Nghiên cứu khả năng nuôi cấy tế bào Celatrus hindsii Benth và sinh tổng hợp terpenoid

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu công nghệ sinh học khảo sát khả năng nuôi cấy tế bào celatrus hindsii benth có khả năng sinh tổng, đánh giá hiện trạng, phân tích vấn đề, đề xuất biện

• Tác giả: Nguyễn Thị Thu Thủy
• Người hướng dẫn: PGS. Lê Thị Thủy Tiên
• Trường học: Đại học Bách Khoa - ĐHQG TP.HCM
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Khảo Sát Khả Năng Nuôi Cấy Tế Bào Celastrus Hindsii Benth Và Tổng Hợp Terpenoid
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: TP. Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CÁM ƠN
• TÓM TẮT LUẬN VĂN
• LỜI CAM ĐOAN
• DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• 1. CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Tính cấp thiết của đề tài
• 1.2. Mục tiêu nghiên cứu
• 1.3. Nội dung nghiên cứu
• 2. CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Cây Xạ Đen
• 2.1.1. Phân loại
• 2.1.2. Nguồn gốc và sự phân bố
• 2.1.3. Đặc điểm hình thái
• 2.1.4. Thành phần hóa học
• 2.1.5. Các nghiên cứu trong và ngoài nước
• 2.2. Giới thiệu về terpenoid
• 2.2.1. Sự phân bố terpenoid trong thực vật
• 2.2.2. Terpenoid và cấu trúc hóa học
• 2.2.3. Phân loại terpenoid
• 2.2.4. Sinh tổng hợp terpenoid
• 2.2.5. Dược tính của terpenoid
• 2.2.5.1. Kháng khuẩn
• 2.2.5.2. Kháng viêm và giảm đau
• 2.2.5.3. Ngăn chặn ung thư
• 2.2.6. Tác động của terpenoid đối với ung thư vú
• 2.2.6.1. Tổng quan về ung thư vú
• 2.2.6.2. Tác động của terpenoid với ung thư vú
• 2.3. Nuôi cấy mô sẹo thu nhận HCTN
• 2.3.1. Sự tạo mô sẹo
• 2.3.2. Nuôi cấy mô sẹo thu nhận HCTN
• 3. CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.2. Phương pháp nghiên cứu
• 3.2.1. Quy trình thí nghiệm chung
• 3.2.2. Khử trùng mẫu cấy
• 3.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng thực vật lên sự tạo mô sẹo
• 3.2.4. Khảo sát sự tăng sinh của mô sẹo
• 3.2.4.1. Ảnh hưởng của thành phần khoáng
• 3.2.4.2. Ảnh hưởng của nồng độ saccharose
• 3.2.4.3. Ảnh hưởng của ánh sáng
• 3.2.5. Trích ly và xác định sự hiện diện của terpenoid trong cao n-hexan của lá và mô sẹo được cảm ứng từ lá
• 3.2.5.1. Phương pháp ly trích
• 3.2.5.2. Định tính terpenoid trong cao n-hexan
• 3.2.6. Khảo sát khả năng gây độc tế bào đối với tế bào ung thư vú SK-BR-3 của cao chiết n-hexan từ lá và mô sẹo cảm ứng từ lá
• 3.2.6.1. Dòng tế bào ung thư vú và môi trường nuôi cấy
• 3.2.6.2. Phương pháp gây độc tế bào
• 3.2.6.3. Quy trình thực hiện
• 3.2.7. Khảo sát sự biểu hiện HER2 của tế bào SK-BR-3 sau khi ủ với cao chiết n-hexan từ lá trưởng thành ở nồng độ IC50 và cao chiết n-hexan từ mô sẹo ở cùng nồng độ
• 3.2.7.1. Kỹ thuật tách chiết RNA tổng số từ tế bào
• 3.2.7.2. Kỹ thuật Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) để tổng hợp cDNA
• 3.2.7.3. Khuếch đại cDNA của HER2 bằng PCR
• 3.2.8. Phương pháp xử lý số liệu
• 3.2.9. Địa điểm thực hiện luận văn
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ – THẢO LUẬN
• 4.1. Khảo sát sự ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng thực vật lên sự tạo mô sẹo
• 4.2. Khảo sát sự tăng sinh của mô sẹo
• 4.2.1. Ảnh hưởng của thành phần khoáng
• 4.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ saccharose
• 4.2.3. Ảnh hưởng của ánh sáng
• 4.3. Định tính terpenoid trong dịch chiết n-hexan chiết suất từ lá trưởng thành và mô sẹo
• 4.3.1. Định tính bằng phương pháp hoá học
• 4.3.2. Định tính bằng phương pháp sắc ký bản mỏng
• 4.4. Khảo sát khả năng gây độc tế bào đối với tế bào ung thư vú SK-BR-3 của cao chiết n-hexan từ lá trưởng thành và mô sẹo được cảm ứng trên môi trường MS1/2 và môi trường B5
• 4.5. Khảo sát sự biểu hiện HER2 của tế bào SK-BR-3 sau khi ủ với cao chiết n-hexan từ lá trưởng thành ở nồng độ IC50 và cao chiết n-hexan từ mô sẹo ở cùng nồng độ
• 4.5.1. Vai trò của auxin và cytokinin trên sự hình thành và tăng sinh của mô sẹo
• 4.5.2. Ảnh hưởng của nồng độ khoáng lên sự tăng sinh của mô sẹo
• 4.5.3. Ảnh hưởng của nồng độ saccharose lên sự tăng sinh của mô sẹo
• 4.5.4. Ảnh hưởng của ánh sáng lên sự tăng sinh của mô sẹo
• 4.5.5. Sự ức chế tế bào ung thư SK-BR-3
• 5. CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ

