Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Xoài (Mangifera indica L.) thuộc họ Đào lộn hột (Anacardiaceae) là cây ăn trái nhiệt đới và cận nhiệt đới có giá trị kinh tế và tiềm năng xuất khẩu lớn của Việt Nam. Theo số liệu từ Cục Trồng trọt thuộc Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn (năm 2021), cả nước có 92.746 ha diện tích trồng xoài với tổng sản lượng đạt khoảng 788.000 tấn. Trong đó, vùng Đồng bằng sông Cửu Long là vùng chuyên canh sản xuất xoài lớn nhất, chiếm 46,1% tổng diện tích và đóng góp 64,4% tổng sản lượng xoài của cả nước. Mặc dù có tiềm năng thương mại cao, chuỗi cung ứng và xuất khẩu xoài vẫn gặp rào cản lớn do tổn thất sau thu hoạch bởi các bệnh nấm hại quả, đặc biệt là bệnh đốm đen trái xoài gây thối hỏng vỏ và thịt quả, làm giảm nghiêm trọng chất lượng thương phẩm.

Các khảo sát thực địa của Viện Cây ăn quả miền Nam ghi nhận nấm Lasiodiplodia sp. là tác nhân nấm bệnh phổ biến gây hại trên giống xoài cát Hòa Lộc – giống xoài chủ lực tại các tỉnh phía Nam. Phương thức kiểm soát bệnh phổ biến hiện nay trong sản xuất vẫn phụ thuộc chủ yếu vào việc phun thuốc bảo vệ thực vật hóa học. Việc lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật hóa học đã dẫn đến nhiều hệ lụy tiêu cực: suy thoái môi trường đất và nước, đe dọa sức khỏe người tiêu dùng, mất cân bằng hệ sinh thái đồng ruộng và làm bộc phát các đối tượng dịch hại thứ cấp. Trước yêu cầu phát triển nông nghiệp an toàn và bền vững, các hướng tiếp cận sử dụng hoạt chất sinh học tự nhiên và vật liệu công nghệ nano (nano sinh học) như Chitosan cùng các phức hợp nano Chitosan kết hợp ion kim loại hay phi kim đang được đẩy mạnh nghiên cứu nhằm thay thế dần thuốc hóa học.

Đề tài khóa luận được thực hiện nhằm giải quyết các mục tiêu và nhiệm vụ cụ thể:

  1. Mục tiêu nghiên cứu: Phân lập và định danh nấm Lasiodiplodia sp. gây bệnh đốm đen trên trái xoài sau thu hoạch dựa vào đặc điểm hình thái; xác định các mức nồng độ tối ưu của Chitosan và các dạng phức hợp nano Chitosan có khả năng ức chế nấm Lasiodiplodia sp. trong điều kiện phòng thí nghiệm.
  2. Nhiệm vụ nghiên cứu:
    • Thu thập mẫu quả xoài có triệu chứng bệnh đốm đen điển hình tại các vườn chuyên canh ở thành phố Cao Lãnh, tỉnh Đồng Tháp.
    • Phân lập, làm thuần và định danh hình thái nấm Lasiodiplodia sp.; kiểm chứng khả năng gây bệnh của chủng nấm phân lập thông qua quy trình lây nhiễm nhân tạo Koch.
    • Bố trí thí nghiệm in vitro đánh giá hiệu lực ức chế sự phát triển của khuẩn ty nấm Lasiodiplodia sp. bởi 4 hoạt chất: Chitosan đơn phân, phức hợp Chitosan/I₂, phức hợp Chitosan/Zn và phức hợp Chitosan/ZnO/I₂ ở các dải nồng độ xử lý khác nhau.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Nấm Lasiodiplodia sp. gây bệnh đốm đen phân lập từ trái xoài; hoạt chất Chitosan và 3 dạng phức hợp nano (Chitosan/I₂, Chitosan/Zn, Chitosan/ZnO/I₂).
  • Phạm vi không gian: Thu mẫu bệnh tại các vườn xoài ở thành phố Cao Lãnh, tỉnh Đồng Tháp; các nội dung thực nghiệm phân lập, định danh và thử nghiệm hoạt tính được thực hiện tại phòng thí nghiệm Bộ môn Bảo vệ thực vật – Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam.
  • Phạm vi thời gian: Đề tài được triển khai từ tháng 8/2022 đến tháng 2/2023.
  • Giới hạn đề tài: Việc định danh chủng nấm thực hiện dựa trên đặc điểm hình thái học tế bào và dừng lại ở cấp độ chi (Lasiodiplodia sp.); các thử nghiệm hiệu lực ức chế nấm được tiến hành hoàn toàn trong điều kiện in vitro trên môi trường nhân tạo PDA.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và vị trí phân loại của tác nhân gây bệnh

