ĐẶT VẤN ĐỀ Leukemia cấp là bệnh thường gặp nhất trong các bệnh về máu, tỷ lệ tử vong cao. Các phương pháp chẩn đoán cổ điển như hình thái học tế bào, hóa học tế bào là tiêu chuẩn không thể thiếu trong chẩn đoán leukemia. Tuy nhiên, phương pháp này còn có một số hạn chế trong các trường hợp khó chẩn đoán và trong việc theo dõi tiến triển bệnh. Từ năm 2001, Tổ chức Y tế thế giới đã đề xuất phân loại leukemia cấp dòng tủy dựa trên những biến đổi di truyền.
Một số gen đã được nghiên cứu và ghi nhận có vai trò quan trọng trong quá trình điều trị, theo dõi và tiên lượng bệnh hiệu quả hơn [27]. Trong các nghiên cứu trên thế giới, đã xác định được các biến đổi trong vật chất di truyền ở bệnh leukemia là: đột biến nhiễm sắc thể và đột biến gen. Qua nuôi cấy tế bào, làm tiêu bản và xác định NST đồ (Karyotype), các nhà khoa học đã phát hiện khoảng 55% người bệnh có đột biến NST, còn 45% số người bệnh có bộ NST bình thường. Vì vậy, việc xác định các đột biến gen trên là cần thiết [20, 23].
Hơn 80% các đột biến gen được tìm thấy ở người bệnh mắc leukemia cấp có bộ NST bình thường xảy ra ở 3 gen Nuleophosmin 1 (NPM1), Fms-like tyrosine kinase 3 (FLT3) và CCAAT - enhancer binding protein alpha (CEBPA) [40]. Trong thời gian qua, việc chẩn đoán leukemia cấp bằng sinh học phân tử đã có nhiều bước tiến vượt bậc, có nhiều kỹ thuật đã được nghiên cứu và ứng dụng cho kết quả đáng tin cậy như: RT-PCR, Real Time PCR, giải trình tự Sanger, NGS. trong đó có phương pháp RT-PCR là phương pháp đơn giản, hiệu quả được áp dụng ngày càng rộng rãi trên Thế giới cũng như ở Việt Nam. Phương pháp này bổ sung, hỗ trợ cho phương pháp hình thái học như: tăng tính đặc hiệu trong chẩn đoán, điều trị cũng như tiên lượng bệnh.
Ở Việt Nam, đã có một số nghiên cứu về đột biến gen NPM1 và FLT3 ở người bệnh leukemia cấp được tiến hành dưới nhiều góc độ khác nhau: nghiên cứu về tỷ lệ 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com đột biến, mối liên quan giữa các đột biến với lâm sàng. Nên nghiên cứu áp dụng các kỹ thuật mới cho chẩn đoán, điều trị và tiên lượng bệnh là rất cần thiết. Vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu này với các mục tiêu sau: 1. Hoàn thiện quy trình kỹ thuật RT - PCR để xác định đột biến ở các gen NPM1-mutA và FLT3 trong leukemia cấp dòng tủy.
Khảo sát tỷ lệ đột biến NPM1-mutA và FLT3 ở ngƣời bệnh leukemia cấp dòng tủy đƣợc thu thập tại Viện Huyết học – Truyền máu Trung ƣơng trong thời gian từ tháng 8/2017 đến tháng 7/2018. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Leukemia cấp dòng tủy Leukemia cấp dòng tủy (Acute Myeloid Leukemia - AML) là một bệnh máu ác tính, đặc trưng bởi sự tăng sinh và tích lũy các tế bào non ác tính trong tủy xương và ở máu ngoại vi. Những tế bào này lấn át và ức chế quá trình trưởng thành và phát triển của các tế bào bình thường trong tủy xương [8].