Tóm tắt

I. Giới thiệu về Celastrus hindsii

Cây Xạ Đen, hay còn gọi là Celastrus hindsii, là một loài thực vật thuộc họ Celastraceae, phân bố chủ yếu ở các tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam. Loài cây này không chỉ có giá trị về mặt dược liệu mà còn là nguồn nguyên liệu quý cho các nghiên cứu về hóa học tự nhiên. Theo nghiên cứu, cây Xạ Đen có khả năng sinh tổng hợp các hợp chất thuộc nhóm terpenoid, một nhóm hóa chất tự nhiên có nhiều ứng dụng trong y học. Việc khảo sát khả năng nuôi cấy tế bào của cây Xạ Đen nhằm thu nhận các hợp chất này là cần thiết, nhất là trong bối cảnh nhu cầu sử dụng sản phẩm từ thiên nhiên ngày càng gia tăng.

II. Khả năng nuôi cấy tế bào

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng khả năng nuôi cấy tế bào của Celastrus hindsii có thể được thực hiện thông qua việc sử dụng các môi trường nuôi cấy khác nhau. Mô sẹo được hình thành từ lá cây được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng như auxin và cytokinin. Kết quả cho thấy mô sẹo có khả năng tăng sinh tốt khi được nuôi trên môi trường có bổ sung BA và 2,4-D với tỉ lệ tạo sẹo đạt 100%. Điều này mở ra khả năng sản xuất hàng loạt các hợp chất terpenoid từ tế bào thực vật, góp phần vào việc phát triển công nghệ sinh học trong lĩnh vực dược liệu.

2.1. Điều kiện nuôi cấy

Các điều kiện nuôi cấy như nồng độ saccharose, ánh sáng và thành phần khoáng đã được khảo sát để tối ưu hóa sự tăng sinh của mô sẹo. Môi trường MS 1/2 và B5 được xác định là phù hợp nhất cho sự phát triển của mô sẹo, cho phép thu nhận các hợp chất có giá trị từ Celastrus hindsii.

III. Tổng hợp terpenoid

Việc tổng hợp các hợp chất terpenoid từ mô sẹo của cây Xạ Đen đã được thực hiện thành công. Nghiên cứu cho thấy rằng các terpenoid chiết xuất từ lá và mô sẹo có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư vú SK-BR-3. Cụ thể, dịch chiết từ lá có hàm lượng IC50 = 156 µg/ml, cho thấy tính khả thi trong việc phát triển các sản phẩm dược liệu từ cây Xạ Đen. Điều này không chỉ khẳng định giá trị của Celastrus hindsii trong y học mà còn mở ra hướng đi mới trong nghiên cứu và phát triển thuốc điều trị ung thư.

3.1. Ứng dụng trong y học

Sự hiện diện của các hợp chất terpenoid trong dịch chiết từ Celastrus hindsii cho thấy tiềm năng ứng dụng lớn trong điều trị ung thư. Nghiên cứu này có thể là nền tảng cho các nghiên cứu sâu hơn về tác động của các hợp chất tự nhiên đối với tế bào ung thư, mở ra cơ hội cho việc phát triển các phương pháp điều trị mới và hiệu quả hơn.

IV. Kết luận và triển vọng

Nghiên cứu về khả năng nuôi cấy tế bào Celastrus hindsii và tổng hợp terpenoid đã chỉ ra rằng việc ứng dụng công nghệ sinh học trong việc thu nhận các hợp chất tự nhiên là khả thi và cần thiết. Những phát hiện này không chỉ đóng góp vào kho tàng tri thức về cây Xạ Đen mà còn mở ra cơ hội cho việc phát triển các sản phẩm dược liệu mới từ thiên nhiên. Việc tiếp tục nghiên cứu và phát triển các phương pháp nuôi cấy tế bào sẽ giúp tối ưu hóa quy trình sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học, đáp ứng nhu cầu ngày càng cao trong y học.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Ung thư hiện là một trong những gánh nặng y tế hàng đầu trên toàn cầu. Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới, mỗi năm thế giới ghi nhận khoảng 10 triệu ca mắc mới và hơn một nửa trong số đó tử vong. Tại Việt Nam, thống kê của ngành y tế cho thấy hàng năm có khoảng 100.000 trường hợp mắc mới và 75.000 người tử vong do ung thư. Trong đó, ung thư vú là dạng ung thư phổ biến nhất ở nữ giới với tỷ lệ mắc chuẩn theo tuổi đạt 27,3 trên 100.000 dân ở miền Bắc và 17,1 trên 100.000 dân ở miền Nam. Việc tìm kiếm các hoạt chất điều trị có nguồn gốc tự nhiên với độc tính thấp đối với tế bào lành đang là hướng đi cấp thiết của y sinh học.

Cây Xạ Đen (Celastrus hindsii Benth, thuộc họ Celastraceae) là loài dược liệu quý chứa nhiều nhóm hợp chất có hoạt tính sinh học cao, đặc biệt là nhóm terpenoid. Tuy nhiên, việc khai thác dược chất từ cây trồng tự nhiên gặp nhiều rào cản do thời gian sinh trưởng kéo dài và hàm lượng hoạt chất phụ thuộc lớn vào thời tiết, thổ nhưỡng. Do đó, việc ứng dụng công nghệ sinh học thực vật để nuôi cấy tế bào in vitro nhằm chủ động nguồn nguyên liệu terpenoid là hướng đi có ý nghĩa thực tiễn to lớn.

