MỞ ĐẦU Chitin, chitosan và oligochitosan đƣợc ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nhƣ: thực phẩm, nông nghiệp, y học, sản xuất mỹ phẩm, bảo quản nông sản, xử lý môi trƣờng…[26]. Chitin là một polysaccharide có nhiều trong cua, tôm, giáp xác, côn trùng và thành tế bào nấm, thực vật [28]. Việt Nam là nƣớc có nguồn thuỷ sản rất dồi dào, công nghiệp chế biến thuỷ sản cũng rất phát triển tạo ra một lƣợng lớn phụ phẩm nhƣ đầu tôm, vỏ cua, mai mực, đó chính là nguồn nguyên liệu phong phú cho công nghiệp sản xuất chitin và các dẫn xuất của nó. Hiện nay, phƣơng pháp hóa học thƣờng đƣợc sử dụng để sản xuất chitin, protein trong đầu và vỏ tôm đƣợc loại bỏ bằng cách xử lý với NaOH, sau đó đƣợc xử lý với axit HCl loãng nhằm loại muối.
Sản xuất chitosan và oligo chitosan đƣợc bắt đầu bằng quá trình loại nhóm axetyl từ chitin đƣợc thực hiện nhờ xử lý trong kiềm ở nhiệt độ cao, sau đó chitosan đƣợc xử lý với axit HCl để thu đƣợc sản phẩm là chitosan oligome. Quá trình sản xuất này cần một lƣợng hoá chất rất lớn, sự tích lũy các hóa chất này gây hại cho môi trƣờng, hơn nữa con đƣờng xử lý hoá học làm giảm chất lƣợng cũng nhƣ mức độ an toàn của sản phẩm chitosan. Để giải quyết vấn đề trên, quy trình sản xuất theo con đƣờng sinh học bằng cách sử dụng enzyme chitinase và chitin deaxetylase để sản xuất ra sản phẩm chitin, chitin oligosaccarit, chitosan có chất lƣợng cao, không gây ô nhiễm môi trƣờng đang đƣợc quan tâm. Enzyme chitinase thƣờng gặp trên nhiều loài vi sinh vật, kể cả những loài không chứa chitin, nhƣ vi khuẩn, xạ khuẩn, virut, nấm, côn trùng.
Trong đó, nấm là nhóm vi sinh vật có tiềm năng rất lớn trong việc sinh tổng hợp nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học, phân giải nhiều hợp chất phức tạp, có vai trò quan trọng trong các chu trình vật chất ngoài tự nhiên. Đặc biệt, nấm có khả năng sinh tổng hợp nhiều loại enzyme thủy phân có hoạt tính cao. Nguồn chitinase từ nấm cho hoạt tính cao, sản lƣợng lớn và ổn định. Với mong muốn tiếp tục nghiên cứu này, đề tài: Nghi n cứu các ặc tính enzyme chitinase từ nấm sợi” đƣợc thực hiện nhằm: a) Tuyển chọn chủng nấm sợi 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com sinh tổng hợp chitinase cao; b) Nắm đƣợc đặc tính enzyme chitinase từ nấm sợi.
2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chƣơng 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ CHITIN VÀ CHITOSAN 1. Chitin Trong lịch sử, chitin đƣợc phát hiện lần đầu tiên trong cặn lắng dịch chiết của nấm. Chấtnày đƣợcđặt tên"Fungine" đểghi nhớnguồn gốccủa nó[14].
Năm 1823, Odiertách chiếtmột chấttừbọ cánh cứng, màônggọi làchitinhoặc"chiton" (tiếng Hy Lạp có nghĩalàáo giáp). Tuy nhiên, ông đã không phát hiệnsự có mặtcủanitơtrongchấtnày. Odiercuối cùngkết luậnchitincócông thứcgiống nhƣcellulose[47]. Cấu trúc phân tử chitin[23] Chitinlàpolymer đứng thứ hai sau sinh khối thực vật trên trái đất vớiƣớc tính sản lƣợng sản xuấthàng nămtừ1010 đến 1011tấn.
Chitin là polysaccarit mạch thẳng, công thức chung là (C8H13O5N)ncó thể xem nhƣ là dẫn xuất của cellulose, trong đó nhóm hyđroxyl (-OH) ở nguyên tử C(2) đƣợc thay thế bằng nhóm axetyl amino (NHCOCH3) (cấu trúc I). Nhƣ vậy chitin là poly (N-axetyl-2-amino-2-deoxi-β-D- glucopyranose) liên kết với nhau bởi các liên kết β-1,4- glycoside. Trong đó các mắt xích của chitin cũng đƣợc đánh số giống nhƣ ở glucose[23]. Chitinrất phổ biếnvà có thểđƣợctìm thấyở mộtloạt cácloàinhƣtrongvỏcủađộng vật giáp xác, tronglớp biểu bìcủacôn trùngvà trongcácvách tế bàocủanấmvàmột sốtảo.
