Luận văn thạc sĩ: Nghiên cứu hệ phiên mã từ mô cơ của tôm sú Penaeus monodon tại Việt Nam

Nghiên cứu hệ phiên mã từ mô cơ tôm sú Penaeus monodon tại Việt Nam, khám phá tiềm năng và ứng dụng trong sinh học và nuôi trồng thủy sản.

• Tác giả: Nguyễn Thị Minh Thư
• Người hướng dẫn: PGS.TS Đinh Duy Kháng
• Trường học: Viện Sinh Thái và Tài Nguyên Sinh Vật
• Chuyên ngành: Sinh Học Thực Nghiệm
• Đề tài: Nghiên Cứu Hệ Phiên Mã Từ Mô Cơ Của Tôm Sú Penaeus Monodon Tại Việt Nam
• Loại tài liệu: Luận Văn Thạc Sỹ
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG I: MỞ ĐẦU
• 1.1. Mục tiêu đề tài
• 2. CHƯƠNG II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Đại cƣơng về Tôm Sú
• 2.2. Đặc điểm sinh học của Tôm Sú
• 2.3. Khả năng thích ứng với điều kiện môi trƣờng
• 2.4. Đặc điểm sinh trƣởng của Tôm Sú
• 2.5. Tầm quan trọng của việc lập bản đồ và giải mã hệ gen của Tôm Sú
• 2.6. Các công trình nghiên cứu về Tôm Sú
• 2.7. Tình hình nghiên cứu trên Thế giới
• 2.8. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam
• 2.9. Khái quát về hệ phiên mã
• 2.10. Giới thiệu về công nghệ giải trình tự thế hệ mới
• 3. CHƯƠNG III: VẬT LIỆU, NỘI DUNG, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Trang thiết bị
• 3.2. Nội dung nghiên cứu
• 3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
• 3.4. Phƣơng pháp tách chiết và tinh chế mRNA tổng số từ mô Cơ
• 3.5. Khuếch đại các đoạn DNA đã gắn Adaptor
• 4. CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ THẢO LUẬN KẾT LUẬN KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu hệ phiên mã tôm sú Penaeus monodon tại Việt Nam

Nghiên cứu hệ phiên mã của tôm sú Penaeus monodon tại Việt Nam đóng vai trò quan trọng trong việc phát triển ngành nuôi trồng thủy sản. Tôm sú là loài thủy sản có giá trị kinh tế cao, được nuôi trồng rộng rãi. Việc hiểu rõ hệ phiên mã giúp cải thiện chất lượng giống và năng suất nuôi trồng. Nghiên cứu này không chỉ cung cấp thông tin về gen mà còn giúp phát hiện các gen liên quan đến khả năng chống chịu bệnh tật.

1.1. Đặc điểm sinh học của tôm sú Penaeus monodon

Tôm sú có kích thước lớn và màu sắc đặc trưng. Chúng có khả năng thích ứng với nhiều điều kiện môi trường khác nhau. Việc nghiên cứu đặc điểm sinh học giúp xác định các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển và sinh sản của tôm sú.

1.2. Tầm quan trọng của nghiên cứu hệ phiên mã

Nghiên cứu hệ phiên mã giúp hiểu rõ hơn về sự biểu hiện gen trong các điều kiện khác nhau. Điều này có thể dẫn đến việc phát triển các phương pháp nuôi trồng hiệu quả hơn và giảm thiểu thiệt hại do dịch bệnh.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu hệ phiên mã tôm sú

Ngành nuôi tôm tại Việt Nam đang đối mặt với nhiều thách thức, bao gồm dịch bệnh và biến đổi khí hậu. Việc nghiên cứu hệ phiên mã giúp xác định các gen liên quan đến khả năng chống chịu bệnh tật. Tuy nhiên, việc thu thập và phân tích dữ liệu gen gặp nhiều khó khăn do kích thước genome lớn và chi phí cao.

2.1. Các vấn đề về dịch bệnh trong nuôi tôm

Dịch bệnh do virus là một trong những nguyên nhân chính gây thiệt hại cho ngành nuôi tôm. Việc phát hiện và kiểm soát dịch bệnh kịp thời là rất cần thiết để bảo vệ sản xuất.

2.2. Biến đổi khí hậu và ảnh hưởng đến tôm sú

Biến đổi khí hậu ảnh hưởng đến môi trường sống của tôm sú, làm thay đổi các yếu tố như nhiệt độ và độ mặn. Nghiên cứu hệ phiên mã giúp hiểu rõ hơn về cách tôm sú thích ứng với những thay đổi này.

III. Phương pháp nghiên cứu hệ phiên mã tôm sú hiệu quả

Nghiên cứu hệ phiên mã tôm sú sử dụng các phương pháp hiện đại như giải trình tự thế hệ mới (NGS). Phương pháp này cho phép thu thập dữ liệu gen một cách nhanh chóng và chính xác. Việc tách chiết mRNA từ mô cơ cũng là một bước quan trọng trong nghiên cứu này.

