Đặt vấn đề Hoa mười giờ (Portulaca grandiflora) là cây thân thảo thuộc họ rau sam, mặc dù là một loài cây thân thảo phổ biến và dễ trồng nhưng chính nhờ tính đa dạng và màu sắc sặc sỡ mà loài cây này mới giúp tôn lên vẻ đẹp của những khu vườn hay khuôn viên, đặc biệt là lúc hoa nở rộ. Nuôi cấy in vitro hoa mười giờ để khảo sát điều kiện sinh sống của hoa mười giờ trong ống nghiệm khác thế nào so với điều kiện bên ngoài, ở bên ngoài môi trường tự nhiên hoa mười giờ rất dễ trồng và thời gian phát triển cũng khá nhanh nhưng khi tiến hành nuôi cấy in vitro mất khá nhiều thời gian thì mục đích chính là khảo sát tập tính cũng như điều kiện sống của hoa mười giờ. Đây là loài cây thân có nhiều lông nhỏ gây khó khăn trong việc tạo nguồn mẫu vô trùng. Đó là những bước nghiên cứu ban đầu làm tiền đề cho việc nghiên cứu nuôi cấy hoa mười giờ ra hoa trong ống nghiệm là một loại hình được khá nhiều người ưa thích vì nhìn rất đẹp, có thể kinh doanh được, không phải chăm sóc như hoa ngoài tự nhiên mà cây vẫn tươi tốt.
Hoa mười giờ chính là đồng hồ sinh học vì cứ khoảng 8 – 10 giờ sáng là hoa nở rộ, nghiên cứu này cũng để khảo sát vấn đề này xem vì sao hoa mười giờ lại có tập tính này, cũng như hoa quỳnh nở vào lúc 12 giờ đêm, đó chính là điều đặc biệt của loài cây này nhưng khi nuôi cấy trong ống nghiệm với điều kiện không có oxy cây vẫn phát triển tốt nhưng để cây ra hoa và nở cả ngày là điều không dễ chút nào vì nó phá vỡ quy luật tự nhiên của cây, đó là cứ 8 – 10 giờ cây mới cho hoa nở. Đây là vấn đề cần phải nghiên cứu khá lâu và mất nhiều thời gian. Là loài cây rất phổ biến và dễ trồng nên nó có giá trị kinh tế không cao khi chưa tiến hành nuôi cấy in vitro. Đây là bước đầu khai thác giá trị kinh tế của loài cây này, mặc dù khá phổ biến nhưng đây cũng là một loại thuốc nam rất công dụng cùng với một số cây thuốc khác trong họ của nó như loài rau sam rất tốt cho sức khỏe.
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 1 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh 1. Mục đích và yêu cầu 1. Mục đích Nghiên cứu khả năng nuôi cấy mô cây hoa mười giờ nhằm tạo nguồn mẫu vô trùng ban đầu để cung cấp mẫu thực hiện các nghiên cứu tiếp theo là ra hoa trong ống nghiệm.
Yêu cầu Phải đưa được mẫu vào để tạo mẫu vô trùng, khảo sát mẫu ban đầu ở các môi trường bổ sung chất điều hòa tăng trưởng SVTH: Trần Thị Thu Hiền 2 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh Chương 2: Tổng quan 2. Khái quát về kỹ thuật vi nhân giống 2. Khái niệm Kỹ thuật nhân giống in vitro hay nuôi cấy mô và tế bào thực vật đều là thuật ngữ mô tả các phương pháp nuôi cấy các cơ quan của thực vật trong ống nghiệm có chứa môi trường dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, đường và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong điều kiện vô trùng (Dương Công Kiên, 2002).
Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật cho phép tái sinh chồi hoặc cơ quan từ các mô như lá, thân, hoa, rễ, củ hoặc đỉnh sinh trưởng. Trước kia người ta dùng phương pháp này để nghiên cứu các đặc tính cơ bản của tế bào như sự phân chia, đặc tính di truyền và ảnh hưởng của các hóa chất đối với tế bào và mô trong quá trình nuôi cấy. Những năm 70 của thế kỷ XX là thập niên của sự bùng nổ công nghệ sinh học thực vật, đặc biệt là kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Nó là công cụ nghiên cứu của rất nhiều nhà khoa học.
Điều quan trọng nhất trong vi nhân giống là việc nghiên cứu vai trò và tác động của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật nhằm kích thích sự hình thành chồi với số lượng lớn phục vụ cho công tác nhân giống. Trong vòng 30 năm trở lại đây, kỹ thuật vi nhân giống đã làm được một cuộc cách mạng lớn trong nhân giống thực vật và hiện nay người ta đang hướng tới mục tiêu áp dụng kỹ thuật này để sản xuất cây giống thương mại. Vi nhân giống đã trở thành một phương pháp nhân giống chuẩn và phổ biến đối với nhiều loại cây trồng như: cây công nghiệp, cây lâm nghiệp, cây cảnh, cây dược liệu, cây ăn trái và rau xanh. Phương pháp này có những ưu điểm vượt trội so với phương pháp truyền thống: SVTH: Trần Thị Thu Hiền 3 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN.
Bùi Văn Thế Vinh Có khả năng tái sinh cây con từ các vùng mô và cơ quan khác nhau của cây (trục thân, lóng thân, phiến lá, cuống lá, hoa, chồi phát hoa, hạt phấn) mà ngoài tự nhiên không thể thực hiện được. Có thể sản xuất được số lượng lớn cây giống trong một thời gian ngắn, trên một diện tích nhỏ nhằm đáp ứng nhu cầu thương mại. Cây con tạo ra đồng nhất về mặt di truyền. Tạo cây sạch virus thông qua xử lý nhiệt hay nuôi cấy đỉnh sinh trưởng.
