MỞ ĐẦU Tôm sú (Penaeus monodon) là loài thủy sản mang lại giá trị kinh tế lớn, hiện nay đang được nhiều nước chú trọng phát triển nhưThái Lan, Việt Nam, Hàn Quốc, Đài Loan, Malaysia, Indonesia, Ấn Độ…[63]. Nghề nuôi tôm sú có ưu thế lớn với các nước này vì đó là nguồn tài nguyên bản địa có thể nuôi và khai thác lâu dài, đóng góp quan trọng vào vấn đề an toàn lương thực, xóa đói giảm nghèo và phát triển kinh tế xã hội của mỗi nước. Chiến lược phát triển lâu dài của toàn khu vực là có được ngành sản xuất tôm sú bền vững, hạn chế tối thiểu các tác động tiêu cực đến môi trường sinh thái. Nền tảng cho chiến lược phát triển này là phát triển nguồn tôm bản địa với các chương trình nhân giống khoa học để nâng cao tỷ lệ sống và sự tăng trưởng.
Để đạt được mục đích này, việc nghiên cứu cấu trúc và chức năng của toàn bộ hệ gen tôm sú là một vấn đề khoa học cơ bản có định hướng ứng dụng hết sức quan trọng. Nghiên cứu hệ gen tôm sú sẽ cung cấp thông tin chính xác cho việc xác định các tính trạng quan trọng như: tính trạng tăng trưởng, tính kháng bệnh, tính chống chịu với điều kiện môi trường, các tính trạng liên quan đến chất lượng tôm. Do kích thước hệ gen tôm sú rất lớn, khoảng 2,17 Gb [76] nên việc giải mã toàn bộ hệ gen tôm sú đòi hỏi thời gian và tốn nhiều kinh phí. Vì vậy, để có thể từng bước khai thác các thông tin cần thiết từ hệ gen tôm sú phục vụ thực tiễn sản xuất thì việc giải mã từng phần hệ gen như giải mã hệ phiên mã, giải mã từng phân đoạn trong hệ gen có định hướng sử dụng kỹ thuật GBS (Genome typing by Sequencing) với phương pháp xác định trình tự gen thế hệ mới NGS (Next generation sequencing) là cách tiếp cận thông minh và khả thi.
Hệ phiên mã là tập hợp tất cả các phân tử RNA trong cơ thể sinh vật có khả năng mã hóa protein [18], là cầu nối từ thông tin trình tự hệ gen đến chức năng của hệ protein. Chính vì vậy phân tích hệ phiên mã sẽ giúp chúng ta thu được những kết quả sâu hơn khi phân tích chức năng của protein tương ứng. Sự ra đời của công nghệ giải trình tự thế mới (NGS) đã tạo điều kiện thuận lợi để thu nhận và khai thác 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com thông tin về hệ gen và hệ phiên mã của sinh vật [71]. RNA-seq là công nghệ giải trình tự thế hệ mới với đối tượng là RNA.
RNA-seq sẽ giúp các nhà nghiên cứu có thể tìm hiểu sâu hơn thông tin liên quan trình tự hệ phiên mã và phân tích chức năng gen. Bằng phương pháp tính toán số lượng trình tự thu được từ RNA-seq, người ta có thể đánh giá được mức độ biểu hiện gen. Đây là phương pháp có khả năng thay thế được phương pháp micro-array truyền thống [71]. Hiện nay trên thế giới, nghiên cứu hệ phiên mã được chia làm 2 hướng: i) đối với đối tượng đã có dữ liệu tham chiếu cần sử dụng phương pháp re-sequencing; ii) với những dự án thực hiện trên những loài chưa có dữ liệu tham chiếu cần tiếp cận theo phương pháp lắp ráp de novo [28],[47],[59],60].
Do chưa có hệ phiên mã tham chiếu, nên đối với loài tôm sú Penaeus monodon, từ dữ liệu giải trình tự thế hệ mới hệ phiên mã từ mô cơ và mô gan tụy tôm sú thu nhận từ vùng biển Bắc Trung Bộ Việt Nam, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Phân tích hệ phiên mã và sàng lọc một số gen giả định liên quan tới tính trạng tăng trưởng ở tôm sú Penaeus monodon”. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài: - Xây dựng bản đồ hệ phiên mã từ mô cơ và mô gan tụy của tôm sú Penaeus monodon thu nhận từ vùng biển Bắc Trung Bộ Việt Nam. - Sàng lọc các gen giả định liên quan đến tính trạng tăng trưởng của tôm sú. - Phân tích biểu hiện hệ phiên mã từ mô cơ và mô gan tụy tôm sú Penaeus monodon.