Làmộtchất rắnvô định hình, chitinmang tính chất đặc trƣng của các nhóm nàylàphần lớnkhông hòa 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com tantrongnƣớc, tan tốt trong axit loãngvàkiềm[34]. Mặc dùchitinđƣợcbiết đến với rất nhiềuứng dụng, nhƣng giá trị lớn nhất của chitin lại là chitosan – một dẫn xuất của chitin nhờ quá trình deacetyl hóa [34]. Chitosan Chitosan là một dạng chitin đã bị deacetyl hóa, nhờ enzyme chitin deacetylase xúc tác cho việc loại gốc acetyl trong các đơn vị N-acetyl glucosaminetrong phân tử chitin, chitooligosaccharit để tạo thành chitosan, oligo chitosan và glucosamine[34]. Đây là những hợp chất đƣợc ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực: xử lí nƣớc thải, dƣợc học, y học, nông nghiệp và công nghiệp.
Cấu trúc phân tử chitosan[23] Chitosan có một số đặc tính nhƣ sau[34]: - Có màu trắng hay vàng nhạt, không mùi vị - Là một chất rắn, xốp, nhẹ, hình vảy, có thể xay nhỏ theo các kích cỡ khác nhau. - Không tan trong nƣớc, dung dịch kiềm và axit đậm đặc nhƣng tan trong axit loãng (pH6), tạo dung dịch keo trong, có khả năng tạo màng tốt, nhiệt độ nóng chảy 309 – 3110C. SẢN XUẤT CHITIN, CHITOSAN VÀ OLIGO CHITOSAN 1. Sản xuất chitin, chitosan và oligo chitosan bằng con ƣờng hoá 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com học + Sản xuất chitin: Nguồn chitin thô (vỏ tôm, cua, mai mực…) đầu tiên đƣợc khử khoáng bằng cách xử lý với axit HCl loãng (0,5N-1N) nhiệt độ phòng, thời gian 24h, rửa trung tính.
Sau đó mẫu đƣợc xử lý với NaOH (0,5N-1N) để loại protein trong nhiệt độ phòng, thời gian 24h, rửa trung tính, sấy thu đƣợc chitin. Tuỳ thuộc vào loại mẫu mà quá trình xử lý cần lặp lại ở khâu axít hay bazơ để thu đƣợc mẫu chitin tinh khiết. Sản phẩm chitin thu đƣợc dạng bột không màu và tỷ lệ N- acetylglucosamine chiếm 90-95%. Đây là nguyên liệu dùng cho sản xuất chitosan, oligo chitosan [34].
+ Sản xuất chitosan: Chitin đƣợc deacetyl hóa bằng cách loại nhóm acetyl bằng NaOH đặc (40-50%) thời gian 12h, nhiệt độ cao (trên 80oC). Sản phẩm chitosan sẽ đƣợc kiểm tra bằng các chỉ tiêu chất lƣợng nhƣ: màu sắc, độ ẩm (%), hàm lƣợng tro (%), hàm lƣợng protetin (%), độ nhớt (cps), độ deacetyl hóa (%), độ tan (%), độ đục (NTU) [34]. + Sản xuất oligo chitosan: Chitosan sau khi thu đƣợc lại đƣợc xử lý với axit HCl để thu đƣợc sản phẩm là oligo chitosan (hay chitosan oligosaccharit) hoặc glucosamine GLcN (dạng monome)[34]. Các quy trình sản xuất chitin đang sử dụng hiện nay là các quy trình hóa học có sử dụng HCl và NaOH ở nồng độ cao, thời gian dài để khử khoáng và protetin nên chất lƣợng chitin, chitosan không cao, đặc biệt là sản phẩm có độ nhớt thấp, độ đục cao.
Mặc dù một số nghiên cứu gần đây cho thấy chất lƣợng chitin, chitosan có thể nâng lên khi kết hợp công đoạn tiền xử lý bằng một số axit hữu cơ nhƣ axit acetic và axit benzoic [34]. Tuy nhiên các quy trình hóa học vẫn bộc lộ nhiều nhƣợc điểm nhƣ sử dụng số lƣợng lớn hoá chất (axit, bazơ, chất tẩy rửa ôxy hoá) gây ô nhiễm môi trƣờng, và không đảm bảo an toàn của sản phẩm cho ngƣời tiêu dùng [34]. 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Sản xuất chitin, chitosan và oligo chitosan bằng con ƣờng sinh học Để giải quyết những nhƣợc điểm trên, quy trình sản xuất chitin, chitosan theo con đƣờng sinh học để sản xuất ra sản phẩm chitin, chitin oligosaccarit, chitosan có chất lƣợng cao, không gây ô nhiễm môi trƣờng đang đƣợc quan tâm.