Tỷ lệ tế bào non trong tủy để chẩn đoán leukemia cấp dòng tủy là 30% (theo FAB) hoặc 20% (theo WHO 2008). Một số trường hợp có các bất thường di truyền đặc hiệu thì tỷ lệ tế bào non ác tính không cần đạt tiêu chuẩn trên (theo WHO 2008) [21, 52]. Lịch sử phát hiện leukemia cấp Năm 1872, bác sỹ Velpeau thông báo ca bệnh đầu tiên. Ông ghi nhận máu của bệnh nhân này giống “như cháo”, ông tiên đoán hiện tượng này là bạch cầu nhiều trong máu người bệnh [10].
Năm 1856, nhà sinh lý bệnh người Đức Rudolf Virchow đã dùng kính hiển vi quang học để soi tiêu bản máu của người bệnh và ông đã thấy bạch cầu ở những người bệnh này tăng rất cao làm máu trắng như sữa. Virchow gọi bệnh này là “Leukemia” (theo tiếng Hy lạp là bệnh máu trắng) [10]. Năm 1877, Nhờ vào phương pháp nhuộm tiêu bản máu, Paul Ehrlich đã phát hiện được những dạng khác nhau của bạch cầu [10]. Năm 1879, Mosler là người đầu tiên đưa kỹ thuật xét nghiệm tủy xương để chẩn đoán cho những người bệnh có triệu chứng thiếu máu và xuất huyết [5].
Năm 1889, Ebstein đã dùng thuật ngữ “acute leukemia” (leukemia cấp) để chỉ tình trạng bệnh tiến triển cấp tính [6]. 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Năm 1900, Naegeli đã chia leukemia cấp thành dòng tủy (AML) và dòng Lympho (ALL) [10]. Năm 1913, Schilling đã phát hiện bệnh tổn thương đơn dòng mono [10]. Năm 1957, Gillestad đã mô tả bệnh leukemia cấp tiền tủy bào lần đầu tiên [10].
Năm 1976, FAB đã đưa ra phân loại AML dựa vào hình thái học và hóa học tế bào [4]. Năm 1986, FAB đã đưa ra chẩn đoán leukemia cấp khi tế bào non ác tính ≥ 30% tế bào có nhân trong tủy [38]. Năm 2001, WHO đưa ra phân loại leukemia cấp để chẩn đoán xác định khi tế bào non ác tính ≥ 20% tế bào có nhân trong tủy [52]. Năm 2008, WHO đã đưa ra phân loại mới dựa trên tổn thương gen để chẩn đoán, theo dõi điều trị và tiên lượng của bệnh [52].
Cơ chế bệnh sinh leukemia 1. Sinh máu bình thường và leukemia Bằng các nghiên cứu thực nghiệm in vivo và nuôi cấy tế bào in vitro, người ta phát hiện ra rằng tạo máu là một quá trình tăng sinh và biệt hóa các tế bào máu, bắt nguồn từ tế bào gốc vạn năng tạo ra tế bào máu đa năng rồi tới tế bào đầu dòng cho từng dòng [3]. Tế bào gốc được biệt hóa theo dòng nào là do nhu cầu của cơ thể thông qua cơ chế điều khiển ngược mà đích tác động cuối cùng là gen có vai trò trong biệt hóa. Khi có rối loạn một khâu nào đó trong dây truyền này sẽ dẫn đến sự tăng sinh không kiểm soát được của tế bào hoặc làm tế bào ngừng trưởng thành nhưng vẫn phân chia và dẫn đến leukemia cấp [6].
Sự liên quan giữa hệ thống gen trong tế bào với ung thư Có hai hệ thống gen với các chức năng khác nhau cùng phối hợp để kiểm soát sự tăng sinh ác tính, duy trì sự sinh máu bình thường của tế bào và cơ thể: 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com - Các gen tiền ung thư (proto - oncogene): là các gen có vai trò trong quá trình tăng sinh và biệt hóa tế bào. Sự ổn định tương đối về cấu trúc và chức năng của các gen này giúp tế bào phát triển bình thường. Ngược lại, khi có rối loạn cấu trúc đáng kể thì nó sẽ chuyển thành gen ung thư (oncogene), làm tăng biểu hiện protein và làm tăng sinh tế bào mất kiểm soát, dẫn đến ung thư khi làm mất kiểm soát quá trình phân bào và tạo ra các đặc tính ác tính [6]. Hoffbrand đã phân loại các gen ung thư theo các cách tác động của các protein sản phẩm như sau: + Sản phẩm của gen ung thư là yếu tố kích thích tăng sinh bên ngoài.