Đề tài được thực hiện tại Phòng Vi sinh vật học phân tử và Phòng Tin sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chƣơng 1 – TỔNG QUAN 1. Giới thiệu về tôm sú Tôm sú là một trong các loài tôm nuôi quan trọng thuộc họ Penaeidae, và được phân loạinhư sau [1],[31]: Ngành: Arthropoda (Chân khớp) Lớp: Crustacea (Giáp xác) Bộ: Decapoda (Mười chân) Họ: Penaeidae (Tôm he) Chi: Penaeus Loài: Penaeus monodon Tên tiếng Anh: Black Tiger Shrimp Tên địa phương : Tôm Sú , tôm Rong. Tôm sú thu đƣợc từ vùng biển Nghệ An, Việt Nam.
3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Về đặc điểm sinh học, tôm sú là loài sống ở nơi chất đáy là bùn pha với cát ở độ sâu ven bờ đến 40m nước và độ mặn từ 5 – 34 ‰.Tôm sú có đặc điểm thường sinh trưởng nhanh, trong 3 – 4 tháng có thể đạt cỡ trung bình 40 – 50 g. Tôm sú thuộc loại dị hình phái tính, con cái có kích thước lớn hơn con đực ở cùng độ tuổi. Tôm trưởng thành tối đa với con cái có chiều dài từ 220 – 250 mm, trọng lượng đạt từ 100 – 300 g, con đực dài từ 160 – 200 mm, trọng lượng đạt từ 80 – 200 g. Tôm có tính ăn tạp, thức ăn ưa thích là các loài nhuyễn thể, giun nhiều tơ và giáp xác.
Về mặt phân bố, ở nước ta tôm sú phân bố từ Bắc vào Nam, vùng phân bố chính là vùng biển các tỉnh Trung bộ [3],[8]. Tôm sú là loài giáp xác có vỏ kitin bao bọc bên ngoài cơ thể nên sự phát triển của chúng mang tính gián đoạn và đặc trưng bởi sự gia tăng đột ngột về kích thước và khối lượng. Sau mỗi lần lột xác, tôm sú tăng trưởng về chiều dài và trọng lượng trung bình từ 10-15% so với trước khi lột xác. Quá trình này tùy thuộc vào môi trường nước, điều kiện dinh dưỡng và các giai đoạn phát triển của cá thể [3],[8],[9].
Trong tự nhiên, tôm sú sống trong môi trường nước mặn, tới mùa sinh sản chúng tiến vào gần bờ đẻ trứng. Có hai đặc điểm cần chú ý trong vòng đời tôm sú: tăng trưởng ở giai đoạn hậu ấu trùng xảy ra ở vùng cửa sông (đặc trưng bởi vùng nước lợ); sự chín sinh dục, kết cặp xảy ra ở ngoài khơi nơi có nồng độ muối dao động từ 28-34 ‰ và ổn định. Sau khi trứng tôm sú được đẻ 14-15 giờ, ở nhiệt độ 27-280C sẽ nở thành ấu trùng. Ấu trùng theo các làn sóng biển dạt vào các vùng nước lợ.
Trong môi trường này, ấu trùng (larvae) tiến sang thời kỳ hậu ấu trùng (postlarvae) rồi tôm giống (juvenile) và bơi ra biển tiếp tục chu trình sinh trưởng, phát triển và sinh sản của chúng [8]. 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.Tình hình nghiên cứu hệ gen và hệ phiên mã của tôm sú trên thế giới Tôm sú (Penaeus monodon) là một loài giáp xác đại dương đóng vai trò rất quan trọng trong nền công nghiệp thủy sản Việt Nam. Theo báo cáo mới nhất của chính phủ Việt Nam, sản lượng trong nước của tôm sú đạt 260.000 tấn vào năm 2014 (http://www.vn/thong-tin-huu-ich/thong-tin-thong-ke/thong-ke- 1/tinh-hinh-san-xuat-thuy-san-nam-2014). Do đó, việc tiến hành các nghiên cứu chuyên sâu ở mức độ hệ gen và hệ phiên mã sẽ mang lại một cái nhìn sâu sắc về các quá trình sinh học nhằm cải thiện năng suất nuôi trồng thủy sản tôm sú.
