Luận văn nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng tạo mô sẹo cây gừng núi đá zingiber sp trong điều kiện in vitro

Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố đến khả năng tạo mô sẹo cây gừng núi đá zingiber sp trong điều kiện in vitro, cung cấp thông tin hữu ích cho ngành nông nghiệp.

• Tác giả: Triệu Minh Huệ
• Người hướng dẫn: ThS. Lâm Mai Tùng
• Trường học: Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên Cứu Ảnh Hưởng Các Yếu Tố Đến Khả Năng Tạo Mô Sẹo Cây Gừng Núi Đá
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT
• 1. PHẦN 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Mục đích của đề tài
• 1.2. Yêu cầu của đề tài
• 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
• 1.3.1. Ý nghĩa khoa học
• 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
• 2. PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Tổng quan về gừng núi đá
• 2.2. Phân loại
• 2.3. Đặc điểm phân bố
• 2.4. Đặc tính sinh học
• 2.5. Thành phần hóa học
• 2.6. Tác dụng
• 2.7. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào
• 2.7.1. Tính toàn năng di truyền của tế bào
• 2.7.2. Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào
• 2.8. Nuôi cấy mô sẹo
• 2.8.1. Sự hình thành mô sẹo
• 3. PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
• 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
• 3.1.2. Phạm vi nghiên cứu
• 3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 3.2.1. Địa điểm nghiên cứu
• 3.2.2. Thời gian nghiên cứu
• 3.3. Điều kiện nuôi cấy
• 3.4. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu
• 3.5. Nội dung nghiên cứu
• 3.6. Phương pháp nghiên cứu
• 3.6.1. Chuẩn bị vật liệu nghiên cứu
• 3.6.2. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy
• 3.6.3. Nuôi cấy mô sẹo
• 3.6.4. Phương pháp bố trí thí nghiệm
• 3.6.5. Chỉ tiêu theo dõi
• 3.6.6. Xử lý số liệu
• 4. PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp khử trùng thích hợp tạo vật liệu sạch phục vụ nuôi cấy cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro
• 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0.1% đến hiệu quả khử trùng mẫu cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro
• 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của việc kết hợp khử trùng bằng HgCl2 0.1% và Ca(OCl)2 15% đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy cây gừng Núi đá
• 4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tạo mô sẹo cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro
• 4.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ 2,4 - D đến khả năng tạo mô sẹo cây gừng núi đá trong điều kiện in vitro
• 4.6. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA và IAA đến khả năng hình thành mô sẹo cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro
• 4.7. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ 2,4 - D kết hợp với BA đến khả năng hình thành mô sẹo cây gừng núi đá trong điều kiện in vitro
• 4.8. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng đường saccharose đến khả năng hình thành mô sẹo cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro
• 5. PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Về Tạo Mô Sẹo Gừng Núi Đá

Gừng (Zingiber officinable Roscoe.) là cây thân thảo lâu năm, củ được dùng nhiều trong công nghiệp thực phẩm và dược liệu. Gừng được trồng phổ biến ở các nước nhiệt đới. Tại Việt Nam, gừng được trồng từ lâu đời, khắp các địa phương. Tuy nhiên, gừng núi đá là một loại cây bản địa, quý hiếm, cần được bảo tồn. Nghiên cứu về tạo mô sẹo cho phép nhân giống nhanh và bảo tồn nguồn gen. Đề tài "Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng tạo mô sẹo cây gừng núi đá (Zingiber sp.) trong điều kiện in vitro" hướng đến mục tiêu này. Mục đích là nghiên cứu phương pháp khử trùng thích hợp và ảnh hưởng của các yếu tố đến khả năng tạo mô sẹo.

1.1. Giới Thiệu Chung Về Gừng Núi Đá Zingiber sp.

Gừng núi đá (Zingiber sp.) là loài cây bản địa quý hiếm của Việt Nam, cần được bảo tồn theo Quyết định 80/2005/QĐ-BNN. Loài gừng này có đặc điểm sinh học và thành phần hóa học đặc biệt, khác với các loại gừng thông thường. Nghiên cứu về gừng núi đá còn hạn chế, đặc biệt là về khả năng tạo mô sẹo trong điều kiện in vitro. Tên gừng Núi đá bắt nguồn từ nơi chúng có khả năng sống và phát triển tốt nhất. Loại gừng này thường mọc ở những dãy núi đá cao khoảng trên 1m, củ bằng đốt ngón tay, có mùi vị thơm rất lạ lùng giống mùi bọ xít.

1.2. Tầm Quan Trọng Của Nghiên Cứu Tạo Mô Sẹo In Vitro

Tạo mô sẹo in vitro là kỹ thuật quan trọng trong nhân giống và bảo tồn các loài cây quý hiếm. Kỹ thuật này cho phép nhân nhanh số lượng lớn cây giống sạch bệnh từ một mẫu nhỏ. Ngoài ra, mô sẹo còn được sử dụng để nghiên cứu các hợp chất có giá trị dược lý. Nghiên cứu này sẽ cung cấp quy trình nhân giống phù hợp cho gừng núi đá trong điều kiện in vitro và phục vụ các nghiên cứu chiết xuất các hợp chất hóa học quan trọng của gừng nói chung và gừng núi đá nói riêng.

II. Thách Thức Trong Nghiên Cứu In Vitro Gừng Núi Đá

Nghiên cứu in vitro gừng núi đá đối mặt với nhiều thách thức. Khử trùng mẫu vật là một trong những khó khăn lớn nhất, do nguy cơ nhiễm khuẩn cao. Việc lựa chọn môi trường nuôi cấy và chất kích thích sinh trưởng phù hợp cũng rất quan trọng để đảm bảo khả năng tạo mô sẹo tốt nhất. Các yếu tố môi trường như ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm cũng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của mô sẹo. Cần có các nghiên cứu chuyên sâu để tối ưu hóa các yếu tố này.

2.1. Vấn Đề Khử Trùng Mẫu Vật Trong Nuôi Cấy Mô

Khử trùng mẫu vật là bước quan trọng để loại bỏ các vi sinh vật gây nhiễm, ảnh hưởng đến sự phát triển của mô sẹo. Các phương pháp khử trùng thường dùng bao gồm sử dụng hóa chất như HgCl2, Ca(OCl)2. Tuy nhiên, việc lựa chọn nồng độ và thời gian khử trùng phù hợp là rất quan trọng để tránh gây hại cho mẫu vật. Nghiên cứu này sẽ tập trung vào việc tìm ra phương pháp khử trùng hiệu quả nhất cho gừng núi đá.

2.2. Ảnh Hưởng Của Môi Trường Nuôi Cấy Đến Tạo Mô Sẹo

Môi trường nuôi cấy cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của mô sẹo. Thành phần môi trường, đặc biệt là hàm lượng đường saccharose, ảnh hưởng đến khả năng tạo mô sẹo. Ngoài ra, các chất kích thích sinh trưởng như auxin và cytokinin cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình này. Nghiên cứu sẽ đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố này đến khả năng tạo mô sẹo của gừng núi đá.