Luận văn thạc sĩ chuyên ngành Công nghệ Sinh học được thực hiện từ tháng 01/2014 đến tháng 11/2014 tại Trường Đại học Bách Khoa và Đại học Y khoa Phạm Ngọc Thạch, Thành phố Hồ Chí Minh. Mục tiêu nghiên cứu tập trung vào hai nội dung trọng tâm: khảo sát các điều kiện nuôi cấy mô sẹo từ lá cây Xạ Đen nhằm thu nhận sinh khối có khả năng sinh tổng hợp terpenoid, đồng thời đánh giá độc tính tế bào của dịch chiết đối với dòng tế bào ung thư vú người SK-BR-3 mang thụ thể HER2. Nghiên cứu đã xác lập thành công quy trình tạo mô sẹo đạt tỷ lệ 100% sau 12 ngày nuôi cấy, chỉ số tăng trưởng sinh khối đạt 3,44 lần và xác định giá trị nồng độ ức chế IC50 của cao chiết lá tự nhiên đạt 156 µg/ml trên tế bào ung thư vú.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên nguyên lý toàn năng của tế bào thực vật (totipotency) và cơ chế phản phân hóa để tạo mô sẹo (callus) dưới tác động của các chất điều hòa sinh trưởng. Quá trình sinh tổng hợp terpenoid trong tế bào thực vật diễn ra thông qua hai con đường chuyển hóa chính: con đường Mevalonic acid (MVA) xảy ra trong bào tương tạo tiền chất cho sesquiterpen và triterpen, cùng con đường Methylerythritol phosphate (MEP) xảy ra trong lạp thể hình thành monoterpen và diterpen. Terpenoid là nhóm hợp chất tự nhiên đa dạng với hơn 40.000 cấu trúc đã được công bố, cấu thành từ các đơn vị isoprene C5H8 kết nối theo nguyên tắc đầu - đuôi hoặc đuôi - đuôi.

Theo y văn thế giới, khoảng 73% các loại thuốc điều trị ung thư được phát triển từ năm 1940 đến 2006 có nguồn gốc hoặc mang cấu trúc bán tổng hợp từ thiên nhiên. Về cơ chế phân tử, các hợp chất terpenoid có khả năng kích hoạt tiến trình apoptosis (chết theo chương trình) ở tế bào khối u thông qua việc ức chế yếu tố phiên mã NF-kB, làm giảm tiết các protein kháng chết tế bào như Bcl-2 và gia tăng biểu hiện của protein Bax, dẫn đến giải phóng cytochrome c và kích hoạt caspase. Dòng tế bào ung thư vú SK-BR-3 là mô hình thử nghiệm lý tưởng do có sự khuếch đại gen HER2/neu chiếm khoảng 20% đến 30% trong các thể ung thư vú xâm lấn ở người.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn nguyên liệu sử dụng là lá non của cây Xạ Đen thu hái tại Quận 12, Thành phố Hồ Chí Minh (có nguồn gốc thuần chủng từ Hòa Bình). Quy trình xử lý mẫu cấy bắt đầu bằng việc rửa sạch dưới vòi nước chảy 15 phút, ngâm trong cồn 70 độ trong 5 phút và khử trùng bề mặt bằng dung dịch HgCl2 0,1% bổ sung chất diện hoạt Tween trong 15 phút.

Cỡ mẫu được thiết kế nghiêm ngặt với 4 bình nuôi cấy cho mỗi nghiệm thức, mỗi bình đặt 3 mảnh lá kích thước 1x1 cm và lặp lại độc lập 3 lần (tương đương 36 mẫu quan sát trên mỗi tổ hợp nghiệm thức). Mô sẹo sau khi tạo thành được cấy chuyền với khối lượng ban đầu cố định 300 mg tươi trên 250 ml môi trường dinh dưỡng để khảo sát tăng trưởng.

Nghiên cứu ứng dụng các phương pháp phân tích chuẩn hóa gồm:

• Định tính terpenoid bằng phản ứng hóa học Liebermann - Burchard (tạo phức màu cam đỏ) và phản ứng Salkowski (tạo vòng màu nâu đỏ).
• Phân tích sắc ký bản mỏng (TLC) trên bản silica gel Merck 60 F254 sử dụng hai hệ dung môi phân cực khác nhau gồm CHCl3 : MeOH : H2O (tỷ lệ 65:35:10) và n-Butanol : acid acetic : H2O (tỷ lệ 4:1:5), hiện màu bằng thuốc thử H2SO4 10% trong ethanol và sấy ở 110 độ C trong 10 phút.
• Đánh giá khả năng gây độc tế bào bằng kỹ thuật MTT cải biên trên đĩa 96 giếng với mật độ 8.100 tế bào/giếng, đo mật độ quang ở bước sóng 540 nm sau các mốc thời gian 24, 48 và 72 giờ để xác định giá trị IC50.
• Đánh giá biểu hiện gen HER2 bằng kỹ thuật tách chiết RNA tổng số và khuếch đại cDNA qua phản ứng RT-PCR. Phương pháp MTT và RT-PCR được lựa chọn vì tính chính xác cao, độ nhạy vượt trội và khả năng định lượng trực tiếp ở cấp độ phân tử.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Nghiên cứu đã ghi nhận những kết quả thực nghiệm nổi bật trong việc nuôi cấy mô sẹo và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Xạ Đen:

Thứ nhất, tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng tối ưu để cảm ứng hình thành mô sẹo từ lá Xạ Đen là môi trường MS bổ sung 0,2 mg/L BA kết hợp 0,3 mg/L 2,4-D hoặc 0,3 mg/L Kinetin kết hợp 0,7 mg/L 2,4-D trên nền saccharose 30 g/L. Cả hai tổ hợp này đều cho tỷ lệ tạo mô sẹo đạt 100% chỉ sau 12 ngày nuôi cấy với khối sẹo chắc, màu sắc sáng và phân chia tế bào đồng đều.