3.1. Tách chiết và tinh chế mRNA từ mô cơ

Quá trình tách chiết mRNA từ mô cơ tôm sú cần được thực hiện cẩn thận để đảm bảo chất lượng mẫu. Việc này giúp thu được mRNA đủ tiêu chuẩn cho các phân tích tiếp theo.

3.2. Giải trình tự gen thế hệ mới

Giải trình tự gen thế hệ mới cho phép phân tích nhanh chóng và hiệu quả hệ phiên mã. Phương pháp này giúp phát hiện các gen mới và đánh giá mức độ biểu hiện của chúng trong các điều kiện khác nhau.

IV. Ứng dụng thực tiễn từ nghiên cứu hệ phiên mã tôm sú

Kết quả từ nghiên cứu hệ phiên mã có thể được ứng dụng trong việc phát triển giống tôm sú có khả năng chống chịu tốt hơn. Điều này không chỉ giúp tăng năng suất mà còn giảm thiểu thiệt hại do dịch bệnh. Các chỉ thị phân tử được phát triển từ nghiên cứu này có thể hỗ trợ trong công tác chọn giống.

4.1. Phát triển giống tôm sú bền vững

Nghiên cứu hệ phiên mã giúp xác định các gen liên quan đến khả năng sinh trưởng và chống chịu bệnh. Việc phát triển giống tôm sú bền vững sẽ góp phần nâng cao hiệu quả sản xuất.

4.2. Giảm thiểu thiệt hại do dịch bệnh

Thông qua việc hiểu rõ hệ phiên mã, các biện pháp phòng ngừa và điều trị dịch bệnh có thể được cải thiện. Điều này giúp bảo vệ ngành nuôi tôm khỏi những thiệt hại lớn.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu hệ phiên mã tôm sú

Nghiên cứu hệ phiên mã tôm sú Penaeus monodon tại Việt Nam có tiềm năng lớn trong việc cải thiện ngành nuôi trồng thủy sản. Tương lai của nghiên cứu này sẽ tập trung vào việc phát triển các giống tôm có khả năng chống chịu tốt hơn và ứng dụng công nghệ sinh học trong sản xuất. Việc hợp tác giữa các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp sẽ là chìa khóa cho sự phát triển bền vững.

5.1. Hướng nghiên cứu trong tương lai

Các nghiên cứu tiếp theo sẽ tập trung vào việc giải mã toàn bộ genome của tôm sú. Điều này sẽ cung cấp thông tin quý giá cho việc phát triển giống tôm bền vững.

5.2. Tầm quan trọng của hợp tác nghiên cứu

Hợp tác giữa các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp sẽ giúp tối ưu hóa quy trình sản xuất và nâng cao chất lượng giống tôm. Điều này sẽ góp phần vào sự phát triển bền vững của ngành nuôi tôm tại Việt Nam.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Ngành nuôi trồng thủy sản giữ vị trí trụ cột trong nền kinh tế xuất khẩu của Việt Nam, trong đó tôm sú (Penaeus monodon) đóng vai trò mũi nhọn khi chiếm hơn 50% tổng giá trị xuất khẩu mặt hàng tôm. Kim ngạch xuất khẩu tôm của nước ta tăng trưởng ấn tượng từ 2,25 tỷ USD năm 2012 lên 3,8 tỷ USD vào cuối năm 2014, với diện tích vùng nuôi vượt 600.000 ha và sản lượng đạt 270.000 tấn cung ứng tới 92 thị trường quốc tế. Tuy nhiên, sự phát triển của nghề nuôi tôm đang chịu tổn thất nặng nề từ các dịch bệnh nguy hiểm do virus gây ra như đốm trắng (WSSV), hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu (IHHNV), đầu vàng (YHV), còi (MBV) và hội chứng Taura.

Rào cản lớn nhất đối với công tác chọn tạo giống kháng bệnh và kiểm soát tăng trưởng bắt nguồn từ sự thiếu hụt dữ liệu di truyền học phân tử. Kích thước hệ gen của tôm sú rất lớn với hơn 2 tỷ cặp base (tương đương 2/3 bộ gen người), khiến việc giải mã toàn bộ genome đòi hỏi kinh phí lên tới hàng chục triệu USD. Do đó, nghiên cứu hệ phiên mã (transcriptome) từ mô cơ là hướng tiếp cận chiến lược nhằm khám phá các gen mã hóa chức năng với chi phí tối ưu.

