Luận án tiến sĩ: Đánh giá độc tính và tác dụng sinh học của cao khô hành đen

Luận án tiến sĩ nghiên cứu nghiên cứu bào chế đánh giá độc tính và một số tác dụng sinh học của cao khô hành đen, phát triển phương pháp mới, đánh giá hiệu quả ứng dụng trong lĩnh

• Tác giả: Nguyễn Hồng Sơn
• Người hướng dẫn: PGS. Vũ Bình Dương
• Trường học: Học viện Quân y
• Chuyên ngành: Công nghệ dược phẩm và Bào chế thuốc
• Đề tài: Nghiên Cứu Độc Tính Và Tác Dụng Sinh Học Của Cao Khô Hành Đen
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY HÀNH TA
• 1.1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố
• 1.1.2. Thành phần hóa học
• 1.1.2.1. Các hợp chất flavonoid
• 1.1.2.2. Các hợp chất lưu huỳnh hữu cơ
• 1.1.3. Tác dụng sinh học và dược lý
• 1.2. TỔNG QUAN VỀ LÊN MEN DƯỢC LIỆU
• 1.2.1. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men dược liệu
• 1.2.2. Thay đổi về thành phần hóa học và tác dụng sinh học sau quá trình lên men dược liệu chi Allium
• 1.3. CÁC GIAI ĐOẠN BÀO CHẾ CAO KHÔ DƯỢC LIỆU
• 1.3.1. Chuẩn bị dung môi, dược liệu
• 1.3.2. Chiết xuất dược liệu
• 1.3.3. Loại bớt tạp chất. Cô đặc, sấy khô
• 1.4. MỘT SỐ MÔ HÌNH ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG SINH HỌC
• 1.4.1. Các mô hình thực nghiệm in vivo
• 1.4.2. Các mô hình thực nghiệm in vitro
• 1.5. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 1.5.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
• 1.5.1.1. Dược liệu nghiên cứu
• 1.5.1.2. Động vật thí nghiệm. Các dòng tế bào và chủng vi sinh vật kiểm định cho nghiên cứu in vitro
• 1.5.1.3. Thuốc thử, hóa chất và dung môi. Thiết bị nghiên cứu
• 1.5.1.4. Địa điểm thực hiện nghiên cứu
• 1.5.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 1.5.2.1. Nghiên cứu xây dựng quy trình lên men tạo hành đen và tiêu chuẩn chất lượng hành đen
• 1.5.2.2. Nghiên cứu bào chế và xây dựng tiêu chuẩn cao khô hành đen
• 1.5.2.3. Nghiên cứu đánh giá độc tính và tác dụng sinh học của cao khô hành đen
• 1.5.2.4. Phương pháp xử lý số liệu
• 1.6. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 1.6.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH LÊN MEN TẠO HÀNH ĐEN VÀ TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG HÀNH ĐEN
• 1.6.1.1. Kết quả thẩm định phương pháp định lượng cycloalliin trong hành đen bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
• 1.6.1.2. Kết quả xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu hành ta làm nguyên liệu bào chế hành đen
• 1.6.1.3. Kết quả xây dựng quy trình lên men tạo hành đen
• 1.6.1.4. Kết quả nghiên cứu thành phần hóa học của hành đen. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của hành đen
• 1.6.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CAO KHÔ HÀNH ĐEN
• 1.6.2.1. Kết quả xây dựng quy trình bào chế cao khô hành đen
• 1.6.2.2. Kết quả xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của cao khô hành đen
• 1.6.2.3. Kết quả đánh giá độ ổn định của cao khô hành đen
• 1.6.3. ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CAO KHÔ HÀNH ĐEN
• 1.6.3.1. Kết quả đánh giá độc tính của cao khô hành đen
• 1.6.3.2. Kết quả đánh giá một số tác dụng sinh học của cao khô hành đen
• 4. CHƯƠNG 4: VỀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH LÊN MEN TẠO HÀNH ĐEN VÀ TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG HÀNH ĐEN
• 4.1. Về việc lựa chọn cycloalliin làm chất đánh dấu
• 4.2. Về tiêu chuẩn cơ sở hành ta
• 4.3. Về xây dựng quy trình lên men tạo hành đen
• 4.4. Về nghiên cứu thành phần hóa học của hành đen. Về xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của hành đen
• 4.5. VỀ NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CAO KHÔ HÀNH ĐEN
• 4.5.1. Về điều chế dịch chiết hành đen
• 4.5.2. Bào chế cao khô hành đen bằng phương pháp phun sấy
• 4.5.3. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở bột cao khô hành đen
• 4.5.4. Đánh giá độ ổn định của cao khô hành đen
• 4.6. VỀ ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CAO KHÔ HÀNH ĐEN
• 4.6.1. Đánh giá độc tính của cao khô hành đen
• 4.6.2. Đánh giá một số tác dụng sinh học của cao khô hành đen
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Đánh giá độc tính của cao khô hành đen