Thứ hai, về tăng sinh khối, môi trường khoáng MS giảm nồng độ còn một nửa (MS 1/2) kết hợp với 0,2 mg/L BA và 0,3 mg/L 2,4-D cho chỉ số tăng trưởng mô sẹo đạt 3,44 lần sau 30 ngày. Kết quả này cao hơn 7,16% so với môi trường khoáng B5 kết hợp 0,3 mg/L Kinetin và 0,7 mg/L 2,4-D (đạt chỉ số 3,21 lần). Đặc biệt, nồng độ saccharose 10 g/L trong điều kiện tối hoàn toàn (0 lux) kích thích mô sẹo tăng trưởng mạnh nhất, vượt trội hơn các mức saccharose cao 20, 30 và 40 g/L.

Thứ ba, kết quả phân tích hóa thực vật qua phản ứng Liebermann - Burchard, Salkowski và sắc ký bản mỏng TLC khẳng định sự hiện diện rõ ràng của nhóm chất terpenoid trong cả cao chiết n-hexan từ lá tự nhiên và mô sẹo nuôi cấy in vitro, thể hiện qua các vết màu tím đặc trưng ở khoảng 1/3 đến 2/3 chiều dài bản mỏng.

Thứ tư, thử nghiệm độc tính sinh học cho thấy cao chiết n-hexan từ lá Xạ Đen tự nhiên có khả năng ức chế mạnh sự tăng sinh và gây chết theo chương trình tế bào ung thư vú SK-BR-3 với giá trị IC50 đạt 156 µg/ml sau 72 giờ ủ. Trong khi đó, cao chiết từ mô sẹo nuôi cấy in vitro có mức độ gây độc tế bào rất thấp ở cùng dải nồng độ thử nghiệm từ 1 đến 200 µg/ml.

Thảo luận kết quả

Hiệu quả vượt trội của môi trường MS 1/2 đối với sự tăng trưởng sinh khối mô sẹo Xạ Đen có thể giải thích do nồng độ muối khoáng giảm một nửa giúp làm giảm áp suất thẩm thấu của môi trường dinh dưỡng, tạo điều kiện cho tế bào mô sẹo dễ dàng hút nước và hấp thu khoáng chất để phân chia. Việc nuôi cấy trong bóng tối hoàn toàn ngăn chặn quá trình quang phân ly của các chất điều hòa sinh trưởng, đồng thời hạn chế sự tích tụ các hợp chất phenolic gây độc cho mô nuôi cấy.

Sự khác biệt rõ rệt về hoạt tính gây độc tế bào ung thư giữa cao chiết lá tự nhiên (IC50 = 156 µg/ml) và mô sẹo in vitro bắt nguồn từ trạng thái biệt hóa của mô. Các tế bào mô sẹo in vitro chủ yếu ở trạng thái phản phân hóa nhanh, các con đường enzyme chuyên biệt tổng hợp thứ cấp như nhóm enzyme Terpene synthases (TPSs) chưa được kích hoạt đầy đủ như ở lá cây trưởng thành ngoài tự nhiên. Kết quả này tương đồng với các công bố khoa học trên cây Taxus cuspidata và Salvia miltiorrhiza, khi mô sẹo sơ cấp thường cần bổ sung các chất kích kháng để kích thích tích lũy hoạt chất.

Toàn bộ động học tăng trưởng sinh khối và tỷ lệ sống sót của tế bào ung thư SK-BR-3 theo các dải nồng độ từ 1 đến 200 µg/ml được biểu diễn chi tiết qua biểu đồ đường tuyến tính và bảng ma trận nồng độ phytohormone, giúp làm rõ mối tương quan giữa liều lượng và thời gian tác động sau 24, 48 và 72 giờ.

Đề xuất và khuyến nghị

Nhằm hoàn thiện quy trình công nghệ sinh học và nâng cao hàm lượng hoạt chất hướng tới ứng dụng thực tiễn, tác giả đưa ra 4 khuyến nghị then chốt:

1. Bổ sung các chất cảm ứng sinh học và hóa học (elicitations) như methyl jasmonate ở nồng độ từ 50 đến 100 µmol/L hoặc chitosan vào môi trường nuôi cấy trong giai đoạn 7 đến 14 ngày trước khi thu hoạch nhằm kích hoạt hệ enzyme TPSs, đặt mục tiêu tăng hàm lượng terpenoid trong mô sẹo lên gấp 2 đến 3 lần. Đề xuất nhóm nghiên cứu công nghệ sinh học thực hiện trong lộ trình 12 tháng.