Mục tiêu cụ thể của đề tài là tách chiết, tinh sạch mRNA chất lượng cao từ mô cơ tôm sú tại Việt Nam, đánh giá tiêu chuẩn thư viện cDNA, tiến hành giải trình tự trên hệ thống giải trình tự thế hệ mới Illumina MiSeq với công suất 8 Gb và xử lý tin sinh học để lắp ráp de novo hệ phiên mã. Đề tài được triển khai trong giai đoạn 2012-2014 trên các cá thể tôm sú thu thập tại vùng biển Nghệ An (Bắc Trung Bộ). Kết quả nghiên cứu đặt nền tảng dữ liệu sinh học phân tử phục vụ trực tiếp cho chiến lược nhân giống tôm bản địa bền vững và nâng cao năng suất thủy sản quốc gia.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng thuyết di truyền học phân tử trung tâm và cơ chế biểu hiện gen ở sinh vật nhân thực (Eukaryote). Quá trình phiên mã tạo ra tiền mRNA trải qua ba bước hoàn thiện gồm gắn mũ 7-methylguanosine ở đầu 5', bổ sung đuôi polyA ở đầu 3' và quá trình cắt nối intron-exon nhờ phức hợp spliceosome để hình thành mRNA hoàn chỉnh. Do các cơ chế biến đổi sau phiên mã và ghép nối luân phiên, số lượng phân tử mRNA trong transcriptome đa dạng hơn nhiều so với số lượng gen gốc trong bộ gen.

Lý thuyết giải trình tự hệ phiên mã bằng công nghệ RNA-Seq kết hợp kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới (Next-Generation Sequencing - NGS) đóng vai trò khung phân tích chính. Nguyên lý đọc trình tự bằng tổng hợp (Sequencing by Synthesis - SBS) trên vi bản dòng chảy (Flow Cell) cho phép khuếch đại cầu nối tạo các cụm DNA đồng nhất và ghi nhận tín hiệu huỳnh quang thời gian thực với độ chính xác cao.

Các khái niệm then chốt được tích hợp bao gồm: Thẻ trình tự biểu hiện (EST - Expressed Sequence Tag), cấu trúc cụm DNA trên Flow Cell, lắp ráp de novo không cần bộ gen tham chiếu, đơn vị đoạn ghép liền kề (Contig) và gen đơn nhất đại diện (Unigene).

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu thực hiện trên cỡ mẫu gồm 10 cá thể tôm sú tự nhiên thu thập từ vùng biển Nghệ An. Phương pháp chọn mẫu áp dụng quy trình lấy mẫu ngẫu nhiên phân tầng kết hợp kiểm định chẩn đoán phân tử để chọn các cá thể khỏe mạnh, âm tính 100% với 5 loại virus nguy hiểm: WSSV, IHHNV, YHV, MBV và Taura.

Quy trình tách chiết sử dụng 100 mg mô cơ đồng hóa trong hóa chất Trizol, sau đó tinh sạch mRNA bằng hạt từ tính Dynabeads mRNA DIRECT Micro Kit theo cơ chế bắt cặp bổ sung oligo(dT) với đuôi polyA. Thư viện cDNA sợi kép được tổng hợp qua enzyme phiên mã ngược, phân cắt đoạn ở 94 độ C trong 8 phút, gắn adapter chuyên biệt và khuếch đại qua 14 chu kỳ PCR. Chất lượng và kích thước phân đoạn thư viện được kiểm định trên thiết bị Bioanalyzer trước khi nạp vào hệ thống Illumina MiSeq với chiều dài đọc 250 bp dạng paired-end.

Phương pháp phân tích dữ liệu sử dụng phần mềm cutadapt để cắt bỏ adapter và loại bỏ các chuỗi đọc có chỉ số chất lượng Phred dưới 20 hoặc tỷ lệ base sai lệch vượt quá 2%. Phần mềm Trinity được lựa chọn để lắp ráp de novo các transcript nhờ khả năng tối ưu hóa đồ thị de Bruijn cho dữ liệu RNA-Seq sinh vật chưa có bộ gen chuẩn, kết hợp công cụ TGICL để gom cụm và triệt tiêu độ dư thừa trình tự. Toàn bộ quá trình thực nghiệm và phân tích dữ liệu được hoàn thành trong lộ trình 24 tháng.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Thứ nhất, quy trình tách chiết RNA tổng số từ mô cơ của 10 mẫu tôm sú Nghệ An cho hiệu suất cao và độ ổn định đồng đều. Hàm lượng RNA tổng số thu được dao động từ 2152,1 ng đến 2425,9 ng, trong đó hai mẫu có nồng độ cao nhất là NA9 đạt 2385,8 ng và NA10 đạt 2425,9 ng được chọn lọc để phục vụ các phản ứng tinh chế chuyên sâu tiếp theo.

Thứ hai, quá trình tinh sạch mRNA bằng hạt từ tính ghi nhận các chỉ số quang phổ xuất sắc. Độ tinh sạch qua tỷ số hấp thụ A260/A280 của các mẫu mRNA đều vượt ngưỡng tiêu chuẩn 1,80, nồng độ đạt trên 20 ng/µl. Thư viện cDNA sau bước khuếch đại PCR (mẫu GM4) đạt nồng độ 17,1 ng/µl với dải kích thước đoạn chèn phân bố tối ưu từ 264 bp đến 500 bp trên hệ thống phân tích Bioanalyzer.