Trong quá trình sản xuất chitin/chitosan theo con đƣờng sinh học, các loại enzyme thƣờng đƣợc sử dụng để thay thế các loại axit và kiềm trong phƣơng pháp hóa học. Legarreta và cộng sự đã sử dụng enzyme protease để tách protein khỏi vỏ tôm thay thế phƣơng pháp hóa học [37]. Hall và Da Silva đã đề xuất phƣơng pháp khử khoáng đơn giản bằng việc sử dụng lên men lactic [37]. Ngoài ra, chitin còn đƣợc tách chiết từ vỏ tôm bằng cách sử dụng enzyme bromelain trong dịch ép vỏ dứa [5].
Quy trình tách chiết chitin nhờ sử dụng bromelain đƣợc tiến hành theo sơ đồ sau: 100g nguyên liệu đƣợc rửa bỏ để loại bớt thịt sau đó hòa cặn vào 300 ml dịch chiết enzyme bromelain (dịch ép bã dứa), 1 ngày thay dịch enzyme 2 lần (sang và chiều); xử lý nhƣ vậy trong thời gian 6-7 ngày, tiến hành rửa sạch thu cặn, xử lý 2 lần với NaOH 1% ở 900C trong 45 phút. Quy trình này hoàn toàn không cần sử dụng HCl để loại khoáng và cần đến một lƣợng kiềm rất ít trong quá trình xử lý [5]. Vỏ tôm sau khi đƣợc khử khoáng và protein thu đƣợc chế phẩm chitin có hàm lƣợng khoáng và protein rất thấp, màu sắc đẹp [5]. Chế phẩm này tiếp tục đƣợc phân đoạn thành các chitin oligosaccarit nhờ enzym chitinase và đƣợc chuyển hóa thành chitosan nhờ enzym chitin deacetylase [9].
VAI TRÕ CỦA CHITIN/CHITIN OLIGOSACCARIT 1. Đối với nông nghiệp Theo các nhà khoa học, chitin là một chất rất hữu ích giúp thực vật phát triển. Nó tham gia vào cơ chế bảo vệ trong thực vật. Sản lƣợng lƣơng thực tăng lên đáng kể khi sử dụng chitin làm phân bón.
Ở Mỹ, chitin cũng đƣợc sử dụng trong nông nghiệp do cơ quan bảo vệ môi trƣờng Hoa Kỳ quy định. Bên cạnh đó, 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com trong nông nghiệp và ngành sản xuất rau quả, chitosan đƣợc sử dụng nhƣ thuốc trừ sâu sinh học [34]. Chitin oligosaccarit cũng đƣợc biết đến nhƣ một chất giúp mở nhanh cơ chế kháng của thực vật chống lại sự xâm nhập của một số nấm, do đó, giúp tăng cƣờng khả năng kháng bệnh của cây trồng. Trong một số cây cộng sinh nhƣ đậu và cỏ ba lá, các vi khuẩn cộng sinh sống xung quanh rễ cây có thể giải phóng chitin oligosaccarit tạo ra tín hiệu hình thành các nốt sần ở rễ, là vị trí cho sự cố định nitơ [55].
Sử dụng màng từ chitin và chitosan tạo ra độ thoáng khí cho sản phẩm, duy trì điều kiện tối ƣu trong bảo quản. Màng chitosan cũng khá dai, khó xé rách, có độ bền tƣơng đƣơng với một số chất dẻo vẫn đƣợc dùng làm bao gói [51]. Trong thực tế ngƣời ta đã dùng màng chitosan để đựng và bảo quản các loại rau quả nhƣ đào, dƣa chuột, đậu, bƣởi v. Đối với môi trƣờng Các hợp chất hóa học có mặt trong nƣớc xuất phát từ nhiều nguồn chất thải độc hại chẳng hạn nhƣ các kim loại, thuốc nhuộm, các phân tử chất thơm…gây ô nhiễm môi trƣờng nghiêm trọng, ảnh hƣởng đến sức khỏe con ngƣời [66].
Bằng cách sử dụng kết hợp một polymer tự nhiên nhƣ chitin và chitosan vào hệ thống xử lý nƣớc ngƣời ta có thểtăng hiệu quả xử lý nƣớc; loại bỏ các hợp chất hóa học tổng hợp độc hại chẳng hạn nhƣ sulfat nhôm và polymer tổng hợp [66]. Ứng dụng trong y học Nhờ đặc tính làm liền sẹo, oligo chitin đƣợc bổ sung vào thành phần trong các loại băng (nhƣ da nhân tạo, băng giác mạc.), làm chỉ khâu phẫu thuật, cấy ghép nha khoa, tái tạo lại xƣơng và nƣớu răng.