2. Chuyển đổi mô hình từ nuôi cấy mô sẹo trên môi trường đặc sang hệ thống nuôi cấy huyền phù tế bào (cell suspension culture) trong bình sinh học bioreactor dung tích từ 5 đến 10 lít, kiểm soát tốc độ khuấy 60 đến 80 vòng/phút và lưu lượng oxy hòa tan 0,5 vvm nhằm rút ngắn chu kỳ thu sinh khối từ 30 ngày xuống còn 14 đến 18 ngày. Giao cho các kỹ sư công nghệ sinh học triển khai trong vòng 18 tháng.

3. Tinh sạch và phân lập chi tiết từng hợp chất terpenoid đơn lẻ từ phân đoạn cao n-hexan lá Xạ Đen bằng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC và sắc ký cột silica gel, xác định cấu trúc các triterpene chủ đạo như bauerenol và alpha-amyrin để thử nghiệm hoạt tính kháng ung thư đích với giá trị IC50 mục tiêu dưới 50 µg/ml. Thực hiện bởi các chuyên gia hóa dược trong thời gian 12 tháng.

4. Ứng dụng kỹ thuật Real-time RT-PCR định lượng mức độ suy giảm biểu hiện của mRNA gen HER2 và các protein ức chế apoptosis ở tế bào SK-BR-3 sau khi xử lý với phân đoạn terpenoid tinh khiết để làm sáng tỏ cơ chế tác động ở mức độ tín hiệu tế bào. Đề xuất phòng thí nghiệm sinh học phân tử thực hiện trong vòng 9 tháng.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Công trình nghiên cứu mang lại giá trị học thuật và ứng dụng chuyên sâu cho 4 nhóm đối tượng chính:

1. Các nhà nghiên cứu và giảng viên chuyên ngành Công nghệ Sinh học Thực vật: Luận văn cung cấp toàn bộ thông số tối ưu về nồng độ chất điều hòa sinh trưởng (0,2 mg/L BA kết hợp 0,3 mg/L 2,4-D), thành phần khoáng MS 1/2 và điều kiện chiếu sáng 0 lux để thiết lập quy trình nuôi cấy mô sẹo đạt tỷ lệ 100%, phục vụ công tác giảng dạy và nghiên cứu mở rộng.

2. Các nhà khoa học lĩnh vực Dược học và Hóa sinh Y học: Tài liệu hữu ích trong việc tham khảo phương pháp chiết xuất dung môi n-hexan, định tính terpenoid qua hai hệ dung môi sắc ký TLC và quy trình thử nghiệm độc tính tế bào MTT chuẩn mực trên dòng ung thư vú SK-BR-3 với giá trị IC50 đạt 156 µg/ml.

3. Học viên cao học và sinh viên ngành Y Dược, Công nghệ Sinh học: Luận văn là tài liệu tham khảo chuẩn mực về cấu trúc nghiên cứu, phương pháp bố trí thí nghiệm lặp lại 3 lần độc lập, kỹ thuật tách chiết RNA và phân tích RT-PCR hỗ trợ quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp.

4. Các doanh nghiệp sản xuất Dược phẩm và Thực phẩm Bảo vệ Sức khỏe: Cung cấp cơ sở dữ liệu khoa học ban đầu để đánh giá tiềm năng sản xuất sinh khối tế bào Xạ Đen quy mô công nghiệp, giúp chủ động tạo nguồn nguyên liệu sạch phục vụ sản xuất các chế phẩm hỗ trợ điều trị ung thư.

Câu hỏi thường gặp

1. Môi trường dinh dưỡng nào kích thích mô sẹo cây Xạ Đen tăng sinh khối tốt nhất? Thực nghiệm chứng minh môi trường khoáng MS 1/2 kết hợp 0,2 mg/L BA và 0,3 mg/L 2,4-D giúp mô sẹo tăng trưởng mạnh nhất với chỉ số tăng trưởng đạt 3,44 lần sau 30 ngày. Việc giảm 50% hàm lượng khoáng giúp hạ áp suất thẩm thấu, tối ưu khả năng hấp thụ dinh dưỡng của mô sẹo.

2. Tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng nào cho tỷ lệ tạo mô sẹo tối đa từ lá Xạ Đen? Hai tổ hợp đạt tỷ lệ cảm ứng mô sẹo 100% sau 12 ngày là 0,2 mg/L BA kết hợp 0,3 mg/L 2,4-D hoặc 0,3 mg/L Kinetin kết hợp 0,7 mg/L 2,4-D. Mảnh lá non kích thước 1x1 cm hình thành khối mô sẹo đồng nhất ở nhiệt độ 25 độ C trong điều kiện tối hoàn toàn.

3. Cao chiết n-hexan từ lá Xạ Đen ức chế tế bào ung thư vú SK-BR-3 ở mức độ nào? Cao chiết n-hexan từ lá tự nhiên có khả năng gây độc mạnh đối với dòng tế bào ung thư vú SK-BR-3 thông qua phương pháp MTT với giá trị IC50 đạt 156 µg/ml sau 72 giờ ủ, làm giảm mật độ tế bào sống rõ rệt ở nồng độ từ 150 đến 200 µg/ml.

4. Tại sao cao chiết mô sẹo in vitro có hoạt tính kháng tế bào ung thư thấp hơn lá tự nhiên? Mô sẹo in vitro ở giai đoạn sơ cấp là khối tế bào chưa biệt hóa hoàn toàn nên các con đường enzyme sinh tổng hợp terpenoid thứ cấp chưa hoạt động mạnh. Để gia tăng hoạt tính, cần bổ sung các chất cảm ứng như methyl jasmonate 100 µmol/L hoặc kéo dài thời gian nuôi cấy.