Thứ ba, dữ liệu giải trình tự trên hệ thống Illumina MiSeq đạt chất lượng đọc vượt trội với tỷ lệ sai sót dưới 2% trên 100 chu kỳ đọc paired-end. Dữ liệu sau tiền xử lý loại bỏ hoàn toàn các chuỗi adapter và loại bỏ triệt để các base chất lượng thấp dưới 20. Quá trình lắp ráp de novo bằng phần mềm Trinity và TGICL đã tái cấu trúc thành công hàng nghìn transcript và unigene đặc trưng cho hệ phiên mã mô cơ tôm sú Việt Nam.

Thảo luận kết quả

Hiệu suất thu hồi RNA và mRNA tinh khiết đạt chất lượng vượt trội nhờ việc tối ưu hóa quy trình đồng hóa mô cơ bằng Trizol trong nitơ lỏng và phân tách đặc hiệu qua hạt từ Dynabeads, giúp loại bỏ hơn 95% RNA ribosome gây nhiễu. Việc duy trì phân đoạn cDNA trong khoảng 264-500 bp đảm bảo hiệu quả tạo cụm đồng nhất trên bề mặt Flow Cell của máy Illumina MiSeq.

So với các công trình trước đây tại Việt Nam sử dụng máy đọc thế hệ cũ ABI PRISM 3100 theo phương pháp Sanger vốn chỉ thu được vài chục đoạn cDNA ngắn với chi phí rất cao, việc ứng dụng thành công công nghệ NGS trong đề tài đã tạo bước đột phá về dung lượng dữ liệu và tiết kiệm thời gian phân tích. Kết quả này tương đồng với định hướng của các trung tâm nghiên cứu hàng đầu tại Thái Lan (công bố 4.845 trình tự EST duy nhất) và Hoa Kỳ (công bố 13.656 EST trên tôm thẻ).

Dữ liệu chất lượng giải trình tự và phân bố độ dài đoạn đọc được hệ thống hóa trực quan thông qua các biểu đồ phân bố điểm chất lượng Phred theo vị trí chu kỳ và biểu đồ tần số chiều dài contigs lắp ráp. Các bảng thống kê quang phổ NanoDrop và hình ảnh điện di mao quản Bioanalyzer đã minh chứng rõ nét tính toàn vẹn của thư viện gen trước khi tiến hành phân tích chức năng sinh học.

Đề xuất và khuyến nghị

Thứ nhất, số hóa và mở rộng ngân hàng dữ liệu hệ phiên mã quốc gia: Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam cùng Viện Công nghệ sinh học cần chủ trì xây dựng cơ sở dữ liệu số hóa lưu trữ hơn 50.000 unigene và EST của tôm sú bản địa trong lộ trình 12 tháng tới, tạo cổng truy cập mở cho cộng đồng nghiên cứu thủy sản.

Thứ hai, thiết kế bộ chỉ thị phân tử phục vụ chọn giống tăng trưởng nhanh: Các Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản cần ứng dụng tập dữ liệu unigene mô cơ để sàng lọc và phát triển 500 chỉ thị microsatellite (SSR) cùng chỉ thị đa hình đơn nucleotide (SNP) liên quan đến tính trạng khối lượng cơ và chu kỳ lột xác trong thời gian 18 tháng.

Thứ ba, ứng dụng công nghệ RNA-Seq vào quy trình kiểm soát dịch bệnh: Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn cần ban hành tiêu chuẩn kỹ thuật áp dụng công nghệ NGS để tầm soát sớm 5 tác nhân virus nguy hiểm (WSSV, IHHNV, YHV, MBV, Taura) với độ nhạy mục tiêu đạt trên 99,5% tại các cơ sở tôm giống trọng điểm ven biển giai đoạn 2025-2027.

Thứ tư, đầu tư hạ tầng thiết bị và đào tạo nhân lực tin sinh học: Huy động gói kinh phí khoa học công nghệ ước tính khoảng 2 triệu USD nhằm nâng cấp hệ thống máy giải trình tự công suất cao và đào tạo chuyên gia phân tích dữ liệu de novo transcriptome trong giai đoạn 3 năm, mở rộng giải mã hệ phiên mã đa mô như gan tụy, cơ quan tạo máu và buồng trứng tôm sú.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nhóm 1: Học viên cao học, nghiên cứu sinh và giảng viên chuyên ngành Công nghệ sinh học, Sinh học thực nghiệm và Di truyền học. Luận văn cung cấp tài liệu tham khảo chi tiết về quy trình kỹ thuật chuẩn bị thư viện RNA-Seq, tách chiết mRNA bằng hạt từ tính và thuật toán lắp ráp de novo transcriptome bằng công cụ Trinity và TGICL.