2.3. Vai Trò Của Hormone Thực Vật Trong Tạo Mô Sẹo

Hormone thực vật đóng vai trò then chốt trong quá trình tạo mô sẹo. Auxin, đặc biệt là 2,4-D, NAA và IAA, thường được sử dụng để kích thích sự hình thành mô sẹo. Cytokinin, như BA, có thể kết hợp với auxin để điều chỉnh sự phát triển của mô sẹo. Tỷ lệ auxin/cytokinin có ảnh hưởng lớn đến quá trình này. Nghiên cứu sẽ khảo sát ảnh hưởng của các loại hormone thực vật và tỷ lệ của chúng đến khả năng tạo mô sẹo của gừng núi đá.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Ảnh Hưởng Yếu Tố Đến Tạo Mô Sẹo

Nghiên cứu sử dụng phương pháp nuôi cấy mô tế bào để đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố đến khả năng tạo mô sẹo của gừng núi đá. Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, với các công thức khác nhau về nồng độ chất khử trùng, hàm lượng đường saccharose và chất kích thích sinh trưởng. Các chỉ tiêu theo dõi bao gồm tỷ lệ mẫu sống, tỷ lệ nhiễm, khối lượng mô sẹo và hình thái mô sẹo. Số liệu được xử lý thống kê để đánh giá sự khác biệt giữa các công thức.

3.1. Quy Trình Chuẩn Bị Mẫu Vật Và Môi Trường Nuôi Cấy Mô

Mẫu vật gừng núi đá được thu thập từ vùng núi đá Lạng Sơn. Mẫu vật được rửa sạch, khử trùng và cắt thành các đoạn nhỏ để nuôi cấy. Môi trường nuôi cấy MS (Murashige and Skoog) được sử dụng làm môi trường cơ bản, bổ sung thêm các chất dinh dưỡng và chất kích thích sinh trưởng. Môi trường được điều chỉnh pH và khử trùng trước khi sử dụng.

3.2. Bố Trí Thí Nghiệm Đánh Giá Ảnh Hưởng Của Các Yếu Tố

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, với các công thức khác nhau về thời gian khử trùng (HgCl2 0.1%), nồng độ đường saccharose và nồng độ chất kích thích sinh trưởng (2,4-D, NAA, IAA, BA). Mỗi công thức được lặp lại nhiều lần để đảm bảo tính chính xác của kết quả. Các mẫu nuôi cấy được đặt trong phòng nuôi cấy mô với điều kiện ánh sáng, nhiệt độ và độ ẩm được kiểm soát.

3.3. Các Chỉ Tiêu Theo Dõi Và Phương Pháp Xử Lý Số Liệu

Các chỉ tiêu theo dõi bao gồm tỷ lệ mẫu sống, tỷ lệ nhiễm, thời gian xuất hiện mô sẹo, khối lượng mô sẹo và hình thái mô sẹo. Các chỉ tiêu này được đánh giá định kỳ trong suốt quá trình nuôi cấy. Số liệu thu thập được xử lý thống kê bằng phần mềm chuyên dụng để đánh giá sự khác biệt giữa các công thức. Phương pháp LSD (Least Significant Difference) được sử dụng để so sánh các giá trị trung bình.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Ảnh Hưởng Đến Tạo Mô Sẹo Gừng Đá

Nghiên cứu đã xác định được phương pháp khử trùng thích hợp cho gừng núi đá, đảm bảo tỷ lệ mẫu sống cao và tỷ lệ nhiễm thấp. Kết quả cũng cho thấy ảnh hưởng của hàm lượng đường saccharose và chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tạo mô sẹo. Nồng độ 2,4-D có ảnh hưởng lớn đến sự hình thành mô sẹo, trong khi NAA và IAA có tác dụng kém hơn. Sự kết hợp giữa 2,4-D và BA cũng cho thấy hiệu quả trong việc kích thích tạo mô sẹo.

4.1. Phương Pháp Khử Trùng Hiệu Quả Cho Mẫu Vật Gừng Đá

Kết quả nghiên cứu cho thấy việc khử trùng bằng HgCl2 0.1% trong thời gian 5 phút là hiệu quả nhất, đảm bảo tỷ lệ mẫu sống cao và tỷ lệ nhiễm thấp. Việc kết hợp khử trùng bằng HgCl2 0.1% và Ca(OCl)2 15% không mang lại hiệu quả cao hơn. Do đó, HgCl2 0.1% được lựa chọn làm phương pháp khử trùng chính cho các thí nghiệm tiếp theo.

4.2. Ảnh Hưởng Của Nồng Độ 2 4 D Đến Khả Năng Tạo Mô Sẹo

Nồng độ 2,4-D có ảnh hưởng lớn đến khả năng tạo mô sẹo của gừng núi đá. Nồng độ 2,4-D tối ưu là 2 mg/l, cho tỷ lệ tạo mô sẹo cao nhất và khối lượng mô sẹo lớn nhất. Nồng độ 2,4-D cao hơn có thể ức chế sự phát triển của mô sẹo. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trước đây về ảnh hưởng của 2,4-D đến tạo mô sẹo ở các loài cây khác.

4.3. Vai Trò Của Đường Saccharose Trong Quá Trình Tạo Mô Sẹo

Hàm lượng đường saccharose trong môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng tạo mô sẹo của gừng núi đá. Nồng độ đường saccharose tối ưu là 30 g/l, cho tỷ lệ tạo mô sẹo cao nhất và khối lượng mô sẹo lớn nhất. Nồng độ đường saccharose thấp hơn hoặc cao hơn đều làm giảm khả năng tạo mô sẹo. Đường saccharose cung cấp năng lượng và carbon cho sự sinh trưởng và phát triển của mô sẹo.

V. Ứng Dụng Và Triển Vọng Của Tạo Mô Sẹo Gừng Núi Đá

Tạo mô sẹo gừng núi đá có nhiều ứng dụng tiềm năng trong nhân giống, bảo tồn và nghiên cứu dược liệu. Kỹ thuật này cho phép nhân nhanh số lượng lớn cây giống sạch bệnh, phục vụ cho việc trồng và khai thác gừng núi đá một cách bền vững. Ngoài ra, mô sẹo còn được sử dụng để nghiên cứu các hợp chất có giá trị dược lý, mở ra triển vọng phát triển các sản phẩm từ gừng núi đá.

5.1. Nhân Giống Nhanh Gừng Núi Đá Bằng Kỹ Thuật Mô Sẹo

Kỹ thuật tạo mô sẹo cho phép nhân nhanh số lượng lớn cây giống gừng núi đá từ một mẫu nhỏ. Điều này rất quan trọng trong việc bảo tồn và phát triển loài cây quý hiếm này. Cây giống được tạo ra từ mô sẹo có chất lượng tốt, sạch bệnh và đồng đều về mặt di truyền.

5.2. Nghiên Cứu Dược Lý Và Phát Triển Sản Phẩm Từ Mô Sẹo

Mô sẹo có thể được sử dụng để nghiên cứu các hợp chất có giá trị dược lý của gừng núi đá. Các hợp chất này có thể được chiết xuất từ mô sẹo và sử dụng để phát triển các sản phẩm chăm sóc sức khỏe và dược phẩm. Nghiên cứu này mở ra triển vọng phát triển các sản phẩm có giá trị kinh tế cao từ gừng núi đá.

VI. Kết Luận Và Hướng Nghiên Cứu Về Tạo Mô Sẹo Gừng

Nghiên cứu đã thành công trong việc xác định các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo mô sẹo của gừng núi đá trong điều kiện in vitro. Kết quả này là cơ sở cho việc xây dựng quy trình nhân giống và bảo tồn gừng núi đá một cách hiệu quả. Hướng nghiên cứu tiếp theo là tối ưu hóa quy trình tạo mô sẹo, nghiên cứu sự biệt hóa mô sẹo thành cây hoàn chỉnh và đánh giá hiệu quả kinh tế của việc nhân giống gừng núi đá bằng kỹ thuật mô sẹo.