Cho đến nay, những hiểu biết cơ bản về sự điều khiển sinh trưởng, sinh sản và hệ thống miễn dịch ở tôm sú còn rất hạn chế do thiếu những thông tin vềhệ gen và sự biểu hiện gen của chúng. Kích thước hệ gen tôm sú rất lớn khoảng 2.17 Gb, nên việc giải mã toàn bộhệ gen tôm sú đòi hỏi nhiều thời gian và chi phí lớn, ước tính hàng chục triệu đô la. Vì vậy các nghiên cứu vềhệ gen tôm sú từ trước tới nay trên thế giới được lựa chọn là tập trung phát triển bản đồ di truyền liên kết dựa vào các chỉ thị phân tử microsatellite, single-nucleotide polymorphism (SNP) và amplified fragment length polymorphism (AFLP) [48],[73],[76]; nghiên cứu và phân tích các đoạn trình tự gen biểu hiện (Express sequence tag-EST) bằng phương pháp Sanger [41],[48],[58],[65],[66]; giải trình tự hệ gen ty thể tôm sú [72]; nghiên cứu cấu trúc và chức năng của các gen liên quan [17],[23],[65],[67]; lựa chọn các chỉ thị phân tử phục vụ công tác chọn giống [26],[48].Trong thời gian gần đây, nhóm nghiên cứu của Baranski và cộng sự (2014) đã sử dụng dữ liệu giải trình tự thế hệ mới để phát triển bản đồ di truyền liên kết ở tôm sú P. monodon, nhưng không nghiên cứu phân tích biểu hiện hay sàng lọc các gen ứng viên liên quan tới tính trạng tăng trưởng [15].
Hiện nay nguồn dữ liệu về genome tôm sú còn khá khiêm tốn. Trên ngân hàng Genbank có tổng cộng 39.908 EST được ứng dụng vào tìm kiếm các điểm đa hình (ví dụ như SNP) và có khoảng 600 trình tự microsatellite (cập nhật tháng 10 năm 2013) [11]. 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Công trình nghiên cứu đầu tiên liên quan tới hệ phiên mã của tôm Công trình đầu tiên nghiên cứu về hệ phiên mã tôm sú đã được Lehnert và cộng sự công bố vào năm 1999.
Trong công trình nghiên cứu này, 3 thư viện cDNA đã được thiết lập từ 3 mô khác nhau của tôm sú, bao gồm chân bơi, gốc mắt và hạch ngực. Các tác giả đã giải mã được 172 trình tự EST, trong đó có 88 trình tự từ hạch ngực, 56 trình tự từ gốc mắt và 32 trình tự từ chân bơi [41]. Xác định các gen liên quan tới hệ miễn dịch của tôm thông qua việc phân tích hệ phiên mã Sau công bố của Lehnert, công trình thứ hai nghiên cứu về hệ gen tôm do Gross và cộng sự thực hiện năm 2001 [27] được tập trung vào hai đối tượng quan trọng trong công nghiệp nuôi tôm của Hoa Kỳ là tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương (Litopenaeus vannamei) và tôm thẻ chân trắng Đại Tây Dương (Litopenaeus setiferus). Bốn thư viện cDNA đã được thiết lập từ hai mô có liên quan tới hệ miễn dịch của tôm (tế bào máu và tổ chức gan tụy) của hai loài tôm thẻ chân trắng nêu trên.
Tổng cộng đã có 2045 EST đã được giải trình tự, xác định được 44 gen có liên quan tới hệ miễn dịch của tôm. Chủ yếu các gen có liên quan tới hệ miễn dịch thuộc về thư viện cDNA thu từ tế bào máu (chiếm tới 27,6% ở Litopenaeus setiferus và 21,2% ở Litopenaeus vannamei).