Nhóm 2: Các nhà khoa học và chuyên gia chọn tạo giống thủy sản tại các viện nghiên cứu chuyên ngành. Dữ liệu hệ phiên mã mô cơ là nguồn tài nguyên quý giá để tra cứu các con đường chuyển hóa năng lượng, sinh tổng hợp protein cơ và phát triển chỉ thị phân tử phục vụ gia hóa đàn tôm bố mẹ.

Nhóm 3: Kỹ sư công nghệ sinh học và nhà quản lý kỹ thuật tại các doanh nghiệp sản xuất tôm giống quy mô công nghiệp. Luận văn cung cấp giải pháp ứng dụng công nghệ phân tử để kiểm soát độ thuần di truyền và phát hiện sớm mầm bệnh, bảo đảm năng suất xuất khẩu sang 92 thị trường thế giới.

Nhóm 4: Cán bộ quản lý ngành nông nghiệp và cơ quan hoạch định chính sách kinh tế thủy sản. Tài liệu cung cấp luận cứ khoa học vững chắc để xây dựng các chương trình phát triển giống tôm bản địa chất lượng cao, phục vụ quy hoạch bền vững hơn 600.000 ha diện tích nuôi tôm nước lợ trên cả nước.

Câu hỏi thường gặp

Câu hỏi 1: Tại sao nghiên cứu lại lựa chọn mô cơ của tôm sú thay vì các cơ quan khác? Mô cơ là bộ phận chiếm tỷ trọng sinh khối lớn nhất và quyết định trực tiếp đến tốc độ tăng trọng (10-15% mỗi chu kỳ lột xác) cũng như giá trị thương phẩm của tôm sú. Việc phân tích hệ phiên mã mô cơ giúp giải mã trực tiếp các gen liên quan đến quá trình phát triển sợi cơ, cấu trúc protein co rút và các con đường chuyển hóa năng lượng phục vụ công tác chọn giống cao sản.

Câu hỏi 2: Công nghệ giải trình tự NGS Illumina MiSeq có ưu điểm gì vượt trội so với phương pháp Sanger truyền thống? Hệ thống Illumina MiSeq cho phép đọc hàng triệu phân tử DNA đồng thời với công suất đạt tới 8 Gb dữ liệu trong một lần chạy và chiều dài đọc lên đến 250 bp paired-end. Phương pháp này giảm thiểu hơn 80% chi phí và thời gian giải mã so với kỹ thuật Sanger, đồng thời tạo ra độ sâu bao phủ lớn giúp phát hiện chính xác các transcript biểu hiện ở mức độ thấp.

Câu hỏi 3: Tiêu chuẩn nào để đánh giá mẫu mRNA và cDNA đạt chất lượng cho giải trình tự NGS? Mẫu mRNA phải đạt nồng độ tối thiểu trên 20 ng/µl cùng tỷ số hấp thụ quang học A260/A280 từ 1,80 trở lên để bảo đảm không lẫn protein và muối khoáng. Thư viện cDNA sau khuếch đại cần đạt nồng độ trên 15 ng/µl (mẫu GM4 đạt 17,1 ng/µl) với kích thước phân đoạn đồng nhất từ 264 bp đến 500 bp trên thiết bị phân tích mao quản Bioanalyzer.

Câu hỏi 4: Tại sao cần kết hợp cả hai phần mềm Trinity và TGICL trong xử lý tin sinh học? Phần mềm Trinity thực hiện nhiệm vụ lắp ráp de novo các đoạn đọc ngắn thành các transcript hoàn chỉnh mà không cần hệ gen tham chiếu thông qua thuật toán đồ thị de Bruijn. Sau đó, phần mềm TGICL tiếp tục xử lý để gom cụm các transcript trùng lặp và loại bỏ tính dư thừa dữ liệu, tạo ra tập hợp các unigene đại diện chuẩn xác nhất cho mô cơ.

Câu hỏi 5: Kết quả giải mã transcriptome mô cơ đóng góp gì trực tiếp cho ngành tôm Việt Nam? Nghiên cứu cung cấp cơ sở dữ liệu gen tham chiếu phục vụ phát triển các bộ kit chẩn đoán phân tử và chỉ thị di truyền chọn giống tôm lớn nhanh, kháng bệnh. Đây là chìa khóa khoa học giúp nâng cao tỷ lệ sống của tôm nuôi, giảm thiểu thiệt hại từ dịch bệnh và thúc đẩy mục tiêu kim ngạch xuất khẩu tôm vượt mốc 3,8 tỷ USD bền vững.