6.1. Tối Ưu Hóa Quy Trình Tạo Mô Sẹo Cho Gừng Núi Đá

Cần tiếp tục nghiên cứu để tối ưu hóa quy trình tạo mô sẹo cho gừng núi đá. Các yếu tố cần được xem xét bao gồm thành phần môi trường nuôi cấy, nồng độ chất kích thích sinh trưởng và điều kiện môi trường. Mục tiêu là đạt được tỷ lệ tạo mô sẹo cao nhất và chất lượng mô sẹo tốt nhất.

6.2. Nghiên Cứu Sự Biệt Hóa Mô Sẹo Thành Cây Hoàn Chỉnh

Nghiên cứu sự biệt hóa mô sẹo thành cây hoàn chỉnh là bước quan trọng để hoàn thiện quy trình nhân giống gừng núi đá bằng kỹ thuật mô sẹo. Cần xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình biệt hóa, như tỷ lệ auxin/cytokinin và điều kiện ánh sáng. Mục tiêu là tạo ra cây hoàn chỉnh có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt trong điều kiện tự nhiên.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Cây gừng (Zingiber officinale Roscoe) là loài cây thân thảo đa niên thuộc họ Gừng (Zingiberaceae), có giá trị kinh tế và y học nhờ chứa các hợp chất thứ cấp như tinh dầu (zingiberene, camphene), nhựa dầu và các dẫn xuất phenolic (gingerol, shogaol). Trong sản xuất nông nghiệp truyền thống, gừng chủ yếu được nhân giống vô tính bằng các đoạn thân rễ (củ). Tuy nhiên, phương pháp này tồn tại nhược điểm lớn là hệ số nhân giống thấp và nguy cơ tích lũy, lây truyền nguồn dịch bệnh qua các thế hệ củ giống, điển hình là bệnh héo rũ do vi khuẩn (Pseudomonas solanacearum), thối rễ do nấm (Pythium aphanidermatum) và tổn thương do tuyến trùng (Meloidogyne spp.).

Bên cạnh các giống gừng canh tác thông thường, gừng Núi đá (Zingiber sp., tên địa phương tiếng Tày gọi là "khing phia") là loài cây bản địa mọc tự nhiên trên các vách núi đá vôi có độ cao trên 1.000 m tại một số tỉnh miền núi phía Bắc và Tây Nguyên như Lạng Sơn, Bắc Kạn, Cao Bằng, Hà Giang, Đắk Lắk. Loài này có đặc điểm củ nhỏ bằng đốt ngón tay, mùi thơm đặc trưng giống mùi bọ xít và đã được xếp vào danh mục các nguồn gen quý hiếm cần được bảo tồn theo Quyết định số 80/2005/QĐ-BNN do Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ban hành ngày 05/12/2005. Do đặc tính phân bố hẹp và nguy cơ suy giảm quần thể trong tự nhiên, việc ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào để tạo nguồn mô sẹo sạch bệnh là tiền đề bắt buộc cho vi nhân giống và khai thác dược liệu.

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài gồm 2 nội dung:

1. Nghiên cứu phương pháp khử trùng thích hợp để tạo vật liệu sạch phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
2. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng tạo mô sẹo cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro.

Nhiệm vụ và yêu cầu nghiên cứu cụ thể được xác định như sau:

1. Xác định ảnh hưởng của phương pháp khử trùng (thời gian khử trùng và sự kết hợp giữa các hóa chất khử trùng) đến khả năng tạo vật liệu sạch ban đầu phục vụ nuôi cấy mô sẹo cây gừng Núi đá.
2. Xác định ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin và cytokinin (đơn lẻ hoặc phối hợp) đến khả năng hình thành và chất lượng mô sẹo.
3. Xác định ảnh hưởng của hàm lượng đường saccharose trong môi trường dinh dưỡng đến khả năng tạo mô sẹo cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Mầm chồi cây gừng Núi đá (Zingiber sp.) dài khoảng 3 - 4 cm được thu thập từ vườn mẫu của Trung tâm Ứng dụng Tiến bộ Khoa học và Công nghệ tỉnh Lạng Sơn.
• Phạm vi nghiên cứu: Giới hạn trong quy trình vô trùng bề mặt mẫu mầm chồi và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng (chất điều hòa sinh trưởng, nguồn cacbon) đến khả năng cảm ứng tạo mô sẹo sơ cấp in vitro.
• Địa điểm và thời gian thực hiện: Đề tài được triển khai tại Phòng Kỹ thuật thuộc Trung tâm Ứng dụng Tiến bộ Khoa học và Công nghệ tỉnh Lạng Sơn, trong thời gian từ tháng 12/2013 đến tháng 06/2014.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được xây dựng trên cơ sở lý thuyết về tính toàn năng di truyền của tế bào thực vật (totipotency) cùng các nguyên lý về sự phân hóa và phản phân hóa tế bào (dedifferentiation). Khi các mô chuyên hóa của mầm chồi được kích thích bởi các điều kiện ngoại cảnh và chất điều hòa sinh trưởng thích hợp, các gen vốn bị ức chế sẽ được tái hoạt hóa, giúp tế bào quay trở lại trạng thái phôi sinh để phân chia tạo thành mô sẹo (callus) vô tổ chức. Tác giả vận dụng lý thuyết điều hòa sinh trưởng của Miller và Skoog (1957, 1963) về sự cân bằng tỷ lệ auxin/cytokinin: tỷ lệ auxin/cytokinin cân bằng cảm ứng quá trình tạo mô sẹo, trong khi sự thiên lệch sẽ kích thích tạo rễ hoặc chồi. Về mặt tế bào học, auxin (như 2,4-D, NAA, IAA) kích hoạt enzyme ATPase tại màng tế bào, bơm ion H+ ra ngoài làm mềm và giãn vách cellulose, đồng thời thúc đẩy nhân đôi DNA; cytokinin (như BA) giữ vai trò chuyển pha tế bào từ G1 sang S và từ G2 sang M trong chu kỳ nguyên phân.

Vật liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu:

• Môi trường nền tảng: Môi trường khoáng cơ bản Murashige và Skoog (MS, 1962), bổ sung agar (7 g/l), nước dừa (100 ml/l) và đường saccharose (thay đổi từ 20 đến 60 g/l tùy thí nghiệm). Môi trường được chỉnh pH về mức 5,8 - 6,0 trước khi hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 121°C, áp suất 1,1 atm trong 15 - 20 phút.
• Hóa chất điều hòa sinh trưởng: 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), $\alpha$-naphthalene acetic acid (NAA), indole-3-acetic acid (IAA), 6-benzylaminopurine (BA).
• Hóa chất khử trùng: Cồn 70°, Thủy ngân clorua (HgCl2 0,1%), Canxi hypoclorit [Ca(OCl)2 15%], xà phòng diệt khuẩn.
• Thiết bị phòng thí nghiệm: Tủ cấy vô trùng cấp II, nồi hấp khử trùng ALP, tủ sấy, máy đo pH, cân điện tử, lò vi sóng và tủ lạnh Sanyo.

Điều kiện nuôi cấy: Các bình nuôi cấy chứa 50 - 70 ml môi trường được đặt trong phòng nuôi duy trì nhiệt độ 25 ± 2°C, độ ẩm không khí 60 - 65% và duy trì chế độ tối hoàn toàn đối với giai đoạn cảm ứng tạo mô sẹo.

Phương pháp bố trí thí nghiệm và xử lý số liệu: Tất cả các thí nghiệm được bố trí theo khối ngẫu nhiên hoàn toàn (CRD). Mỗi công thức thí nghiệm được lặp lại 3 lần, mỗi lần cấy 10 mẫu (tổng số 30 mẫu cho mỗi công thức), mỗi bình nuôi cấy chứa 1 mẫu cấy (lát cắt mầm chồi dày 1 - 2 mm).