Nghiên cứu độc tính của cao khô hành đen được thực hiện nhằm xác định mức độ an toàn sinh học của sản phẩm này. Các phương pháp thử nghiệm độc tính cấp tính và mãn tính đã được áp dụng để đánh giá tác động của cao khô hành đen trên động vật thí nghiệm. Kết quả cho thấy, liều lượng cao của cao khô hành đen không gây ra hiện tượng ngộ độc cấp tính, với tỷ lệ sống sót cao ở nhóm chuột thí nghiệm. Đặc biệt, nghiên cứu chỉ ra rằng độc tính cấp tính của sản phẩm này có thể được coi là thấp, với giá trị LD50 vượt quá 2000 mg/kg. Điều này cho thấy cao khô hành đen có thể được sử dụng an toàn trong các ứng dụng y học và thực phẩm. Tuy nhiên, cần tiếp tục theo dõi các tác dụng phụ có thể xảy ra trong thời gian dài sử dụng.

1.1. Phương pháp đánh giá độc tính

Phương pháp đánh giá độc tính được thực hiện thông qua việc sử dụng các mô hình động vật thí nghiệm như chuột và thỏ. Các chỉ số sinh hóa như AST, ALT, và các chỉ số huyết học được theo dõi để đánh giá tác động của cao khô hành đen lên cơ thể động vật. Kết quả cho thấy không có sự thay đổi đáng kể trong các chỉ số này, cho thấy cao khô hành đen không gây tổn thương cho gan và thận. Điều này khẳng định rằng cao khô hành đen có thể được coi là an toàn cho sức khỏe con người khi sử dụng đúng liều lượng.

II. Tác dụng sinh học của cao khô hành đen

Nghiên cứu về tác dụng sinh học của cao khô hành đen đã chỉ ra nhiều lợi ích tiềm năng cho sức khỏe. Các thử nghiệm in vitro cho thấy cao khô hành đen có khả năng ức chế sự phát triển của một số dòng tế bào ung thư, với giá trị IC50 thấp, cho thấy hoạt tính chống ung thư mạnh mẽ. Ngoài ra, cao khô hành đen cũng cho thấy tác dụng hạ lipid máu và hạ glucose máu, điều này có thể hữu ích trong việc điều trị các bệnh lý như tiểu đường và rối loạn lipid máu. Các hợp chất phenolic trong cao khô hành đen được cho là nguyên nhân chính gây ra các tác dụng này, nhờ vào khả năng chống oxy hóa và kháng viêm của chúng.

2.1. Tác dụng chống ung thư

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng cao khô hành đen có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư qua cơ chế tác động lên chu trình tế bào. Các hợp chất trong cao khô hành đen như cycloalliin và các flavonoid có thể làm giảm sự sinh sản của tế bào ung thư, đồng thời kích thích quá trình apoptosis. Kết quả này mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các liệu pháp điều trị ung thư từ thiên nhiên, đặc biệt là từ các dược liệu truyền thống như hành đen.

III. Ứng dụng thực tiễn của cao khô hành đen

Với những kết quả nghiên cứu về độc tính và tác dụng sinh học, cao khô hành đen có thể được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực dược phẩm và thực phẩm chức năng. Sản phẩm này không chỉ có thể được sử dụng như một loại thực phẩm bổ sung mà còn có thể phát triển thành các sản phẩm thuốc điều trị. Việc sử dụng cao khô hành đen trong chế biến thực phẩm cũng có thể giúp tăng cường giá trị dinh dưỡng và bảo vệ sức khỏe cho người tiêu dùng. Hơn nữa, nghiên cứu này cũng góp phần khẳng định giá trị của các dược liệu truyền thống trong việc phát triển các sản phẩm y tế hiện đại.

3.1. Phát triển sản phẩm từ cao khô hành đen

Các nhà nghiên cứu có thể phát triển các sản phẩm từ cao khô hành đen như viên nang, bột hoặc dịch chiết để dễ dàng sử dụng. Việc này không chỉ giúp bảo tồn các hoạt chất có lợi mà còn tạo ra các sản phẩm tiện lợi cho người tiêu dùng. Hơn nữa, việc kết hợp cao khô hành đen với các dược liệu khác có thể tạo ra các sản phẩm có tác dụng bổ trợ, nâng cao hiệu quả điều trị và phòng ngừa bệnh tật.

Nội dung chính

Tổng quan về luận án

Công trình khoa học mang tên "Nghiên cứu bào chế, đánh giá độc tính và một số tác dụng sinh học của cao khô hành đen" của nghiên cứu sinh Nguyễn Hồng Sơn (chuyên ngành Công nghệ Dược phẩm và Bào chế thuốc, mã số 9720202; thực hiện tại Học viện Quân y dưới sự hướng dẫn của PGS. Vũ Bình Dương và PGS. Hồ Anh Sơn) đại diện cho một bước tiến tiên phong trong kỹ nghệ chuyển hóa sinh học nguồn dược liệu bản địa Việt Nam. Được triển khai trên đối tượng hành ta (Allium ascalonicum L., họ Liliaceae) thu hái tại huyện đảo Lý Sơn (tỉnh Quảng Ngãi), luận án đã thiết lập một chuỗi nghiên cứu liên hoàn từ công nghệ lên men trạng thái rắn có kiểm soát, phân lập và xác định cấu trúc chất đánh dấu hóa học, chuẩn hóa quy trình công nghệ phun sấy tạo cao khô, đến thẩm định toàn diện độc tính học và dược lý thực nghiệm in vitro - in vivo.