Kết luận

• Tách chiết thành công RNA tổng số chất lượng cao từ 10 mẫu tôm sú tự nhiên tại Nghệ An với hàm lượng dao động ổn định từ 2152,1 ng đến 2425,9 ng.
• Tinh sạch mRNA đạt độ tinh khiết quang phổ chuẩn với A260/A280 trên 1,80 và tạo lập thư viện cDNA đạt nồng độ 17,1 ng/µl với kích thước tối ưu 264-500 bp.
• Vận hành thành công hệ thống giải trình tự thế hệ mới Illumina MiSeq công suất 8 Gb với tỷ lệ sai số kiểm soát dưới 2%.
• Lắp ráp de novo hoàn chỉnh hệ phiên mã mô cơ tôm sú bằng công cụ Trinity và TGICL, cung cấp hàng nghìn unigene chức năng có giá trị khoa học cao.
• Đặt nền móng dữ liệu sinh học phân tử vững chắc cho các chương trình chọn tạo giống tôm bản địa, hướng tới nâng cao giá trị ngành tôm xuất khẩu 3,8 tỷ USD.

Kế hoạch phát triển tiếp theo tập trung vào việc khai thác chỉ thị phân tử và giải trình tự bổ sung các mô miễn dịch trong vòng 12 đến 24 tháng tới. Các viện nghiên cứu, trường đại học và doanh nghiệp thủy sản hãy chủ động liên kết, khai thác nguồn dữ liệu transcriptome này để thúc đẩy các dự án gia hóa giống tôm sú công nghệ cao tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Nuôi trồng thuỷ sản là ngành kinh tế quan trọng đóng góp một phần đáng kể trong thị phần xuất khẩu của Việt Nam cũng nhƣ nhiều quốc gia trong khu vực. Trong đó, ngành nuôi tôm là một trong những ngành mũi nhọn mang lại nguồn ngoại tệ lớn. Chiến lƣợc phát triển ngành nuôi trồng tôm sú ở Việt Nam cũng nhƣ của các nƣớc trong khu vực là làm sao để có đƣợc ngành sản xuất tôm sú bền vững, hạn chế đƣợc tối thiểu các tác động tiêu cực đến môi trƣờng, sinh thái. Nền tảng cho chiến lƣợc phát triển này là phát triển nguồn tôm bản địa với các chƣơng trình nhân giống khoa học để nâng cao tỷ lệ sống và sự tăng trƣởng.

Để đạt đƣợc mục đích này, việc nghiên cứu cấu trúc và chức năng của toàn bộ hệ gen (genome) tôm sú là một vấn đề khoa học cơ bản có định hƣớng ứng dụng hết sức quan trọng. Tôm sú (Penaeus monodon) là loài thủy sản đƣợc nuôi trồng và mang lại lợi nhuận rất lớn nhờ xuất khẩu cho nhiều quốc gia ở châu Á - Thái Bình Dƣơng (Thái Lan, Việt Nam, Hàn Quốc, Đài Loan, Malaysia, Indonesia, Ấn Độ, Autralia v. Năm 2008, tổng sản lƣợng tôm trên toàn thế giới đạt 6 triệu tấn, đạt giá trị thƣơng mại 10 tỷ USD, chiếm 16% tổng kim ngạch xuất khẩu hải sản (Leu và cs, 2010). Riêng ở Việt Nam, theo Hội nghị tổng kết xuất khẩu tôm năm 2012 do VASEP tổ chức vào ngày 28/12/2012 tại thành phố Hồ Chí Minh thì kim ngạch xuất khẩu tôm năm 2012 đạt khoảng 2,25 tỷ USD.

Ngày 2/11/2014, tại hội nghị tổng kết nuôi tôm nƣớc lợ 2014 cho biế t: 9 tháng đầu năm 2014 xuấ t khẩ u tôm của Viê ̣t Nam đa ̣t gầ n 2,94 tỷ USD , tăng 42% so với cùng kỳ. Đến cuối năm dự báo xuất khẩu tôm sẽ đạt mức 3,8 tỷ USD. Xuất khẩu tôm nhiều năm liền độc chiếm ngôi đầu, chiếm trên 50% tỷ trọng xuất khẩu thuỷ sản của cả nƣớc. Ở nƣớc ta nghề nuôi tôm sú Penaeus monodon đã và đang phát triển mạnh trong những năm gần đây.

Thống kê cho thấy, năm 2012 tổng diện tích nuôi tôm trên cả nƣớc là 530000 héc ta (ha). Dự kiến năm 2014, con số này sẽ tăng lên Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – 1ĐHTN http://www.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] đến 600000 ha và sản lƣợng dự kiến sẽ là 270000 tấn. Sản lƣợng nuôi tôm sú qua các năm tăng mạnh kéo theo giá trị xuất khẩu tôm sú cũng tăng nhanh tạo ra nguồn lợi đáng kể cho kinh tế nƣớc ta.Việt Nam xuất khẩu tôm vào 92 thị trƣờng, trong đó tôm sú chiếm trên 50% giá trị xuất khẩu mặt hàng tôm. Tuy nhiên, nghề nuôi tôm của nƣớc ta hàng năm chịu thiệt hại rất lớn do dịch bệnh, trong đó dịch bệnh do virus đóng vai trò chủ yếu.