5. Điều kiện ánh sáng và hàm lượng đường ảnh hưởng thế nào đến mô sẹo Xạ Đen? Mô sẹo phát triển tối ưu trong điều kiện tối hoàn toàn (0 lux) với nồng độ saccharose 10 g/L. Việc chiếu sáng 2800 lux hoặc nâng nồng độ saccharose lên mức 30 đến 40 g/L gây ức chế sinh trưởng và làm giảm chỉ số tăng khối lượng tươi của mô sẹo.

Kết luận

• Xác lập thành công quy trình cảm ứng tạo mô sẹo từ lá non cây Xạ Đen đạt tỷ lệ 100% sau 12 ngày trên môi trường MS bổ sung 0,2 mg/L BA và 0,3 mg/L 2,4-D.
• Xác định môi trường khoáng MS 1/2 bổ sung 10 g/L saccharose trong điều kiện tối hoàn toàn là môi trường tối ưu cho tăng sinh khối với chỉ số tăng trưởng đạt 3,44 lần sau 30 ngày.
• Chứng minh sự hiện diện của nhóm hợp chất terpenoid trong cao chiết n-hexan của cả lá tự nhiên và mô sẹo nuôi cấy in vitro thông qua phản ứng hóa học và sắc ký bản mỏng TLC.
• Đánh giá khả năng gây độc tế bào của cao chiết lá tự nhiên đối với dòng tế bào ung thư vú SK-BR-3 với giá trị IC50 đạt 156 µg/ml sau 72 giờ ủ.
• Chỉ ra hạn chế về hàm lượng hoạt chất sinh học trong mô sẹo sơ cấp in vitro, định hướng giải pháp bổ sung chất kích kháng sinh học trong giai đoạn tiếp theo.

Đóng góp quan trọng nhất của luận văn là đặt nền móng khoa học vững chắc và cung cấp các thông số kỹ thuật in vitro đầu tiên cho việc nuôi cấy mô sẹo cây Celastrus hindsii Benth tại Việt Nam. Trong giai đoạn 12 đến 18 tháng tới, hướng nghiên cứu cần mở rộng sang hệ thống huyền phù tế bào quy mô bioreactor kết hợp chất cảm ứng elicitor. Kính mời quý độc giả, nhà khoa học và các đơn vị nghiên cứu tham khảo, trích dẫn toàn văn luận văn để cùng thúc đẩy các ứng dụng công nghệ sinh học trong y dược học hiện đại.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Mở Đầu Luận Văn Tốt Nghiệp toàn cầu có khoảng 9-10 triệu người mới mắc bệnh ung thư và một nửa trong số đó chết vì căn bệnh này. Tại hội nghị "Tổng kết Chương trình phòng, chống bệnh không lây nhiễm giai đoạn 2002 - 2011" và triển khai kế hoạch hành động giai đoạn 2012 – 2020, cục Quản lý Khám, Chữa bệnh cho biết: mỗi năm ở Việt Nam có khoảng 100.000 trường hợp mắc mới và 75.000 người chết vì ung thư (gấp 7 lần tử vong do tai nạn giao thông) và có xu hướng ngày càng tăng. Chính vì những lý do trên mà việc khảo sát các điều kiện nuôi cấy nhằm thu các HCTN có hoạt tính sinh học từ tế bào Xạ Đen in vitro là thực sự cần thiết để đáp ứng các nhu cầu cấp thiết trong y học.2 Mục tiêu nghiên cứu  Khảo sát sự tạo mô sẹo có khả năng sinh tổng hợp terpenoid từ lá cây Xạ Đen.  Đánh giá khả năng gây độc đối với tế bào ung thư vú SK-BR3 của dịch ly chiết từ mô sẹo có nguồn gốc từ lá của cây Xạ Đen.3 Nội dung nghiên cứu:  Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng thực vật (auxin và cytokinin) lên sự hình thành và tăng trưởng của mô sẹo.

 Khảo sát sự ảnh hưởng của các môi trường khoáng và nồng độ saccharose lên sự tăng sinh của mô sẹo.  Khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng lên sự tăng sinh của mô sẹo.  Khảo sát khả năng sinh tổng hợp các hợp chất thuộc nhóm terpenoid của mô sẹo từ cây Xạ Đen.  Khảo sát khả năng gây độc với tế bào ung thư vú của dịch ly chiết với n- hexan từ mô sẹo có nguồn gốc từ lá của cây Xạ Đen.

Trang 2 CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU Chương II: Tổng Quan Tài Liệu Luận Văn Tốt Nghiệp 2.1 Cây Xạ Đen 2.1 Phân loại Giới : Plantae (Thực vật) Ngành : Magnoliophyta (Hạt kín) Lớp : Magnoliosida (Hai lá mầm) Họ : Celastraceae Chi : Celastrus Loài : C. hindsii Benth Tên khoa học: Celastrus hindsii Benth Tên thông thường: Xạ Đen.1: Cây Xạ Đen 2.2 Nguồn gốc và sự phân bố Cây mọc ở vùng núi, nơi sáng và ẩm, rải rác dọc ven đường, ven rừng, dựa hàng rào, bờ bụi, gặp ở các tỉnh Hoà Bình (huyện Tân Lạc, Lạc Sơn, Đà Bắc, Mai Châu và vùng thị xã Hoà Bình), Hà Nam, Ninh Bình, Gia Lai, Quảng Ninh, Thừa Thiên - Huế. Trang 3 Chương II: Tổng Quan Tài Liệu Luận Văn Tốt Nghiệp 2.3 Đặc điểm hình thái Là cây bụi trườn, dài 3 – 5 m hoặc hơn, cành non có lông mịn, sau nhẵn, màu nâu xám. Lá bắc hình dải đến hình ngọn giáo, dài 3 – 10 mm.