Nấm gây bệnh đốm đen trái xoài thuộc hệ thống phân loại sinh học:

  • Giới (Kingdom): Fungi
  • Ngành (Phylum): Ascomycota
  • Lớp (Class): Dothideomycetes
  • Bộ (Order): Botryosphaeriales
  • Họ (Family): Botryosphaeriaceae
  • Chi (Genus): Lasiodiplodia

Chitosan là dẫn xuất deacetyl hóa một phần của polymer sinh học chitin (poly $\beta$-(1$\rightarrow$4)-2-acetamido-2-deoxy-D-glucopyranose). Cơ chế kháng nấm và kháng khuẩn của Chitosan bao gồm ba phương thức chính:

  1. Tương tác tĩnh điện: Các nhóm amin mang điện tích dương ($-NH_3^+$) của Chitosan liên kết với các nhóm mang điện tích âm trên màng tế bào vi sinh vật, làm biến đổi tính thấm của màng, gây rò rỉ chất nội bào hoặc ngăn cản tế bào hấp thu chất dinh dưỡng.
  2. Can thiệp vật chất di truyền: Phân tử Chitosan thâm nhập vào nhân tế bào, liên kết với DNA của mầm bệnh, từ đó ức chế quá trình phiên mã tạo mRNA và tổng hợp protein.
  3. Che hóa ion vi lượng: Chitosan tạo phức chelate với các cation kim loại và chất dinh dưỡng thiết yếu của tế bào, ngăn cản hoạt động chuyển hóa của nấm bệnh.

Khi phối hợp Chitosan với Iot ($I_2$), kẽm ($Zn$) hoặc kẽm oxit ($ZnO$), hiệu ứng cộng hưởng sinh - hóa được hình thành: ion kẽm giải phóng các gốc hydroxyl tự do có tính oxy hóa mạnh phá hủy màng tế bào nấm, trong khi $I_2$ đóng vai trò chất sát trùng mạnh mẽ, giúp nâng cao hiệu lực diệt nấm ở mức nồng độ hoạt chất thấp hơn.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

  1. Phương pháp thu thập và bảo quản mẫu bệnh: Áp dụng phương pháp quản lý mẫu bệnh cây của Roger Shivas và Dean Beasley (2005). Mẫu thu là trái xoài từ 100–120 ngày tuổi mang vết bệnh đốm nâu đen, thâm lõm ở phần cuống và thịt quả. Mẫu được gói giấy thấm, đựng trong túi zip hút ẩm, bảo quản ở tủ mát 4°C trước khi đưa vào phân lập.

  2. Phương pháp phân lập và định danh: Vỏ quả ở ranh giới mô bệnh và mô khỏe được khử trùng bề mặt bằng cồn 70°, rửa lại bằng nước cất vô trùng, cắt kích thước 2 mm x 2 mm và đặt trên môi trường thạch khoai tây Dextrose Agar (PDA: 200 g khoai tây, 20 g Dextrose, 20 g Agar, 1.000 ml nước cất; hấp vô trùng ở 121°C trong 20 phút). Đĩa nuôi cấy được ủ ở 25–28°C. Các chủng nấm được làm thuần bằng kỹ thuật cấy đỉnh sinh trưởng. Đặc điểm hình thái quả thể và bào tử được quan sát dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400x và 1.000x, đối chiếu khóa định danh của Munirah và cộng sự (2017).