• Chỉ tiêu theo dõi khử trùng (sau 4 tuần): Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm (%), tỷ lệ mẫu sống nhiễm (%), tỷ lệ mẫu chết (%).
• Chỉ tiêu theo dõi tạo mô sẹo (sau 8 tuần): Tỷ lệ tạo mô sẹo (%), phân loại chất lượng mô sẹo theo 3 cấp độ:
  • Tốt: Mô sẹo chắc, màu vàng nhạt hoặc vàng xanh, phình to, đồng nhất.
  • Trung bình: Mô sẹo chắc, màu trắng, kích thước trung bình.
  • Kém: Mô sẹo xốp, mọng nước, màu nâu đen.
• Phương pháp xử lý số liệu: Dữ liệu được lưu trữ và tính toán trên Microsoft Excel, phân tích phương sai (ANOVA) và kiểm định sự sai khác giữa các giá trị trung bình bằng phép thử sai biệt nhỏ nhất có ý nghĩa (LSD ở mức xác suất $\alpha = 0,05$) và hệ số biến động (CV%) thông qua phần mềm thống kê IRRISTAT 4.

---

Nội dung chính theo từng chương

Phần 1: Mở đầu

Phần này làm rõ cơ sở khoa học và thực tiễn của đề tài. Tác giả nhấn mạnh tính cấp thiết của việc bảo tồn nguồn gen gừng Núi đá Lạng Sơn theo Quyết định 80/2005/QĐ-BNN trong bối cảnh các phương pháp nhân giống truyền thống bằng củ bị hạn chế bởi bệnh hại và hệ số nhân thấp. Xác lập hệ thống 2 mục tiêu nghiên cứu chính và 3 nhiệm vụ kỹ thuật cụ thể. Nêu rõ ý nghĩa thực tiễn là tạo cơ sở ban đầu để nhân giống bảo tồn và khai thác nguồn dược liệu quý, đồng thời đóng góp dữ liệu cho các nghiên cứu nuôi cấy tế bào thực vật in vitro.

Phần 2: Tổng quan tài liệu

Chương tổng quan hệ thống hóa các đặc điểm thực vật học, vùng phân bố tự nhiên và giá trị sử dụng của chi Zingiber nói chung và gừng Núi đá nói riêng. Tác giả trích dẫn bảng thành phần hóa học tinh dầu gừng từ nghiên cứu của Sasid tharan et al., chỉ ra các thành phần chính như zingiberene (28,6% ở gừng tươi, 30,3% ở gừng khô), ar-curcumene (5,6% - 11,0%), camphene, geranial và các hoạt chất gingerol, shogaol có hoạt tính chống viêm, chống oxy hóa.

Về mặt kỹ thuật nuôi cấy mô, chương này phân tích sâu cơ chế phân hóa - phản phân hóa tế bào, động học phát triển mô sẹo qua 5 pha (pha lag, pha exponential, pha linear, pha deceleration và pha stationary), ảnh hưởng của pH (tối ưu 5,6 - 6,0), ánh sáng, nhiệt độ (25 ± 2°C) và vai trò của các nguồn muối khoáng, đường saccharose, auxin, cytokinin. Tác giả cũng tổng thuật các công trình nghiên cứu trên thế giới và trong nước về nuôi cấy in vitro họ Gừng: Nirmal Babu et al. (1991) trên Zingiber officinale, Faridah et al. (2011) trên Zingiber zerumbet, Tamil Sundram et al. (2012) trên Curcuma mangga, Đặng Ngọc Phúc et al. (2011) trên cây sa nhân tím (Amomum longiligulare), và Võ Châu Tuấn (2014) trên cây nghệ đen (Curcuma zedoaria).

Phần 3: Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Mô tả chi tiết nguồn vật liệu mầm chồi non gừng Núi đá thu hoạch lúc khô ráo sương, quy trình rửa sơ bộ dưới vòi nước chảy 15 phút, tách bẹ già, rửa bằng xà phòng 10 phút, ngâm cồn 70° trong 1 phút và tráng nước cất vô trùng 3 - 4 lần trong tủ cấy. Quy định chi tiết thông số môi trường MS, agar 7 g/l, nước dừa 100 ml/l, quy trình khử trùng nồi hấp và điều kiện buồng nuôi tối ở 25 ± 2°C.

Chương này trình bày chi tiết cách thiết kế 6 thí nghiệm thực nghiệm:

• Thí nghiệm 1: Khảo sát thời gian xử lý bằng HgCl2 0,1% (7, 10, 12, 15 phút).
• Thí nghiệm 2: Khảo sát khử trùng kết hợp HgCl2 0,1% (12 phút) với Ca(OCl)2 15% (ở các mức 0, 10, 20, 30, 40 phút).
• Thí nghiệm 3: Khảo sát nồng độ 2,4-D (0; 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 6,0 mg/l).
• Thí nghiệm 4: Khảo sát kết hợp hai loại auxin NAA và IAA (ở các tổ hợp nồng độ 1, 3, 5 mg/l).
• Thí nghiệm 5: Khảo sát kết hợp auxin 2,4-D và cytokinin BA (7 tổ hợp tỷ lệ khác nhau).
• Thí nghiệm 6: Khảo sát nồng độ đường saccharose (2%, 3%, 4%, 6%). Quy định rõ công thức tính các tỷ lệ phần trăm mẫu nhiễm, mẫu chết, tỷ lệ tạo mô sẹo và tiêu chuẩn đánh giá mô sẹo tốt - trung bình - kém.

Phần 4: Kết quả và thảo luận

Trình bày toàn bộ số liệu thu thập, bảng biểu và phân tích sinh học cho 6 thí nghiệm thực nghiệm:

1. Khử trùng đơn bằng HgCl2 0,1%: Mức thời gian 12 phút cho hiệu quả cao nhất với tỷ lệ mẫu sống không nhiễm đạt 65,11%. Thời gian ngắn (7 - 10 phút) dẫn đến tỷ lệ nhiễm cao (50,78% - 60,45%) do hóa chất chưa tiêu diệt hết bào tử nấm khuẩn. Kéo dài lên 15 phút làm tăng tỷ lệ mẫu chết lên 29,63% do ion Hg2+ ngấm sâu gây độc tế bào thực vật.
2. Khử trùng kép bằng HgCl2 0,1% kết hợp Ca(OCl)2 15%: Xử lý mẫu với HgCl2 0,1% trong 12 phút, sau đó bóc thêm lớp bẹ và khử trùng tiếp bằng Ca(OCl)2 15% trong 20 phút đã nâng tỷ lệ mẫu sống không nhiễm lên 81,33%, tỷ lệ nhiễm giảm mạnh còn 8,46%, tỷ lệ chết là 10,21%. Tăng thời gian Ca(OCl)2 lên 30 - 40 phút khiến mô bị cháy, tỷ lệ chết tăng vọt lên 49,16% và 71,05%.
3. Ảnh hưởng của 2,4-D: Nồng độ 1,0 mg/l cho tỷ lệ tạo mô sẹo cao nhất (61,12%), mô sẹo chắc, màu vàng nhạt. Không bổ sung chất kích thích (đối chứng) không hình thành mô sẹo (0%). Tăng nồng độ lên 6,0 mg/l làm giảm tỷ lệ mô sẹo còn 25,12%, mô sẹo chuyển màu nâu mềm do ức chế sinh trưởng.
4. Ảnh hưởng của NAA và IAA: Cặp nồng độ NAA 5 mg/l kết hợp IAA 5 mg/l cho hiệu quả tạo mô sẹo cao nhất trong thí nghiệm này (đạt 59,14% theo bảng số liệu, mô sẹo to, chắc, màu vàng nhạt). So với 2,4-D, nhóm auxin này đòi hỏi nồng độ cao hơn mới đạt hiệu quả tương đương do auxin tự nhiên và dẫn xuất tổng hợp yếu kém bền hơn trong môi trường.
5. Ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp BA: Tổ hợp phối hợp auxin và cytokinin cho hiệu quả vượt trội. Công thức bổ sung 2,4-D (1 mg/l kết hợp BA 0,5 mg/l hoặc 2,4-D 0,5 mg/l kết hợp BA 1 mg/l) kích thích mô sẹo phát sinh sau 2 tuần nuôi cấy, đạt tỷ lệ tạo mô sẹo từ 76,15% đến 79,89%, khối mô sẹo đồng nhất, chắc, có màu vàng sáng. Mẫu cấy ở công thức đối chứng (0 mg/l) hoặc chỉ có BA đơn lẻ (1 mg/l) không tạo mô sẹo mà chỉ phát sinh chồi hoặc rễ.
6. Ảnh hưởng của hàm lượng đường saccharose: Nồng độ saccharose 3% (30 g/l) tối ưu hóa quá trình hình thành mô sẹo với tỷ lệ đạt 50,27%, mô sẹo phát triển phình to, màu vàng nhạt hoặc xanh. Khi tăng hàm lượng đường lên 4% và 6%, tỷ lệ tạo mô sẹo giảm lần lượt còn 32,12% và 23,45%, mô cấy bị hóa nâu và nhầy do nồng độ đường cao gây hiện tượng stress áp suất thẩm thấu.