Lá đơn, mọc so le, phiến lá nguyên, dai, không khía răng cưa, hình bầu dục, kích thước 3 - 12 x 2 - 6 cm, chóp lá tù hay có mũi nhọn, gốc tròn, có 4 - 6 đôi gân bên, hai mặt lá nhẵn, hay mặt dưới có lông dọc theo gân lá. Cuống lá dài 6 – 15 mm. Cụm hoa là một xim ở đầu cành nhỏ, dài 4 – 5 cm, đường kính 4 – 6 cm, có lông mịn. Đài hoa màu nâu, cao 1,5 - 2,5 mm, 5 thuỳ, có lông mịn.

Tràng màu trắng, phần dưới dính liền thành hình phễu, dài 3,5 – 4 mm, họng rộng 5 mm, 5 thuỳ hình trứng hay tam giác, dài 2 - 2,5 mm. Nhị 5, chỉ nhị dài 3,5 – 4 mm, đính cách gốc tràng khoảng 1 mm. Bao phấn hình mũi tên, dài khoảng 1 mm. Bầu gần hình cầu.

Vòi nhuỵ dài 3 – 4 mm, xẻ nhánh dài khoảng 1 mm. Quả hạch, khi chín màu đỏ hay màu cam, đường kính 3 – 4 mm, có 4 hạch, mỗi hạch chứa một hạt Hình 2. Hoa, quả cây Xạ Đen Trang 4 Chương II: Tổng Quan Tài Liệu Luận Văn Tốt Nghiệp 2.4 Thành phần hóa học Theo nghiên cứu “Nghiên cứu một số cây thuốc chi Cườm rụng (Ehretia P.), họ Vòi voi (Boraginaceae) ở miền Bắc Việt Nam” đã phân loại và xác định tên khoa học của 7 loài thuộc chi Cườm Rụng (Ehretia P.) ở miền Bắc Việt Nam, bao gồm Ehretia acuminata R.; Ehretia asperula Zoll.; Ehretia dichotoma Blume; Ehretia dicksonii Hance.; Ehretia laevis Roxb; Ehretia longiflora Champ. và Ehretia tsangii Johnst.

Từ lá của cây Xạ Đen đã phân lập và xác định cấu trúc của 6 chất thuộc bốn khung carbon khác nhau: - Nitril glycoside(-)-ehretiosid A1 (1), là một trong số các đồng phân quang học của: (+)-ehretiosid A1. - Flavonoid glucoside: astragalin (2). - Hai hợp chất phenolic khác: acid rosmarinic (3) và metylrosmarinate (4). - Hai triterpen gồm: bauerenol (5) và α-amyrin (6) là thành phần hoá học chính của lá.

Từ vỏ thân của cây Xạ Đen, phân lập và xác định cấu trúc của 9 hợp chất terpene: (1) 3β-acetoxyolean-12-en-28-al; (2) α-amyrin acetate; (3) β-amyrin acetate; (4) stigmasterol; (5) squalene; (6) daucosterol; (7) α-amyrine; (8) bauerenol; (9) oleanolic acid acetate.5 Các nghiên cứu trong và ngoài nước Các nghiên cứu theo hướng nuôi cấy mô sẹo để thu nhận hợp chất terpenoid trên đối tượng Celastrus hindsii hầu như không có. Các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào việc xác định thành phần hóa học trong dịch chiết từ thân và lá của cây. Nghiên cứu của Lý Ngọc Trâm, Makoto Shimoyamada và Ryo Yamauchi (2006) đã phân lập được 8 hợp chất phenolic từ dịch chiết lá của Celastrus Trang 5 Chương II: Tổng Quan Tài Liệu Luận Văn Tốt Nghiệp hindsii: rutine (1), kaempferol 3-rutinoside (2), rosmarinic acid (3), lithospermic acid (4), lithospermic acid B (6), và ba oligomer của rosmarinic acid: một dimer (5) và hai trimer (7 và 8). Các hợp chất các chứa gốc phenol như rosmarinic acid và lithospermic acid có khả năng chống oxi hoá thông qua việc ngăn cản quá trình hình thành các gốc oxi tự do của methyl linoleate ở bề mặt màng tế bào hay ngăn chặn khả năng sinh các gốc peroxide tự do của phosphatidylcholine trong liposome của đậu nành [4].

Năm 2005, Phan Văn Kiệm và cộng sự đã phân lập, xác định được cấu trúc của 9 hợp chất terpen từ vỏ khô của cây Xạ Đen: (1) 3β-acetoxyolean- 12-en-28-al; (2) α-amyrin acetate; (3) β-amyrin acetate ; (4) stigmasterol; (5) squalene; (6) daucosterol; (7) α-amyrin; (8) bauerenol; (9) oleanolic acid acetate [5]. Năm 2007, Nguyễn Thị Vân Khanh và cộng sự công bố kết quả về việc phân lập và xác định cấu trúc của hỗn hợp stigmasterol và β-stigmasterol từ lá cây Xạ Đen [6]. Năm 2008, Trần Văn Sung và cộng sự đã phân lập được một hỗn hợp gồm 3 triterpen từ lá của cây Xạ Đen. Hỗn hợp này không thể phân tách bằng sắc ký cột.