  3. Phương pháp lây bệnh nhân tạo theo quy trình Koch: Trái xoài khỏe mạnh được khử trùng bề mặt bằng cồn 70°, rửa nước cất và chiếu xạ tia cực tím (UV). Dùng kim tiêm vô trùng tạo vết thương nhân tạo trên vỏ quả, nhỏ 4 $\mu$l dịch huyền phù bào tử nấm phân lập, ủ ở 26°C trong tủ định ôn. Theo dõi mức độ biểu hiện bệnh sau 1, 2, 3 và 4 ngày. Chỉ số bệnh được đánh giá theo thang 9 cấp của Quy chuẩn Kỹ thuật Quốc gia QCVN 01-177: $$\text{Tỷ lệ bệnh (TLB %)} = \frac{\text{Số trái bị bệnh}}{\text{Tổng số trái theo dõi}} \times 100$$ $$\text{Chỉ số bệnh (CSB %)} = \frac{\sum (N_i \times i)}{N \times n} \times 100$$ (Trong đó: $N_i$ là số trái ở cấp bệnh $i$; $N$ là tổng số trái điều tra; $n$ là cấp bệnh cao nhất).

  4. Phương pháp bố trí thí nghiệm khảo sát hiệu lực ức chế in vitro: Thí nghiệm đơn yếu tố được bố trí theo kiểu Hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD), gồm 5 lần lặp lại (LLL), mỗi lần lặp lại gồm 2 đĩa petri, theo dõi tại các thời điểm 12, 24 và 36 giờ sau cấy (GSC). Các hoạt chất được pha vào môi trường PDA ở nhiệt độ 45–50°C trước khi đổ đĩa:

    • Nghiệm thức Chitosan đơn phân: 0 (đối chứng), 500, 1.000, 1.500 và 2.000 ppm.
    • Nghiệm thức phức hợp Chitosan/I₂: 0, 500, 1.000, 1.500 và 2.000 ppm.
    • Nghiệm thức phức hợp Chitosan/Zn: 0, 500, 1.000, 1.500 và 2.000 ppm.
    • Nghiệm thức phức hợp Chitosan/ZnO/I₂: 0, 750, 1.500, 2.250 và 3.000 ppm.

    Chỉ tiêu đo đạc: Đường kính tản nấm trung bình $d = \frac{d_1 + d_2}{2}$ (mm) đo qua 2 đường trực giao. Hiệu lực ức chế (HL) tính theo công thức Abbott: $$\text{HL (%)} = \frac{D - d}{D} \times 100$$ (Trong đó: $D$ là đường kính tản nấm ở nghiệm thức đối chứng; $d$ là đường kính tản nấm ở nghiệm thức xử lý).

  5. Nguồn dữ liệu và xử lý thống kê: Dữ liệu thô từ các lần lặp lại được tổng hợp trên phần mềm Microsoft Excel và xử lý phân tích phương sai (ANOVA) bằng phần mềm SAS phiên bản 9.1; kiểm định sự khác biệt giữa các giá trị trung bình nghiệm thức ở mức ý nghĩa $\alpha = 0,01$.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương 1 tổng thuật các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến cây xoài, tác nhân nấm gây bệnh sau thu hoạch và các hoạt chất sinh học:

  • Tình hình sản xuất xoài và bệnh đốm đen: Khái quát nguồn gốc cây xoài (Mangifera indica L.) từ vùng Nam Á, điều kiện phát sinh bệnh đốm đen do nấm gây thối cuống và vỏ trái trong điều kiện ẩm độ cao của mùa mưa.
  • Tác nhân Lasiodiplodia sp.: Phân tích các nghiên cứu của Johnson (1992), Serrato-Diaz (2013), Munirah và cộng sự (2017), Chen và cộng sự (2021). Nấm thuộc họ Botryosphaeriaceae, không có tính đặc hiệu ký chủ tuyệt đối, gây hại trên nhiều đối tượng cây ăn quả (chuối, cây có múi, đào, mận, chôm chôm, xoài).
  • Tổng quan về Chitosan và các phức hợp nano: Trình bày cấu trúc phân tử của Chitin và Chitosan, cơ chế tạo vắc-xin thực vật kích kháng tế bào tiết phytoalexin phá vỡ vách nấm, và hoạt tính kháng nấm trực tiếp. Đánh giá tiềm năng của các dạng phức hợp:
    • Chitosan/I₂: Kết hợp hoạt tính sát trùng của iot và tính màng bao của Chitosan, duy trì hiệu quả ức chế vi sinh vật.
    • Chitosan/Zn: Phức hợp giữa polymer Chitosan và cation $Zn^{2+}$, giải phóng gốc tự do hydroxyl phá vỡ màng sinh học và giảm độc tính của muối kẽm lên thực vật.
    • Chitosan/ZnO/I₂: Phức hợp 3 thành phần ở kích thước nano, tạo hiệu ứng cộng hưởng diệt khuẩn và diệt nấm phổ rộng ở liều lượng thấp.

Chương 2: Nội dung và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết quy trình chuẩn bị vật liệu, bố trí thí nghiệm và các bước thu thập dữ liệu:

  • Vật liệu và nồng độ hóa chất gốc: Chitosan nguyên chất dạng lỏng (50.000 ppm), phức hợp Chitosan/I₂ (91.750 ppm), phức hợp Chitosan/Zn (66.500 ppm), phức hợp Chitosan/ZnO/I₂ (98.250 ppm) do Bộ môn Bảo vệ thực vật cung cấp (ngày sản xuất: 27/12/2021).
  • Quy trình phân lập và lây bệnh nhân tạo: Các bước thao tác vô trùng từ xử lý mô bệnh vỏ quả, cấy truyền đỉnh sinh trưởng trên đĩa PDA, tạo áp lực nguồn bệnh nhân tạo bằng huyền phù bào tử trên quả xoài thương phẩm theo quy trình Koch.
  • Phương pháp thực nghiệm in vitro: Bố trí 4 thí nghiệm đơn yếu tố theo khối hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD) để đánh giá riêng biệt hiệu lực của từng loại hoạt chất theo dải nồng độ xác định, theo dõi kích thước tản nấm tại 12, 24 và 36 GSC.

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 3 trình bày các phát hiện thực nghiệm và phân tích dữ liệu thống kê:

  • Đặc điểm hình thái nấm phân lập: Khuẩn ty mọc nhanh, màu trắng đục, nổi trên mặt thạch, phân nhánh và mọc kín đĩa petri đường kính 90 mm sau 36 giờ. Sau 5 ngày tản nấm chuyển màu xám tro, mặt sau có màu đen. Sau 10 ngày bắt đầu hình thành quả thể màu đen. Bào tử non không màu, đơn bào, hình oval, vách dày. Bào tử già màu nâu sẫm, có 1 vách ngăn ở giữa và xuất hiện các vân sọc dọc đối xứng. Kích thước bào tử đo được trung bình là $23,83 \pm 0,88 \times 14,83 \pm 0,68\ \mu\text{m}$, hoàn toàn tương đồng với mô tả phân loại của chi Lasiodiplodia.
  • Kết quả kiểm chứng Koch: Sau 24 giờ lây nhiễm nhân tạo, triệu chứng bệnh cấp 1 bắt đầu xuất hiện trên vỏ quả xoài; sau 48 giờ đạt cấp 3; sau 72 giờ đạt cấp 5 và 7; sau 96 giờ đạt cấp 9. Tỷ lệ bệnh (TLB) đạt 100% từ ngày thứ 2 sau nhiễm; chỉ số bệnh (CSB) đạt 88,4% ở ngày thứ 4. Nấm tái phân lập từ mô bệnh nhân tạo có đầy đủ đặc điểm hình thái trùng khớp với chủng phân lập ban đầu.
  • Hiệu lực ức chế nấm của các hoạt chất:
    • Chitosan: Nồng độ 2.000 ppm cho đường kính tản nấm nhỏ nhất (37,15 mm ở 36 GSC so với đối chứng 86,70 mm), đạt hiệu lực ức chế cao nhất là 57,15%. Dưới kính hiển vi, Chitosan làm đỉnh sinh trưởng của sợi nấm bị u sưng biến dạng.
    • Chitosan/I₂: Nồng độ 2.000 ppm cho đường kính tản nấm 27,95 mm ở 36 GSC, đạt hiệu lực ức chế 67,76% (giảm so với mức 75,69% ở thời điểm 12 GSC do iot bay hơi hoặc suy giảm hoạt tính theo thời gian). Sợi nấm bị teo nhỏ đầu mút sinh trưởng.
    • Chitosan/Zn: Đạt hiệu quả ức chế vượt trội. Ở nồng độ 1.000 ppm và 1.500 ppm, hiệu lực ức chế sau 36 giờ đạt lần lượt 72,38% và 81,42%. Đặc biệt ở nồng độ 2.000 ppm, nấm hoàn toàn không phát triển ($d = 0\text{ mm}$), hiệu lực ức chế đạt tuyệt đối 100% ở tất cả các thời điểm theo dõi (12, 24, 36 GSC). Sợi nấm bị hình thành các đốt tròn nội bào và u sưng đầu ngọn.
    • Chitosan/ZnO/I₂: Thể hiện khả năng kiểm soát mạnh. Nồng độ 2.250 ppm đạt hiệu lực ức chế 81,17% ở 36 GSC. Ở nồng độ 3.000 ppm, đường kính tản nấm đạt 0 mm, hiệu lực ức chế đạt 100% tại toàn bộ các mốc thời gian. Sợi nấm xử lý bị sưng to và phù nề đỉnh sinh trưởng.

Kết quả và đóng góp

Số liệu thực nghiệm tổng hợp

Bảng dưới đây tổng hợp hiệu lực ức chế khuẩn ty nấm Lasiodiplodia sp. (%) của 4 hoạt chất qua các mốc thời gian theo dõi trong điều kiện phòng thí nghiệm:

Hoạt chất Nghiệm thức nồng độ Hiệu lực ức chế 12 GSC (%) Hiệu lực ức chế 24 GSC (%) Hiệu lực ức chế 36 GSC (%)
Chitosan 500 ppm 16,25 11,15 7,68
1.000 ppm 26,90 17,92 13,78
1.500 ppm 45,98 44,59 48,73
2.000 ppm 52,79 55,40 57,15
Chitosan/I₂ 500 ppm 26,69 19,37 13,55
1.000 ppm 35,53 25,60 23,93
1.500 ppm 67,66 55,75 52,42
2.000 ppm 75,69 70,70 67,76
Chitosan/Zn 500 ppm 42,55 23,75 16,20
1.000 ppm 74,48 72,18 72,38
1.500 ppm 82,92 81,42 81,42
2.000 ppm 100,00 100,00 100,00
Chitosan/ZnO/I₂ 750 ppm 48,97 31,09 25,08
1.500 ppm 82,92 75,86 72,08
2.250 ppm 87,94 81,81 81,17
3.000 ppm 100,00 100,00 100,00

(GSC: Giờ sau cấy; Sự khác biệt giữa các nghiệm thức đều đạt mức ý nghĩa thống kê cao với $p < 0,01$).

Đóng góp của đề tài

  • Khẳng định tác nhân bệnh: Xác lập cơ sở khoa học về tác nhân gây bệnh đốm đen thối trái xoài sau thu hoạch tại vùng chuyên canh thành phố Cao Lãnh, tỉnh Đồng Tháp là nấm Lasiodiplodia sp. thông qua định danh vi học và chứng minh tính gây bệnh theo quy trình Koch.
  • Xác định hiệu lực vượt trội của phức hợp nano: Chứng minh việc biến tính hoặc tạo phức Chitosan với kim loại (kẽm) và iot tạo ra hiệu ứng cộng hưởng làm tăng mạnh hoạt tính kháng nấm so với việc sử dụng Chitosan đơn phân.
  • Tìm ra ngưỡng nồng độ ức chế tuyệt đối: Xác định được nồng độ 2.000 ppm đối với phức hợp Chitosan/Zn và nồng độ 3.000 ppm đối với phức hợp Chitosan/ZnO/I₂ có khả năng ức chế 100% sự sinh trưởng của khuẩn ty nấm Lasiodiplodia sp. trong điều kiện nhân tạo.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

