng trong phòng trừ sâu hại. Tuyến trùng ký sinh gây bệnh cho côn trùng (EPN) thực chất là những tổ hợp cộng sinh giữa các loài tuyến trùng ký sinh thuộc giống Steinernema (Họ Steinermatidae) và Heterorhabditis (Họ Heterorhabditidae) và các loài vi khuẩn gây bệnh giống Xenorhabdus và 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Trong đó, tuyến trùng đóng vai trò vừa là ký sinh lại là những vector mang truyền vi khuẩn gây bệnh.
Chính vì vậy mà nhóm tuyến trùng này trở thành tác nhân sinh học có nhiều ưu thế trong phòng trừ sinh học sâu hại như: phổ diệt sâu hại rộng, khả năng diệt sâu nhanh, có khả năng tự sản sinh tăng số lượng sau khi đã giết chết sâu hại và có thể sản xuất sinh khối lớn bằng công nghệ sinh học thích hợp in vivo và in vitro. EPN đã được nghiên cứu ứng dụng rộng rãi và thương mại hóa như những chế phẩm sinh học ở nhiều nước như Mỹ, Úc, Canada, Trung Quốc, Nhật Bản, Thái Lan [2]. Mặc dù nghiên cứu EPN ở Việt Nam chỉ mới được triển khai vài thập niên gần đây, nhưng các kết quả nghiên cứu bước đầu cho thấy Việt Nam là một trong những quốc gia có nguồn tài nguyên EPN phong phú và đa dạng, đồng thời đã đạt được một số kết quả quan trọng trong việc điều tra phân loại và nghiên cứu, tuyển chọn các chủng tuyến trùng có tiềm năng sinh học đưa vào sản xuất sinh khối và ứng dụng vào thực tiễn trong phòng trừ sinh học sâu hại [3, 5]. Tuy nhiên, hầu hết các chủng EPN ở Việt Nam chỉ tồn tại ở các hệ sinh thái rừng tự nhiên, rất ít các chủng EPN được phân lập từ hệ sinh thái nông nghiệp.
Vì vậy, việc điều tra phân lập nhóm tuyến trùng này trong các hệ sinh thái nông nghiệp, đặc biệt hệ sinh thái nông nghiệp Tây Nguyên là rất cần thiết. Để có thêm dẫn liệu về tuyến trùng trong các hệ sinh thái nông nghiệp, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu “ Nghiên cứu đặc điểm hình thái và phân tử của một số tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng ở hệ sinh thái nông nghiệp Tây Nguyên ” với các mục đích sau: Xác định đặc điểm hình thái và phân tử của EPN ở hệ sinh thái nông nghiệp Tây Nguyên. Đặc trưng sinh học và tiềm năng sử dụng EPN trong phòng trừ sinh học. Do hạn chế về thời gian và phạm vi nghiên cứu rất rộng, nên chúng tôi tập trung nghiên cứu và xác định các tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng – EPN trong hệ sinh thái cây công nghiệp trong hệ sinh thái nông nghiệp Tây Nguyên, cụ thể tập trung với 2 loại cây công nghiệp chủ lực là cà phê và hồ tiêu.
2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Đề tài luận văn đã cung cấp dẫn liệu về đặc điểm hình thái và phân tử của chủng tuyển trùng S-DL13 thuộc loài tuyến trùng Steinernema siamkayai được phân lập từ hệ sinh thái nông nghiệp Tây Nguyên. Một số dẫn liệu sinh học về sinh trưởng, phát triển và độc lực học cũng như khả năng sinh sản của tuyến trùng trên côn trùng bướm sáp lớn (Galleria mellonella) bước đầu cũng được cung cấp và thảo luận. 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chƣơng 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Khái quát chung về tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (EPN) 1.1 Lịch sử nghiên cứu: Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (Entomopathogenic nematode - EPN) là những loài giun tròn có ích ký sinh ở những loài côn trùng, làm suy yếu hoặc giết chết những côn trùng vật chủ này, nhưng lại rất an toàn đối với người, động vật và thực vật.
Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng thuộc 2 giống Steinernema và Heterorhabditis, thuộc 2 họ khác nhau: giống Steinernema thuộc họ Steinernematidae và Heterorhabditis thuộc họ Heterorhabditidae của ngành giun tròn (Nematoda). Hệ thống phân loại của nhóm tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng dựa trên hệ thống phân loại của De Ley et al., 2002 [18], Hunt, 2007 [24], như sau: Ngành: Nematoda Lớp: Chromadoria Inglis, 1983 Phân lớp: Chromadoria Pearse, 1942 Bộ: Rhabditida Chitwood, 1933 Phân bộ: Tylenchina Thorne, 1949 Dưới phân bộ: Panagrolaimomorpha De Ley & Blaxter, 2002 Liên họ: Strongyloidoidea Chitwood & McIntosh 1934 Họ: Steinernematidae Chitwood & Chitwood, 1937 Giống: Steinernema Travassos, 1927 Giống: Neosteinernema Nguyen & Smart, 1994 Phân bộ: Rhabditina Chitwood, 1933 Dưới phân bộ: Rhabditomorpha De Ley & Blaxter, 2002 Liên họ: Strongyloidea Baird, 1853 Họ: Heterorhabditidae Poinar, 1976 Giống Heterorhabditis Poinar, 1976 Trên thế giới, tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng được biết đến từ những năm 1923 khi Steiner lần đầu tiên mô tả một giống và loài tuyến trùng mới 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Aplectana kraussei (Steiner, 1923). Đến năm 1927 giống này được đổi tên là Steinernema (Travassos, 1927). Năm 1929, Steiner phát hiện và mô tả một giống mới và đặt tên là Neoaplectana glaseri [37].