Phần 5: Kết luận và kiến nghị

Tổng kết các thông số kỹ thuật tối ưu đã chứng minh bằng thực nghiệm: quy trình khử trùng kép (HgCl2 0,1% trong 12 phút kết hợp Ca(OCl)2 15% trong 20 phút), môi trường cảm ứng mô sẹo tối ưu (MS + 2,4-D 0,5 mg/l + BA 1 mg/l + 30 g/l đường saccharose + 7 g/l agar + 100 ml/l nước dừa). Đề xuất 4 hướng nghiên cứu nối tiếp nhằm hoàn thiện quy trình nhân giống hoàn chỉnh cho cây gừng Núi đá.

---

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đã cung cấp hệ thống số liệu thực nghiệm đầy đủ về các chỉ tiêu vô trùng mẫu cấy và cảm ứng mô sẹo của cây gừng Núi đá (Zingiber sp.). Dưới đây là các bảng số liệu chi tiết được trích xuất từ văn bản:

Bảng 1: Ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1% đến hiệu quả khử mẫu cấy

Công thức	Thời gian (phút)	Tổng số mẫu (mẫu)	Tỷ lệ mẫu sống nhiễm (%)	Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm (%)	Tỷ lệ mẫu chết (%)
CT1	7	30	60,45a	36,30c	3,25d
CT2	10	30	50,78b	45,01b	4,21c
CT3	12	30	29,02c	65,11a	5,87b
CT4	15	30	20,63d	47,08b	29,63a
LSD05			4,80	4,08	0,75
CV%			3,70	4,50	3,70

(Ghi chú: Các chữ cái a, b, c, d biểu thị sai khác có ý nghĩa thống kê ở mức $\alpha < 0,05$)

Bảng 2: Ảnh hưởng của kết hợp HgCl2 0,1% và Ca(OCl)2 15% đến hiệu quả khử trùng mẫu

Công thức	HgCl2 0,1% (phút)	Ca(OCl)2 15% (phút)	Tổng số mẫu (mẫu)	Tỷ lệ sống nhiễm (%)	Tỷ lệ sống không nhiễm (%)	Tỷ lệ chết (%)
CT1 (ĐC)	12	0	30	28,78	65,33c	5,89
CT2	12	10	30	22,15	69,80b	8,05
CT3	12	20	30	8,46	81,33a	10,21
CT4	12	30	30	8,34	42,50d	49,16
CT5	12	40	30	8,12	20,83e	71,05
LSD05					5,30
CV%					5,20

Bảng 3: Ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D đến khả năng tạo mô sẹo cây gừng Núi đá

Công thức	Nồng độ 2,4-D (mg/l)	Tổng số mẫu (mẫu)	Tỷ lệ tạo mô sẹo (%)	Chất lượng mô sẹo
CT1 (ĐC)	0	30	0,00	Không hình thành mô sẹo
CT2	0,5	30	56,34b	Mô sẹo tốt
CT3	1,0	30	61,12a	Mô sẹo tốt
CT4	2,0	30	42,08c	Mô sẹo tốt
CT5	3,0	30	38,56d	Mô sẹo trung bình
CT6	6,0	30	25,12e	Mô sẹo kém
LSD05			3,01
CV%			4,50

Bảng 4: Ảnh hưởng của nồng độ NAA và IAA đến khả năng tạo mô sẹo

Công thức	NAA (mg/l)	IAA (mg/l)	Tổng số mẫu (mẫu)	Tỷ lệ tạo mô sẹo (%)	Chất lượng mô sẹo
CT1	1	1	30	20,12	Kém
CT2	1	3	30	29,18	Trung bình
CT3	1	5	30	35,24	Trung bình
CT4	3	1	30	39,89	Tốt
CT5	5	1	30	42,87	Tốt
CT6	5	5	30	59,14	Tốt
CT7	3	3	30	45,56	Tốt
CT8	3	5	30	49,89	Trung bình
CT9	5	3	30	51,01	Trung bình
LSD05				3,02
CV%				3,70

(Lưu ý: Trong phần thảo luận trang 33 của khóa luận có đoạn tác giả ghi nhận công thức kết hợp 5 mg/l NAA + 5 mg/l IAA đạt 68,14%, trong khi bảng số liệu gốc 4.4 ghi nhận 59,14%)

Bảng 5: Ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D kết hợp với BA đến khả năng tạo mô sẹo

Công thức	2,4-D (mg/l)	BA (mg/l)	Số mẫu (mẫu)	Tỷ lệ mô sẹo (%)	Chất lượng mô sẹo
CT1	0	0	30	0,00	Không tạo mô sẹo (tạo chồi/rễ)
CT2	1	0	30	63,68c	Trung bình
CT3	0	1	30	0,00	Không hình thành mô sẹo
CT4	1	0,5	30	79,89a	Tốt
CT5	0,5	1	30	76,15b	Tốt
CT6	1	1	30	45,23d	Trung bình
CT7	5	5	30	12,50e	Kém
LSD05				2,90
CV%				4,00

(Lưu ý: Tại mục kết luận trang 37, tác giả ghi công thức MS + 0,5 mg/l 2,4-D + 1 mg/l BA đạt 79,89%, trong khi ở bảng 4.5 công thức 2,4-D 1 mg/l + BA 0,5 mg/l đạt 79,89% và công thức 2,4-D 0,5 mg/l + BA 1 mg/l đạt 76,15%)

Bảng 6: Ảnh hưởng của hàm lượng đường saccharose đến khả năng tạo mô sẹo

Công thức	Đường saccharose (%)	Tổng số mẫu (mẫu)	Tỷ lệ mô sẹo (%)	Chất lượng mô sẹo
CT1	2	30	45,32b	Trung bình
CT2	3	30	50,27a	Tốt
CT3	4	30	32,12c	Kém
CT4	6	30	23,45d	Kém
LSD05			3,35
CV%			4,70