Tuy nhiên, khi kết hợp phương pháp phổ và phương pháp chuyển hoá hoá học, nhóm nghiên cứu đã xác định được thành phần hoá học chủ yếu là bauerenol và urs-12-en-3β-ol (α-amyrin) [2]. Lê Thị Huyền và cộng sự đã chiết suất, phân lập 3 hợp chất từ cây Xạ Đen (1) 5α-olean-12-en-3β-ol(β Amyrin); (2) β-Amyrin-3-O-succinate; (3) 6-methoxy-2,2-dimethyl-5-nitrogen-2H-chromen-7-ol và 3 hợp chất từ cây bông ổi (Lantana camara L) (1) Lantaden B; (2) Icterogenin; (3) 3-oxo-25- methylhydroxy-22β-[(Z)-2’-butenoyloxy]-olean-12-en-28-oic acid. Đồng thời, nghiên cứu cũng thử nghiệm khả năng gây độc đối với tế bào ung thư gan (Hep-2) và tế bào ung thư phổi (Lu). Kết quả cho thấy, cả 6 hoạt chất không có khả năng gây độc với tế bào ung thư phổi (Lu) [7].

Trang 6 Chương II: Tổng Quan Tài Liệu Luận Văn Tốt Nghiệp 2.2 Giới thiệu về terpenoid: 2.1 Sự phân bố terpenoid trong thực vật: Trong thiên nhiên, hơn 40.000 hợp chất terpenoid được tổng hợp từ các loài thực vật, vi sinh vật và động vật. Ở thực vật, terpenoid có vai trò vừa là hợp chất sơ cấp vừa là hợp chất thứ cấp. Các terpenoid tổng hợp theo con đường sơ cấp (gibberellin, carotenoid và sterol…) có chức năng điều tiết sự tăng trưởng của tế bào, tăng chiều cao của cây, bảo vệ cây tránh khỏi tác hại của ánh sáng mặt trời, điều khiển tính thấm và tính linh động của màng tế bào [8]. Terpenoid tổng hợp theo con đường thứ cấp thường có tính chất thương mại hoá, bởi chúng được sử dụng như chất giúp tăng mùi hương và màu sắc trong ngành hương liệu và thực phẩm, giúp cải thiện năng suất cây trồng nhờ đặc tính kháng bệnh và sâu bệnh trên một số giống cây trồng.

Quan trọng hơn cả, một số terpenoid còn có giá trị cả về mặt y học. Một số thực vật chứa terpenoid có vai trò trong y học [9] Terpenoid Thực vật Đặc tính về dược lý Limonene Quả - Chống trầm cảm, tăng sức đề kháng (Komori et al., 1995) chanh - Gây chết theo chương trình đối với tế bào ung thư vú (Vigushin et al., 1998) - Kháng khuẩn (Kim et al., 2000) - Kháng nấm da (Sanguinetti et al., 2007; Singh et al., 2010) - Ngăn trào ngược thực quản (Harris, 2010) α-Pinene Lá thông - Chống nhiễm khuẩn thông qua PGE-1 (Gil et al., 1989) - Giãn phế quản ở người (Falk et al., 1990) - Ức chế acetylcholinesterase, cải thiện trí nhớ (Perry et al., 2000) β Carophyllene Hạt tiêu - Ngăn chặn sự nhiễm trùng thông qua PGE-1 so sánh với phenylbutazone (Basile et al., 1988) - Bảo vệ tế bào niêm mạc dạ dày (Tambe et al.,1996) Trang 7 Chương II: Tổng Quan Tài Liệu Luận Văn Tốt Nghiệp - Kháng ký sinh trùng sốt rét (Campbell et al.,1997) β Myrcene Hoa - Ngăn chặn nhiễm trùng thông qua PGE-2 (Lorentti et al., Huplong 1999) - Giảm đau nhờ naloxone (Rao et al., 1990) - An thần, giãn cơ, thuốc ngủ (do Vale et al., 2002) - Ngăn ngừa ung thư gan nhờ aflatoxin (de Oliveria et al., 1997) Linalool Hoa oải - Chống lo âu (Russo, 2001) hương - An thần khi cho chuột hít vào (Buchbauer et al.,1993) - Giảm đau cục bộ (Re et al., 2000) - Giảm đau thông qua adenosine A2A (Peana et al., 2006) - Chống co giật (Elisabetsky et al., 1995) - Khả năng chống bệnh Leishamanial (do Socorro et al., 2003) Caryophyllene Lá bạc hà - Giảm ngưng tập tiểu cầu (Lin et al., 2003) oxide - Kháng nấm trong bệnh nấm móng (Yang et al., 1999) - Trừ sâu (Bettarini et al., 1993) Nerolidol Quả cam - An thần (Binet et al, 1972) - Thẩm thấu qua da (Cornwell and Barry, 1994) - Kháng ký sinh trùng sốt rét (Lopes et al, 1999; Rodriques Goulart et al., 2002) Phytol Trà xanh - Ngăn ngừa dị tật thai nhi do Vitamin A (Arnhold et al., 2002) - Tăng GABA do ức chế SSADH (Bang et al., 2002) Trang 8 Chương II: Tổng Quan Tài Liệu Luận Văn Tốt Nghiệp 2.2 Terpenoid và cấu trúc hóa học Terpenoid, còn gọi là terpen hay isoprenoid, hầu như có mặt trong tất cả các cơ quan sống [10]. Con người sử dụng terpenoid dưới dạng các dịch chiết từ hoa, quả và các bộ phận khác của cây.