Điển hình loại này là gen C-SIS: mã hóa chuỗi β của yếu tố kích thích phân chia tiểu cầu PDGF. + Sản phẩm gen ung thư là các protein có hoạt tính tyrosine kinase trên màng tế bào: gồm các vị trí tiếp nhận yếu tố kích thích tăng trưởng. Điển hình là gen Fms: mã hóa protein cấu tạo vị trí tiếp nhận của yếu tố kích thích tạo cụm tế bào mono. + Sản phẩm gen ung thư là các chất truyền thông tin trong tế bào.
Các gen N- Ras, H-Ras, K-Ras mã hóa protien Ras. Khi protein này gắn với GTP trong bào tương thì giải phóng GDP và truyền đạt kích thích tế bào phân chia [16]. - Các gen ức chế khối u (Anti - oncogene: tumor suppressor genes): có vai trò ức chế sự phát triển của khối u. Sự đột biến, sắp xếp lại hoặc chuyển đoạn làm bất hoạt các gen này, mất khả năng ức chế sự tăng sinh ác tính.
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, các gen này thường đóng vai trò trong sự tiến triển của bệnh từ âm ỉ đến toàn phát [44]. Có 3 gen quan trọng nhất, có tương tác ở mức phân tử sản phẩm có khả năng 16INK4A gây bệnh là: Rb, P53, P. Sự hoạt hóa gen tiền ung thư và bất hoạt gen ức chế khối u làm tế bào tăng sinh dễ dàng và không bị mất kiểm soát, ngăn cản sự biệt hóa và ngăn cản quá trình chết theo chương trình dẫn đến các bệnh ác tính. Trong cơ thể, gen ung thư và gen bình thường có thể tồn tại song hành, trong đó gen sinh ung thư là gen trội [17].
5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com - Bên cạnh đó còn có hệ thống các gen sửa chữa DNA: tế bào phân chia liên tục để đảm bảo và duy trì sự sống. Mỗi phân tử tế bào có khoảng 6 tỷ cặp bazơ nitơ được tổng hợp, nên sai sót rất lớn. Song cơ thể có hệ thống sửa chữa sai sót đó. Hoạt động này giảm hoặc mất đi do di truyền hay mắc phải sẽ làm cho các sai sót không được sửa chữa trong đó có các sai sót gây hoạt hóa gen ung thư hay bất hoạt gen ức chế khối u và dẫn đến ung thư [18].
Cơ chế tổn thương phân tử dẫn đến leukemia cấp * Tổn thương gen truyền tín hiệu sinh tế bào Những gen này truyền tín hiệu kích thích tăng sinh tế bào thông qua receptor tyrosin kinase kích hoạt phosphoryl hóa làm cho tế bào tăng sinh không kiểm soát. Các gen hoạt động theo con đường này là BCR - ABL, FLT3, c-Kit. * Tổn thương các gen hoạt hóa sự sao chép Các gen Ig Lympho B và gen receptor Lympho T; khi các tế bào B và T chưa trưởng thành, thường có hiện tượng xoắn hai chuỗi đơn của DNA lại để tạo ra các protein đa dạng, có khả năng gắn với protein lạ. Quá trình này dễ bị sai lạc và nếu sai lạc xảy ra ở các gen tiền ung thư thì có thể dẫn đến tăng sinh ác tính [17].
* Tổn thương gen liên quan đến quá trình chết theo chương trình Nhiều loại tế bào được lập trình bởi các gen đặc biệt để biệt hóa rồi chết sau một thời gian sống nhất định. Khi các gen này bị tổn thương, tế bào tiếp tục được sinh ra nhưng không già và chết đi như bình thường gây mất cân bằng. Hai gen tổng hợp protein tyrosine kinase và protein P53 tổng hợp theo cơ chế này [17].