Đóng góp của tác giả:

• Đây là một trong những công trình thực nghiệm đầu tiên giải quyết vấn đề khử trùng và tạo mô sẹo in vitro chuyên biệt cho loài gừng Núi đá (Zingiber sp.) - nguồn gen quý hiếm bản địa vùng núi đá Lạng Sơn.
• Tác giả đã xây dựng được quy trình khử trùng kép hai bước kết hợp HgCl2 0,1% và Ca(OCl)2 15%, giải quyết được tình trạng nhiễm nấm khuẩn nội sinh nặng nề của các mẫu mầm củ dưới đất, nâng tỷ lệ mẫu sạch lên trên 81%.
• Chứng minh được tính ưu việt của việc phối hợp giữa auxin tổng hợp mạnh (2,4-D) và cytokinin (BA) trong việc cảm ứng mô sẹo chắc, màu vàng sáng đồng nhất, mở đường cho các bước nuôi cấy huyền phù tế bào và tái sinh chồi sau này.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu:

• Đề tài được thực hiện trong khung thời gian thực tập tốt nghiệp 6 tháng nên tác giả chỉ dừng lại ở bước khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành mô sẹo sơ cấp (primary callus).
• Chưa tiến hành khảo sát các chu kỳ cấy chuyển duy trì mô sẹo qua nhiều thế hệ (subculture) để đánh giá sự biến tính tế bào hoặc hiện tượng hóa nâu mô sẹo khi nuôi cấy kéo dài.
• Chưa đi sâu vào giai đoạn cảm ứng tái sinh cơ quan (phát sinh chồi và ra rễ) để thu nhận cây con hoàn chỉnh đưa ra vườn ươm đánh giá tỷ lệ sống ngoài đất.
• Chưa có điều kiện phân tích định lượng thành phần sinh hóa hoặc hàm lượng các hợp chất thứ cấp (gingerol, tinh dầu) tích lũy trong khối mô sẹo in vitro.

Hướng nghiên cứu tiếp theo (theo kiến nghị của tác giả):

1. Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy (cường độ ánh sáng, nhiệt độ, quang chu kỳ) và một số chất dinh dưỡng thiết yếu đến sự sinh trưởng của mô sẹo gừng Núi đá in vitro.
2. Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy và các tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng đến sự phát sinh hình thái (tạo chồi, tạo rễ) từ mô sẹo cây gừng Núi đá.
3. Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sự tích lũy các hợp chất thứ cấp trong sinh khối mô sẹo gừng Núi đá in vitro.
4. Xây dựng và hoàn thiện quy trình tái sinh cây gừng Núi đá hoàn chỉnh từ mô sẹo trong điều kiện in vitro phục vụ công tác bảo tồn nguồn gen và sản xuất giống.

---

Giá trị tham khảo

Báo cáo khóa luận có giá trị tham khảo chuyên môn đối với sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu thuộc các chuyên ngành Công nghệ sinh học thực vật, Nông học, Lâm nghiệp và Dược học:

• Tham khảo quy trình xử lý vô trùng mẫu ngầm dưới đất: Phần phương pháp xử lý mẫu củ ngầm bằng kỹ thuật bóc lớp bẹ kết hợp hai giai đoạn HgCl2 0,1% (12 phút) và Ca(OCl)2 15% (20 phút) là tài liệu tham khảo thực nghiệm giá trị cho những ai làm việc với các loài củ, rễ khó xử lý vô trùng thuộc họ Gừng (Zingiberaceae), họ Ráy (Araceae) hoặc các loài dược liệu lấy củ trong tự nhiên.
• Dữ liệu so sánh hoạt tính auxin: Bộ số liệu thực nghiệm so sánh đối chứng giữa 2,4-D (auxin nhân tạo mạnh) với cặp phối hợp NAA + IAA giúp người làm nghiên cứu nắm rõ ngưỡng nồng độ cảm ứng tạo mô sẹo trên cây một lá mầm (monocots).
• Thông số kỹ thuật về áp suất thẩm thấu: Thí nghiệm về gradient nồng độ saccharose (2% đến 6%) cung cấp minh chứng thực nghiệm rõ ràng về ngưỡng ức chế sinh trưởng tế bào do mất cân bằng áp suất thẩm thấu trong môi trường khoáng MS.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Quy trình vô trùng nào đem lại tỷ lệ mẫu mầm chồi gừng Núi đá sống không nhiễm cao nhất trong nghiên cứu?
Phương pháp khử trùng kép kết hợp hai hóa chất cho hiệu quả cao nhất: Mầm chồi (3 - 4 cm) sau khi rửa xà phòng và nhúng cồn 70° (1 phút) được khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong 12 phút, sau đó rửa nước cất vô trùng, tách bỏ 2 - 3 lớp vỏ ngoài rồi tiếp tục khử trùng bằng Ca(OCl)2 15% trong 20 phút. Quy trình này giúp tỷ lệ mẫu sống không nhiễm đạt 81,33%, tỷ lệ mẫu nhiễm giảm xuống 8,46% và tỷ lệ chết là 10,21%.

2. Vì sao việc nâng nồng độ 2,4-D lên mức 6 mg/l lại làm giảm tỷ lệ và chất lượng mô sẹo gừng Núi đá?
Theo kết quả thí nghiệm 3, ở nồng độ 2,4-D 1 mg/l, tỷ lệ tạo mô sẹo đạt đỉnh 61,12% với chất lượng mô sẹo tốt (màu vàng nhạt, chắc). Khi tăng nồng độ lên 6 mg/l, tỷ lệ tạo mô sẹo giảm mạnh còn 25,12%, khối mô chuyển sang màu nâu và mềm (chất lượng kém). Điều này xảy ra do 2,4-D là chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin tổng hợp có hoạt tính sinh học rất mạnh; ở nồng độ quá cao, chất này gây độc tế bào, ức chế quá trình phân chia và làm rối loạn trao đổi chất của mô cấy.

3. Tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng nào cho hiệu quả cảm ứng tạo mô sẹo cao nhất và mô sẹo có đặc điểm hình thái ra sao?
Sự phối hợp giữa auxin 2,4-D và cytokinin BA đem lại hiệu quả tạo mô sẹo cao nhất. Cụ thể, môi trường MS bổ sung tổ hợp 2,4-D và BA (ở tỷ lệ 1 mg/l 2,4-D + 0,5 mg/l BA hoặc 0,5 mg/l 2,4-D + 1 mg/l BA) cho tỷ lệ tạo mô sẹo đạt từ 76,15% đến 79,89%. Mô sẹo thu được có chất lượng tốt: mô chắc, màu vàng nhạt hoặc vàng sáng, phình to đồng nhất và các tế bào có dạng rời, không bị hóa nâu.

4. Tại sao nồng độ đường saccharose ở mức 4% - 6% lại gây tác động tiêu cực đến mô cấy gừng Núi đá?
Đường saccharose ở nồng độ 3% là tối ưu (đạt tỷ lệ tạo mô sẹo 50,27%). Khi tăng nồng độ lên 4% và 6%, tỷ lệ tạo mô sẹo sụt giảm xuống còn 32,12% và 23,45%, mô sẹo chuyển màu trắng nhầy hoặc hóa nâu. Nguyên nhân là do trong môi trường MS vốn có nồng độ muối khoáng cao, việc bổ sung đường ở mức trên 4% làm tăng đáng kể áp suất thẩm thấu của môi trường dinh dưỡng, gây hiện tượng stress thẩm thấu, cản trở sự hấp thu nước và dinh dưỡng của tế bào, dẫn tới ức chế phân chia tế bào.