  • Nghiên cứu định danh tác nhân nấm bệnh mới chỉ dừng lại ở cấp độ chi (Lasiodiplodia sp.) dựa trên các chỉ tiêu hình thái học tế bào và bào tử, chưa thực hiện phân tích trình tự DNA/sinh học phân tử (vùng gen ITS/TEF1-$\alpha$) để xác định chính xác danh tính loài (như Lasiodiplodia theobromae hay Lasiodiplodia pseudotheobromae).
  • Toàn bộ các thử nghiệm hiệu lực kháng nấm của Chitosan và các phức hợp nano mới chỉ được tiến hành trong phạm vi in vitro trên môi trường thạch PDA, chưa được đánh giá trực tiếp trên trái xoài bảo quản sau thu hoạch cũng như trên cây trồng ngoài đồng ruộng.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

  • Thực hiện định danh chính xác loài nấm bằng phương pháp sinh học phân tử (giải trình tự gen).
  • Triển khai các thí nghiệm đánh giá hiệu lực phòng ngừa và điều trị bệnh của Chitosan, Chitosan/I₂, Chitosan/Zn và Chitosan/ZnO/I₂ trực tiếp trên trái xoài bảo quản sau thu hoạch (in vivo) và mở rộng khảo nghiệm kiểm soát bệnh trên đồng ruộng.

Giá trị tham khảo

Báo cáo khóa luận là tài liệu tham khảo chuyên khảo hữu ích cho:

  • Sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu viên thuộc các ngành Bảo vệ thực vật, Nông học, Bệnh học thực vật, Công nghệ sinh học nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch.
  • Các nội dung có giá trị tham khảo kỹ thuật cao bao gồm: quy trình phân lập và làm thuần nấm bệnh từ vỏ quả xoài; phương pháp lây nhiễm nhân tạo và đánh giá chỉ số bệnh theo tiêu chuẩn QCVN 01-177; phương pháp bố trí thí nghiệm in vitro kiểm tra hoạt tính kháng nấm của các chế phẩm nano sinh học; phương pháp xử lý số liệu thống kê sinh học bằng phần mềm SAS 9.1.
  • Cung cấp dữ liệu định lượng về dải nồng độ ức chế nấm bệnh của các dạng vật liệu Chitosan kim loại/iot cho các phòng nghiên cứu phát triển chế phẩm sinh học bảo quản nông sản sau thu hoạch.

Câu hỏi thường gặp

1. Nguồn mẫu bệnh đốm đen trái xoài dùng trong nghiên cứu được thu thập ở đâu và có đặc điểm gì?

Mẫu bệnh được thu thập trực tiếp từ các vườn xoài chuyên canh tại thành phố Cao Lãnh, tỉnh Đồng Tháp. Mẫu được chọn là các trái xoài có độ chín từ 100 đến 120 ngày tuổi, mang các triệu chứng bệnh đặc trưng: xuất hiện các đốm thâm đen, hóa nâu hoặc xám nâu từ phần cuống trái lan dần lên phần thịt quả ở đầu trái, phần thịt bên trong mềm nhũn và có khuẩn ty trắng xám bao phủ.

2. Bào tử nấm Lasiodiplodia sp. phân lập được có đặc điểm hình thái và kích thước như thế nào?

Dưới kính hiển vi quang học độ phóng đại 1.000x, bào tử nấm ở giai đoạn còn non không màu, trong suốt, đơn bào, hình oval có đỉnh tròn và vách dày. Khi trưởng thành, bào tử chuyển sang màu nâu sẫm, xuất hiện một vách ngăn ngang ở chính giữa và có các vân sọc trải dài đối xứng. Kích thước trung bình của bào tử là $23,83 \pm 0,88\ \mu\text{m}$ (chiều dài) $\times\ 14,83 \pm 0,68\ \mu\text{m}$ (chiều rộng).