Vì vậy, việc kiểm tra, phát hiện kịp thời các tác nhân gây bệnh để đề ra biện pháp phòng chống, giảm thiểu thiệt hại tới mức thấp nhất cho ngành nuôi tôm là vấn đề đƣợc nhiều cơ sở nghiên cứu quan tâm. Cho đến nay, những hiểu biết cơ bản về sự sinh sản, hệ miễn dịch và đặc biệt là sự điều khiển sinh trƣởng của tôm sú còn rất hạn chế do những thiếu sót thông tin về genome và sự biểu hiện gen của chúng. Kích thƣớc genome của tôm sú cũng rất lớn (khoảng trên 2 tỉ cặp base = 2/3 bộ gen ngƣời), nên việc giải mã toàn bộ genome tôm sú đòi hỏi nhiều thời gian và chi phí rất lớn, ƣớc tính hàng chục triệu đô la. Vì vậy một trong những hƣớng nghiên cứu đƣợc lựa chọn là lập bản đồ di truyền liên kết genome tôm sú, lập bản đồ di truyền từ DNA vi vệ tinh hay lập bản đồ gen tôm sú từ giải mã EST/cDNA, bằng việc lựa chọn những gen ứng viên dự báo phù hợp với mục đích nghiên cứu, ta có thể xây dựng đƣợc các chỉ thị phân tử phục vụ cho công tác chọn giống, nghiên cứu cấu trúc và chức năng của các gen liên quan.

Việc nghiên cứu giải mã và lập bản đồ bộ gen thƣờng tập trung vào các đối tƣợng có giá trị kinh tế cao. Nhƣ đã trình bày ở trên, tôm sú là đối tƣợng nuôi trồng có giá trị kinh tế mang tính chiến lƣợc. Chính vì vậy việc phối hợp giữa các quốc gia nhằm giải mã và lập bản đồ gen tôm sú sẽ mang lại lợi ích chung cho cộng đồng và cũng là cho mỗi quốc gia. Nghiên cứu hệ gen phiên mã (transcriptome) là một hƣớng nghiên cứu quan trọng, tập chung nghiên cứu gen mã hóa protein và mức độ biểu hiện của chúng trong từng loại mô cơ quan, từng giai đoạn của quá trình phát triển hay trong các điều kiện môi trƣờng khác nhau.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – 2ĐHTN http://www.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Trong khuôn khổ của đề tài chúng tôi tiến hành nghiên cứu mô Cơ của Tôm Sú. Hiện nay, kết quả nghiên cứu từ mô Cơ của Tôm Sú là những dữ liệu quan trọng phục vụ cho việc giải trình tự hệ phiên mã. Chính vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu hệ phiên mã từ mô Cơ của Tôm Sú (penaues monodon) tại Việt Nam” 1. Mục tiêu đề tài - Tách chiết và tinh sạch đƣợc ARN thông tin (mRNA) từ mô cơ của Tôm Sú.

- Đánh giá đƣợc chất lƣợng mRNA đủ tiêu chuẩn cho việc giải trình tự hệ phiên mã của Tôm Sú bằng máy xác định trình tự gen thế hệ mới - Chuẩn bị đƣợc mẫu, cho đi giải trình tự gen bằng máy xác định trình tự gen thế hệ mới - Phân tích hệ phiên mã mô cơ của Tôm Sú Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – 3ĐHTN http://www.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] CHƢƠNG II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Đại cƣơng về Tôm Sú 2. Đặc điểm sinh học của Tôm Sú Cơ thể tôm sú có màu xanh đậm, có những vân sắc tố trắng đen ở các đốt bụng. Phần còn lại của thân biến đổi từ màu nâu sang màu xanh hoặc đỏ.

Trong các loài tôm nuôi, tôm sú là loài có kích thƣớc lớn (có thể lên đến 330 mm hoặc lớn hơn về chiều dài cơ thể) và là loài tôm thƣơng mại quan trọng. Hình 1 Hình ảnh tôm sú 2. Phân loại Tôm sú có tên tiếng Anh là Black tiger shrimp. Chúng thuộc ngành Arthropoda; phân ngành Crustacea; lớp Malacostraca; bộ Decapoda; phân bộ Dendrobranchiata; họ Penaeidea; giống Penaeus; loài Penaeus Monodon.

Cấu tạo Phần đầu trên của tôm sú Penaeus Monodon có chủy cứng với các răng cƣa. Phía trên của chủy có từ 7 đến 8 răng và phía dƣới chủy có 3 răng. Ở tôm sú, mũi khứu giác và râu là cơ quan nhận biết và giữ thăng bằng cho tôm. Trong khi đó 3 cặp chân hàm của tôm có tác dụng lấy thức ăn và và giúp cho việc bơi lội thì 5 cặp chân ngực ngoài tác dụng để lấy thức ăn chúng còn đƣợc tôm sử dụng Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – 4ĐHTN http://www.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] khi chúng bò.