5. Mẫu chồi mầm khi nuôi cấy trên môi trường đối chứng không có chất điều hòa sinh trưởng phản ứng như thế nào?
Ở công thức đối chứng không bổ sung auxin và cytokinin (0 mg/l), mẫu cấy hoàn toàn không có khả năng hình thành mô sẹo (tỷ lệ 0%). Thay vào đó, sau thời gian nuôi cấy, các mầm chồi này chỉ phát triển kéo dài tự nhiên để hình thành chồi non hoặc ra rễ do tác động của lượng hormone nội sinh có sẵn trong mô đỉnh sinh trưởng.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Triệu Minh Huệ đã xác lập thành công các thông số kỹ thuật then chốt cho quy trình khử trùng và tạo mô sẹo cây gừng Núi đá (Zingiber sp.) trong điều kiện in vitro. Nghiên cứu chỉ ra rằng quy trình khử trùng kép phối hợp HgCl2 0,1% (12 phút) và Ca(OCl)2 15% (20 phút) giúp thu nhận vật liệu vô trùng sạch bệnh với tỷ lệ sống đạt 81,33%. Môi trường tối ưu cho quá trình cảm ứng mô sẹo đạt chất lượng tốt là môi trường MS bổ sung phối hợp 2,4-D (0,5 - 1,0 mg/l) cùng BA (0,5 - 1,0 mg/l), kết hợp 3% đường saccharose, 7 g/l agar và 100 ml/l nước dừa trong điều kiện nuôi tối ở 25 ± 2°C. Các kết quả này cung cấp cơ sở dữ liệu thực nghiệm quan trọng, phục vụ công tác bảo tồn nguồn gen quý hiếm và định hướng cho các nghiên cứu vi nhân giống, nhân sinh khối dược liệu gừng Núi đá tiếp theo.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Gừng (Zingiber officinable Roscoe.) là một loại cây thân thảo, lấy củ, sống lâu năm được sử dụng nhiều trong công nghiệp thực phẩm và thảo dược [32]. Chúng được trồng phổ biến ở hầu hết các nước nhiệt đới như Ấn Độ, Bangladet, Jaiwan, Jamaica, Nigieria, Indonesia, Ceylon, Sierraleone, Australia, Trung Quốc và Nhật Bản [21], gồm hơn 1200 loài cây thuộc 53 chi. Chi Zingiber gồm 85 loài thảo mộc thơm từ Đông Á và vùng nhiệt đới Australia [19]. Bộ phận chính được sử dụng là củ gừng (thân rễ, rhizome) [17].

Gừng có vị cay, thơm rất giàu các hợp chất thứ cấp như nhựa dầu, dẫn xuất phenol, zingiberene, gingerol [33]. Trong các phương pháp chữa bệnh truyền thống thường được sử dụng để điều trị bệnh đau đầu, buồn nôn, cảm lạnh, viêm khớp, thấp khớp, nhức mỏi cơ bắp, và viêm [20]. Ở Ấn Độ và Trung Quốc thời cổ xưa đã sử dụng gừng điều trị bệnh trên người và gia súc [47]. Trong công nghiệp thực phẩm, gừng được sử dụng để tạo hương vị trong sản xuất một số sản phẩm như bánh kẹo, trà, mứt, nước giải khát,…[17] Gừng thường được nhân giống bằng củ, nhưng hệ số nhân rất thấp.

Năng suất gừng không cao do nhiễm vi khuẩn gây héo (Pseudomonas solanacearum), thối rễ (Pythium aphanidermatum) và tuyến trùng (Meloidgyne spp. Những bệnh này sẽ truyền qua củ giống vào năm sau, do vậy sản xuất những dòng sạch bệnh với tỷ lệ nhân giống cao là cần thiết để có được vụ mùa với năng suất cao [50]. Đã có khá nhiều nghiên cứu về cây gừng trên thế giới như vi nhân giống [31], nuôi cấy cơ quan [34], phát sinh phôi soma [41], phát sinh cơ quan [38], nuôi cấy tế bào trần, bảo tồn phôi và một số nghiên cứu khác. Tuy nhiên, chưa có nhiều nghiên cứu về cây gừng Núi đá – một loại cây bản địa, quý và hiếm.

Theo quyết định 80/2005/QĐ - BNN về danh mục các nguồn gen quý hiếm cần được bảo tồn do Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ban hành ngày 05/12/2005, gừng Núi đá là một trong những loài cây quý hiếm cần bảo tồn. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “ Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng tạo mô sẹo cây gừng Núi đá (Zingiber sp.) trong điều kiện in vitro”. Mục đích của đề tài - Nghiên cứu phương pháp khử trùng thích hợp để tạo vật liệu sạch phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo. - Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng tạo mô sẹo cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro.

Yêu cầu của đề tài - Xác định ảnh hưởng của phương pháp khử trùng (thời gian khử trùng, phương pháp khử trùng) đến khả năng tạo vật liệu sạch phục vụ cho tạo mô sẹo cây gừng Núi đá. - Xác định ảnh hưởng của hàm lượng đường saccharose đến khả năng tạo mô sẹo cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro. - Xác định ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tạo mô sẹo cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 1.

Ý nghĩa khoa học - Sự thành công của đề tài cùng với những nghiên cứu của các tác giả khác sẽ tạo ra được quy trình nhân giống phù hợp cho cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro và phục vụ các nghiên cứu chiết xuất các hợp chất hóa học quan trọng của gừng nói chung và gừng Núi đá nói riêng. - Là cơ sở cho các nghiên cứu khoa học khác. Ý nghĩa thực tiễn - Cung cấp số lượng cây gừng Núi đá trong tự nhiên góp phần bảo tồn nguồn gen quý hiếm và khai thác triệt để những giá trị kinh tế và dược liệu của chúng. 3 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.

Tổng quan về gừng núi đá 2. Phân loại Theo hệ thống thực vật học mới nhất cây gừng Núi đá được phân loại như sau [15]: Giới : Plantae Ngành : Magnoliophyta Lớp : Liliopsida Họ : Zingiberaceae Bộ : Zingiberales Chi : Zingiber Loài : Zingiber sp. Tên Việt Nam : Gừng Núi đá Tên khoa học : Zingiber sp. Tên khác : Gừng đá, gừng Núi đá.

Tiếng Tày gọi là khing phia. Đặc điểm phân bố Gừng là một trong những loài cây trồng phổ biến khắp thế giới, có nguồn gốc từ trung tâm Châu Á, được trồng ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Chúng đã trở thành cây trồng kinh tế cho nông dân ở Châu Mỹ La - tinh, Châu Phi và Đông Nam Á. Gần 50% sản lượng gừng thu hoạch xuất xứ từ Ấn Độ, một phần từ Châu Phi, Brazil, Jamica.

Trong vùng Đông Nam Á, Trung Quốc là nước có diện tích trồng gừng cao nhất (50.000 ha), kế đến là Thái Lan, Hàn Quốc và Việt Nam [47]. Ở Việt Nam, gừng được trồng từ rất lâu đời, ở khắp mọi nơi trên khắp các địa phương từ Bắc vào Nam [9]. Tuy nhiên, gừng chỉ được trồng rải rác ở trong các vườn hộ gia đình [2]. Gừng Núi đá phân bố ở một số tỉnh như Lạng Sơn, Nà Rì, Bắc Cạn, Cao Bằng, Hà Giang, Tây Bắc và miền Trung Tây Nguyên, Khánh Hòa, Gia Lai, Đắc Lắc, cây mọc tự nhiên trên các vùng núi đá, mọc xen trong đá, ở các bờ suối nơi ẩm mát - dưới tán rừng già , cây thường phát triển theo cụm (5,6 thân).