3. Diễn tiến lây nhiễm nhân tạo của nấm Lasiodiplodia sp. trên quả xoài theo quy trình Koch diễn ra như thế nào?

Sau khi nhỏ 4 $\mu$l huyền phù bào tử vào vết thương nhân tạo trên quả và ủ ở 26°C:

  • Sau 24 giờ: Xuất hiện vết bệnh cấp 1 (1–10% diện tích bị hại).
  • Sau 48 giờ: Bệnh phát triển lên cấp 3 (>10–20% diện tích bị hại); tỷ lệ bệnh (TLB) đạt 100%.
  • Sau 72 giờ: Vết bệnh lan rộng đạt cấp 5 và cấp 7 (>20–40% diện tích bị hại).
  • Sau 96 giờ: Bệnh đạt cấp 9 (>40% diện tích bị hại) với chỉ số bệnh (CSB) ghi nhận là 88,4%. Nấm tái phân lập từ vết bệnh cho hình thái khuẩn ty và bào tử hoàn toàn trùng khớp với chủng ban đầu.

4. Hoạt chất nào thể hiện hiệu lực ức chế nấm Lasiodiplodia sp. cao nhất và ở mức nồng độ bao nhiêu?

Phức hợp Chitosan/Zn và phức hợp Chitosan/ZnO/I₂ thể hiện hiệu lực ức chế cao nhất trong thí nghiệm. Cụ thể, Chitosan/Zn ở nồng độ 2.000 ppm và Chitosan/ZnO/I₂ ở nồng độ 3.000 ppm đều ức chế hoàn toàn (đường kính tản nấm $d = 0\text{ mm}$, hiệu lực đạt 100,00%) sự sinh trưởng của nấm Lasiodiplodia sp. ở tất cả các thời điểm theo dõi (12, 24 và 36 giờ sau cấy).

5. Dưới kính hiển vi, Chitosan và các phức hợp nano gây ra những biến đổi hình thái nào trên sợi nấm?

Xử lý Chitosan và các phức hợp nano làm tổn thương nghiêm trọng cấu trúc khuẩn ty của nấm:

  • Chitosan (2.000 ppm) làm đỉnh sinh trưởng của sợi nấm bị u sưng, biến dạng.
  • Chitosan/I₂ (2.000 ppm) làm đỉnh sinh trưởng của sợi nấm bị teo nhỏ.
  • Chitosan/Zn (1.500 ppm) làm xuất hiện các cấu trúc đốt tròn bất thường bên trong sợi nấm và khiến đỉnh sinh trưởng bị u sưng.
  • Chitosan/ZnO/I₂ (1.500 ppm) khiến toàn bộ sợi nấm bị sưng to và phù nề ở đỉnh sinh trưởng, làm tê liệt khả năng phát triển của hệ sợi.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Trần Thành Nam đã xác định thành công tác nhân gây bệnh đốm đen thối trái xoài sau thu hoạch tại thành phố Cao Lãnh, tỉnh Đồng Tháp là nấm Lasiodiplodia sp. dựa trên đặc điểm hình thái và kiểm chứng gây bệnh Koch. Thử nghiệm in vitro khẳng định việc tạo phức Chitosan với kẽm và iot giúp gia tăng vượt bậc hoạt tính kháng nấm so với Chitosan đơn phân, trong đó phức hợp Chitosan/Zn (2.000 ppm) và Chitosan/ZnO/I₂ (3.000 ppm) đạt hiệu lực ức chế tuyệt đối 100% đối với khuẩn ty nấm bệnh. Kết quả này cung cấp cơ sở dữ liệu quan trọng cho việc phát triển các chế phẩm nano sinh học an toàn nhằm kiểm soát nấm bệnh sau thu hoạch trên cây ăn trái.