Ngoài ra một cặp chân bụng khác cũng đƣợc dùng để bơi. Phần đuôi của tôm sú có 1 cặp chân đuôi để tôm có thể nhảy xa và điều chỉnh lên cao hay xuống thấp khi bơi. Bộ phận sinh dục của tôm sú thì nằm ở dƣới bụng. Tôm sú thuộc loại dị hình.

Tôm cái có kích thƣớc to hơn tôm đực. Khi tôm trƣởng thành, sự khác biệt giữa tôm đực và tôm cái rất rõ rang thông qua sự khác biệt của cơ quan sinh dục bên ngoài.Ở con đực, cơ quan sinh dục chính nẳm ở phía trong phần đầu ngực. Bên ngoài có cơ quan giao phối phụ nằm ở nhánh ngoài đôi chân ngực thứ 2. Lỗ sinh dục đực mở ra hốc hang đôi chân ngực thứ 5.

Tinh trùng của loài này thƣợng đƣợc chứa trong túi. Ở tôm cái, buồng trứng nằm dọc theo mặt lƣng phía trên với hai ống dẫn trứng mở ra ở khớp hang đôi chân ngực thứ 3. Bộ phận chứa túi tinh gồm 2 tấm phồng lên ở đôi chân ngực thứ 4 và thứ 5 dƣới bụng tôm. Phân bố Tôm sú có phạm vi phân bố rộng, từ ấn Độ Dƣơng qua hƣớng Nhật Bản, Đài Loan, phía Đông Tahiti, phía Nam châu Úc và phía Tây châu Phi (Racek - 1955, Holthuis và Rosa - 1965, Motoh - 1981, 1985) Nhìn chung, tôm sú phân bố từ kinh độ 30E đến 155E từ vĩ độ 35N tới 35S xung quanh các nƣớc vùng xích đạo, đặc biệt là Indonesia, Malaixia, Philippines và Việt Nam.

Riêng ở Việt Nam Tôm Sú phân bố rộng từ Bắc tới Nam, từ ven bờ đến vùng có độ sâu 40m. Tròn đó vùng phân bố chính là vùng biển miền Trung. Tôm bột , tôm giống (Juvenile) và tôm gần trƣởng thành có tập tính sống gần bờ biển và rừng ngập mặn ven bờ. Tuy nhiên, khi tôm trƣởng thành di chuyển xa bờ vì những vùng nƣớc sâu là nơi sống ƣa thích của chúng.

Sự phân bố của Tôm Sú phụ thuộc vào giai đoạn phát triển 2. Chu kỳ sống của Tôm Sú Ấu trùng tôm sú (Nauplli) đƣợc biến đổi theo 5 giai đoạn trong vòng từ 36 đến 51 giờ. Các ấu trùng tôm này thƣờng bơi từng đoạn ngắn rồi nghỉ. Đối với giai đoạn này, ngƣời ta không cần cung cấp thức ăn vì chúng tự sống bằng noãn hoàng.

Chúng lột vỏ 4 lần, mỗi lần khoảng 7 giờ. Về kích thƣớc, nauplli 1 dài Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – 5ĐHTN http://www.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.20mm; nauplli 2 dài khoảng 0.20mm; nauplli 3 dài khoảng 0.20mm; nauplli 4 dài khoảng 0.20mm; nauplli 5 dài khoảng 0.20mm; Zoea đƣợc chia thành 3 giai đoạn diễn ra trong vòng từ 105 đến 120 giờ. Ở gian đoạn này, các Zoea bơi liên tục gần mặt nƣớc và lột vỏ 2 lần, mỗi lần khoảng 36 giờ, ăn thực vật phù du. Về kích thƣớc, zoea 1dài khoảng 1mm, dày 0.

Vào thời điểm này zoea xuất hiện hai phần dầu và bụng rõ rệt. Zoea 2 dài khoảng 1.9mm với sự xuất hiện mặt và chủy trong khi đó zoea 3 dài khoảng 2.7mm với gai trên bụng. Mysis cũng đƣợc chia ra làm 3 giai đoạn, diễn ra trong vòng 72 giờ. Các mysis bơi hƣớng xuống sâu và đuôi đi trƣớc, đầu đi sau.

Về kích thƣớc, mysis 1 dài khoảng 3.4mm, có hình dạng của tôm trƣởng thành. Ở giai đoạn này, tôm xuất hiện các cặp chân bụng, đuôi và quạt đuôi. Các gai bụng đƣợc thu nhỏ lại. Mysis 2: dài khoảng 4.0mm và mysis 3 dài khoảng 4.4mm, chân bụng dài hơn, phân thành đốt nhỏ, xuất hiện răng trên chủy.