Sản xuất quanh năm và chủ động kiểm soát được các yếu tố ngoại cảnh như nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm,… Bảo quản nguồn giống cây in vitro với số lượng lớn nhưng lại chiếm diện tích rất nhỏ. Tạo cây có khả năng ra hoa, tạo quả sớm. Tạo dòng toàn cây cái (cây chà là) hoặc toàn đực (cây măng tây) theo mong muốn. Dễ dàng tạo giống cây trồng mới bằng phương pháp chuyển gen.
Bên cạnh những ưu điểm nổi bật thuận lợi cho mục đích nhân giống như đã được đề cập ở trên thì phương pháp vi nhân giống cũng có những nhược điểm cần phải được khắc phục: Giá thành cây con được sản xuất từ kỹ thuật vi nhân giống còn khá cao. Tiến trình nhân giống phức tạp gồm nhiều giai đoạn liên quan và cần khoảng thời gian dài trước khi có thể thích ứng trồng ngoài vườn ươm. Sự đa dạng của dòng sản phẩm nhân giống rất hạn chế, nghĩa là cây con tạo ra thường ít đồng nhất về mặt kiểu hình. Có thể xảy ra đột biến do tác dụng của các chất điều hòa sinh trưởng được bổ sung vào môi trường nuôi cấy.
Hiện nay, vấn đề đáng quan tâm nhất trong việc áp dụng kỹ thuật vi nhân giống vào sản xuất thương mại là giá thành sản phẩm tạo ra còn quá cao. Theo Kozai và cộng sự (1992), nguyên nhân chính của vấn đề này là sự thất thoát do nhiễm khuẩn và nấm trong quá trình nuôi cấy, tỷ lệ sống sót thấp của cây SVTH: Trần Thị Thu Hiền 4 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh trong giai đoạn chuyển ra vườn ươm, giá nhân công lao động chiếm 60 – 70% tổng giá thành sản phẩm cần thiết trong quá trình cấy chuyền mẫu cấy sang môi trường mới, giá thành trang thiết bị (thiết bị chiếu sáng, bình nuôi cấy,…) và nguyên liệu cơ bản (đường, agar,…) còn khá cao. Việc cấy chuyền lặp lại nhiều lần làm giảm đáng kể sức sinh trưởng và phát triển của thực vật, có khi còn làm tăng tính bất thường về di truyền của tế bào.
Tuy nhiên, hạn chế nghiêm trọng nhất trong kỹ thuật vi nhân giống là tỷ lệ sống sót của cây con sau khi chuyển ra vườn ươm thường rất thấp do sự khác biệt lớn giữa điều kiện môi trường in vitro và ex vitro. Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng bao gồm nuôi cấy chồi đỉnh và chồi bên. Sau khi vô trùng, mẫu sẽ được nuôi cấy trên môi trường thích hợp chứa đầy đủ chất dinh dưỡng khoáng vô cơ và hữu cơ hoặc môi trường khoáng có bổ sung chất kích thích sinh trưởng thích hợp. Từ một đỉnh sinh trưởng, sau một khoảng thời gian nuôi cấy nhất định mẫu sẽ phát triển thành một chồi hay nhiều chồi.
Chồi tiếp tục phát triển vươn thân, ra lá và rễ để trở thành một cây hoàn chỉnh. Cây con được chuyển ra đất dần dần thích nghi và phát triển bình thường. Nuôi cấy mô sẹo Mô sẹo là một khối tế bào phát triển vô tổ chức, hình thành do sự phản phân hóa của các tế bào đã phân hóa. Mô sẹo sẽ phát triển nhanh khi môi trường có sự hiện diện của auxin.
Khối mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong điều kiện môi trường không có chất kích thích tạo mô sẹo. Nuôi cấy mô sẹo được thực hiện đối với các loại thực vật không có khả năng nhân giống thông qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc tính giống như cây mẹ. Từ một cụm tế bào mô sẹo có thể tái sinh cùng một lúc nhiều chồi hơn là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tuy nhiên mức độ biến dị tế bào soma lại cao hơn.
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 5 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh Nuôi cấy tế bào đơn Khối mô sẹo được nuôi cấy trong môi trường lỏng và được đặt trên máy lắc có tốc độ điều chỉnh thích hợp sẽ tách ra thành nhiều tế bào riêng rẽ gọi là tế bào đơn. Tế bào đơn được lọc và nuôi cấy trên môi trường đặc biệt để tăng sinh khối. Với các cơ chất thích hợp được bổ sung vào trong môi trường tế bào có khả năng sản xuất các chất có hoạt tính sinh học.
Sau một thời gian nuôi cấy kéo dài trong môi trường lỏng tế bào đơn được tách ra và trải trên môi trường thạch. - Khi môi trường thạch có bổ sung auxin, tế bào đơn phát triển thành từng cụm tế bào mô sẹo. - Khi môi trường thạch có tỷ lệ cytokinin auxin thích hợp, tế bào đơn có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Nuôi cấy protoplast – chuyển gen Protoplast (tế bào trần) là tế bào đơn được tách lớp vỏ cellulose, có sức sống và duy trì đầy đủ các chức năng sẵn có.
Trong điều kiện nuôi cấy thích hợp, protoplast có khả năng tái sinh màng tế bào, tiếp tục phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh (tính toàn thế ở thực vật). Khi tế bào mất vách và tiến hành dung hợp, hai protoplast có khả năng dung hợp với nhau tạo ra tế bào lai, đặc tính này cho phép cải thiện giống cây trồng. Quá trình dung hợp protoplast có thể được thực hiện trên hai đối tượng cùng loài hay khác loài.