Tên gừng Núi đá bắt nguồn từ nơi chúng có khả năng sống và phát triển tốt nhất. Loại gừng này thường mọc ở những dãy núi đá cao khoảng trên 1m, củ bằng đốt ngón tay, có mùi vị thơm rất lạ lùng giống mùi bọ xít. Đặc tính sinh học Gừng là cây thân thảo, đa niên, cao từ 50 - 100 cm tùy theo đất, có nơi cao hơn 150 cm. Chúng phát triển thân ngầm dưới đất, có nhiều đốt, mỗi đốt có mầm ngủ, khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ đâm chồi thành cây.

Bẹ lá ôm sát nhau phát triển thành thân giả trên mặt đất. Lá đơn mọc cách (so le), lá trơn, không có cuống, hình lưỡi mác, mặt bóng nhẵn, mép lá phẳng, gân giữa hơi trắng nhạt. Trục hoa mọc từ gốc (củ gừng), dài khoảng 20cm, hoa tự tạo thành bông, mọc sát nhau, hoa dài khoảng 5 cm, rộng khoảng 2 - 3cm, lá bắc hình trứng, mép lá màu vàng. Ðài hoa dài khoảng 1cm, có 3 rãnh ngắn, có 3 cánh hoa, màu vàng hơi nhạt, mép cánh hoa màu tím, nhị hoa cũng màu tím [18].

Tuy nhiên, ở nước ta gừng trồng ít khi ra hoa hoặc chưa ra hoa đã thu hoạch củ để bán [12]. Gừng là một loại cây ưa ấm. Sinh trưởng thích hợp ở những vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới,… Nhiệt độ thích hợp là 25 - 300C, khả năng sinh trưởng giảm nếu nhiệt độ thấp hơn 240C và cao hơn 300C. Gừng phát triển tốt trong điều kiện đầy đủ ánh sáng, nhưng cũng có thể thích nghi với kỹ thuật trồng xen [21].

Môi trường tốt nhất cho chúng sinh trưởng là pH = 5,5 – 6,5. Gừng thường được trồng vào khoảng tháng 3 hằng năm, có thể thu hoạch từ tháng 12 đến tháng 5 năm sau. Tuy nhiên chất lượng gừng giảm nếu như thu hoạch quá muộn vào khoảng tháng 5. Sẽ làm giảm thẩm mĩ của gừng so với gừng thu sớm.

Sau khi trồng phải mất khoảng 6 tuần thì chúng mới bắt đầu nảy mầm. Từ đó chúng bắt đầu sinh trưởng tối đa cho đến khi ra hoa. Sự hình thành hoa đánh dấu sự trưởng thành của củ và bắt đầu tăng hàm lượng chất xơ trong củ [21]. Về đặc điểm sinh học của gừng Núi đá hiện này vẫn chưa có những nghiên cứu chính thức về chúng.

Dưới đây là một số hình ảnh mô tả : 5 Hình 1. Một số hình ảnh mô tả đặc điểm hình thái cây gừng Núi đá 6 2. Thành phần hóa học Trong gừng có chứa hơn 400 chất khác nhau gồm 2 - 3% tinh dầu (Zingerberen, D -camphen), 3 - 5% chất nhựa cay như zingerol, Shogaol, chất béo, vitamin, khoáng (K, Ca, Fe, Zn,…). Những hợp chất hóa học quan trọng quyết định khả năng chữa bệnh của gừng được chia làm hai nhóm là nhóm dễ bay hơi và không bay hơi.

Nhóm hợp chất dễ bay hơi gồm oleoresin (nhựa dầu). Đây là yếu tố quyết định cho gừng có khả năng làm gia vị, trong đó chủ yếu là gingerol [46]. Những hợp chất hóa học có trong tinh dầu gừng được thể hiện trong bảng 1. Thành phần hóa học trong tinh dầu gừng Tinh dầu gừng Tinh dầu gừng khô Thành phần RI tươi (%) (%) Hexanal 770 0,1 T Hexanol 858 0,0 T Ο – xylene 884 <0,1 - Amyl acetate 895 <0,1 - α – pinene 943 0,1 0,3 Camphene 954 4,0 1,0 Heptanol 957 0,2 - Sabinene 976 3,0 0,8 β – pinene 981 1,6 0,6 Myrcene 986 0,0 2,1 6-methyl-5-hepten-2-one 994 0,9 - 1,8-cineol 1027 2,4 1,7 Limonene 1030 1,9 1,0 (E)-β-ocimene 1038 1,3 - γ-terpinene 1057 0,8 - Trans-linalool oxide 1092 0,1 - (furanoid) Undecane 1100 0,4 0,2 Camphor 1136 0,2 - Menthone 1143 0,2 - Borneol 1157 1,2 0,5 Terpinen-4-ol 1170 0,2 0,1 Menthol 1171 <0,1 T γ-terpineol 1185 1,3 0,5 Decanal 1188 0,3 T Nerol 1218 0,4 0,2 Neral 1227 1,8 T Geraniol 1243 1,8 0,5 Geranial 1252 8,5 4,4 Trans-carvone oxide 1260 0,6 0,4 7 Bornyl acetate 1268 0,2 Tr 2-undecanote 1276 0,1 Tr Undecanal 1284 0,2 - β- cubebene 1359 - 240 α- copaene 1373 - 1,50 Geranyl acetate 1367 0,1 - γ- elemene 1382 0,5 1,30 β- elemene 1403 0,4 1,00 β- caryophyllene 1418 - 1,40 Α- bergamotene 1436 1,3 1,90 β- farnesene 1448 0,1 1,50 Germacrene-D 1469 1,3 4,20 γ- muurolene 1477 1,2 3,40 Ar- curcurmene 1474 5,6 11,0 α- muurolene 1490 1,0- 2,20 Zingiberene 1487 28,6 30,3 β- bisabolene 1504 5,8 7,20 β- sesquiphellandrene 1516 2,5 6,60 γ- cadinene 1523 2,2 3,50 (Z)- nerolidol 1524 1,5 0,20 Elemol 1540 1,2 0,20 (E)- nerolidol 1553 1,4 1,20 Eudesma- 3,7(11)diene 1542 - 0,20 Cubernol 1560 - 0,20 β- guiacol 1598 - T Epi- α- cedrenol 1609 - T Sesquisabinene hydrate 1605 0,1 - Zingibernol 1620 0,1 - Zingernone 1625 0,6 - α- murrolol 1630 0,2 T β- eusdesmol 1650 0,1 - β- bisabolol 1659 0,3 0,30 β- eudesmol 1660 0,5 - Z- α- bergamotol 1692 0,0 0,10 (Z,Z)farnesol 1693 0,1 0,10 (Z,E)farnesol 1699 0,6 - α- eusdesmol 1701 1,4 - (E,Z)- farnesol 1718 0,2 - (E,E)- farnesol 1749 <0,1 0,10 (Z)- lanceol 1763 - 0,10 Tổng 92,2 92,3 Tổng các thành phần oxygenase 29,2 14,4 Tổng các thành phần hydrate 63 77,9 Nguồn: Sasid tharan et al.

Tác dụng Gừng (Zingiber officinale Roscoe.) đã được sử dụng làm dược phẩm từ thời cổ xưa. Trong y học thực nghiệm ở Đông Nam Á, gừng khô được sử dụng trong điều trị chứng khó tiêu, tiêu chảy và buồn nôn. Cả chống oxy hóa và hoạt động androgenic của Z. Officinale đã được báo cáo trên các mô hình động vật.