Sau rất nhiều tranh cãi về việc sắp xếp giống Neoaplectana riêng biệt hay synonym với Steinernema, và tất cả các nhà phân loại học cũng chấp nhận Neoaplectana là synonym với giống Steinernema (Hunt, 2007) [24]. Năm 1955, Dulky và Hough đã sử dụng ấu trùng BSLlàm vật chủ để nhân nuôi loài S. feltiae với số lượng lớn [19]. Năm 1975, Poinar [33] đã phát hiện ra một loài mới thuộc một giống mới có khả năng ký sinh gây bệnh trên côn trùng là loài Heterorhabditis bacteriophora thuộc giống Heterorhabditis.
Sau đó giống Neosteinernema Nguyen & Smart, 1994 [27] đã được mô tả thêm cho nhóm EPN. Năm 2000, Ganguly và Singh đã phân lập một loài tuyến trùng kí sinh gây bệnh côn trùng mới, Steinernema thermophilum từ vùng nông thôn ở New Delhi, Ấn Độ. Năm 2001, Steinernma pakistanense được Shahina et al., mô tả là loài mới. Loài này được tìm thấy trong các mẫu từ các vùng khác nhau của Pakistan.
Năm 2004 Mutsuhiro Yoshida đã nghiên cứu và mô tả 1 loài EPN mới, Steinernema litorale đã được phân lập từ các mẫu đất cát ở Nhật bản. Năm 2005 Qiu et al., đã nghiên cứu và mô tả một loài EPN mới là Steinernema akhursti được thu thập từ các mẫu đất tại tỉnh Yunan, Trung Quốc. Nguyễn đã nghiên cứu một loài EPN mới, Steinernema khoisanae được mô tả từ Nam Mỹ. Những chủng phân lập và mô tả của các loài EPN khác nhau được tăng lên nhanh chóng trên thế giới trong thập kỷ này nhờ sự trợ giúp của kỹ thuật phân tử.
Hunt (2007) [24] đã tổng kết có 55 loài Steinernema, 11 loài Heterorhabditis và một loài Neosteinernema có giá trị trong nhóm EPN. Đến nay, ít nhất có thêm 20 loài Steinernema đã được mô tả thêm sau Hunt (2007) đó là: S. australe Edgington et al. boemarei Lee et al.
brazilense Nguyen et al. cholashanense Nguyen et al. colombiense López-Núñez et al. costaricense Uribe-Lorío et al.
ichnusae Tarasco et al. puntauvense Uribe-Lorío et al. texanum Nguyen et al. unicornum Edgington et al.
xueshanense Mráček et al. schliemanni 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Spiridonov et al. pui Qiu et al. vulcanicum Clausi et al.
phyllophagae Nguyen et al. citrae Stokwe et al. everestense Khatri-Chhetri et al. lamjungense Khatri-Chhetri et al.
sayeedae Ali et al. nepalense Khatri-Chhetri et al. surkhetense Khatri-Chhetri et al., 2011 Năm loài thuộc giống Heterorhabditis được mô tả sau Hunt, 2007, bao gồm: H. georgiana Nguyen et al.
gerrardi Plichta et al. safricana Malan et al. sonorensis Stock et al. atacamensis Edgington et al.
Trong phân loại tuyến trùng, phương pháp mô tả đặc điểm hình thái đã được các nhà khoa học sử dụng như một công cụ hữu ích trong việc phân loại các loài tuyến trùng [3]. Tuy nhiên, do đặc thù các chủng EPN đa số là các loài đồng hình và các chỉ số phân loại chồng lấn với nhau giữa các loài gần gũi. Vì vậy, những nhầm lẫn trong mô tả hình thái là khó tránh khỏi. Do đó, đi đôi với việc mô tả các đặc điểm hình thái, các nhà khoa học đã áp dụng kỹ thuật phân tử trong phân loại tuyến trùng, giúp cho việc định loại đến loài chính xác hơn.
Những đặc trưng phân tử khác biệt sẽ làm sáng tỏ loài và các nhóm, tiếp theo có thể nghiên cứu các đặc điểm hình thái để phân biệt chúng. Một số kỹ thuật phân tử đã được sử dụng trong định loại EPN như: isozyme, protein tổng số hay kỹ thuật miễn dịch và phương pháp nghiên cứu dựa trên PCR-RFLP được sử dụng rộng rãi cho định loại tuyến trùng. Những kỹ thuật hiện đại hơn cũng đã được áp dụng như phương pháp RAPD có thể được sử dụng để định loại chủng.