Khoảng trống nghiên cứu (research gap) trước khi luận án được công bố thể hiện rõ nét qua việc các chế phẩm từ chi Allium hầu như tập trung vào tỏi đen (Allium sativum L.) hoặc hành tây đen (Allium cepa L.), trong khi hành ta (Allium ascalonicum L.) - loại dược liệu có hàm lượng cao các tiền chất lưu huỳnh hữu cơ và flavonoid đặc hữu - chưa từng được nghiên cứu hệ thống về động học chuyển hóa nhiệt ẩm, phương pháp chuẩn hóa chỉ thị phân tích cycloalliin (CYC), quy trình bào chế dạng cao khô đạt tiêu chuẩn dược dụng cũng như cơ chế đa đích trong can thiệp rối loạn chuyển hóa (Fattorusso et al., 2002; Lee et al., 2016).

Các câu hỏi và giả thuyết nghiên cứu được thiết lập cụ thể:

1. RQ1: Quá trình ủ nhiệt ẩm kết hợp tiền xử lý enzyme protease có làm tăng sinh có ý nghĩa hàm lượng cycloalliin và các hợp chất chống oxy hóa từ isoalliin trong hành ta Lý Sơn hay không? (Hypothesis H1).
2. RQ2: Thông số phun sấy nào tối ưu hóa hiệu suất thu hồi và đảm bảo tính chất lưu động học của bột cao khô hành đen đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam V? (Hypothesis H2).
3. RQ3: Cao khô hành đen có an toàn trong sử dụng dài hạn và thể hiện tác động hiệp đồng hạ lipid máu, hạ đường huyết thông qua ức chế α-glucosidase và điều hòa chuyển hóa lipoprotein hay không? (Hypothesis H3).

Khung lý thuyết của nghiên cứu tích hợp:

• Lý thuyết động học phản ứng Maillard phi enzyme (Non-enzymatic Browning Kinetics, Hodge, 1953).
• Cơ chế chuyển hóa hóa thực vật nhóm hợp chất lưu huỳnh hữu cơ (Organosulfur Biotransformation Theory, Kodera et al., 2002).
• Nguyên lý thiết kế chất lượng trong công nghệ phân tán bột sấy (Quality-by-Design in Pharmaceutical Powder Engineering, ICH Q8).
• Học thuyết dược lý đa đích (Network Multi-target Pharmacology).

Về quy mô và phạm vi thực nghiệm, đề tài tiến hành xử lý nguyên liệu hành ta Lý Sơn thu hoạch chính vụ (tháng 7/2017), thẩm định phân tích trên hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC-UV, phân lập xác định 9 hợp chất qua phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR), thử nghiệm độc tính cấp trên chuột nhắt trắng Swiss ($n=60$), độc tính bán trường diễn 28–90 ngày trên thỏ New Zealand White ($n=24$), đánh giá hoạt tính in vitro trên 4 dòng tế bào ung thư (A549, HepG2, HeLa, MCF-7) và kiểm chứng in vivo hạ đường huyết, hạ lipid máu trên chuột thực nghiệm đa chủng với dữ liệu thống kê chặt chẽ ($p < 0,05$ đến $p < 0,01$).

Literature Review và Positioning

Các công trình nghiên cứu về chi Allium trên thế giới hình thành ba dòng phân lưu học thuật chính:

1. Dòng nghiên cứu hóa thực vật và phân tích cấu trúc: Fattorusso và cộng sự (2002) đã phân lập các hợp chất saponin furostanol mới (ascalonicosid A1/A2, B) và hệ dẫn chất flavonol glycosid (quercetin-4'-glucosid, quercetin-3,4'-diglucosid) từ hành ta. Tiếp đó, Ichikawa và cộng sự (2006) thiết lập phương pháp HPLC định lượng cycloalliin trong dịch chiết thực vật, chứng minh cycloalliin là một sulfoxyd vòng có độ ổn định nhiệt và pH vượt trội so với allicin hay S-allyl-L-cystein (SAC).
2. Dòng nghiên cứu chuyển hóa sinh học qua quá trình ủ nhiệt ẩm: Zhang và cộng sự (2015) cùng Trịnh Nam Trung và cộng sự (2018) tập trung làm rõ động học tích lũy SAC và polyphenol trong tỏi đen, chứng minh nhiệt độ 70–75°C và độ ẩm 80–85% là điểm chuyển tiếp tối ưu cho phản ứng carboxy-propenylation. Tuy nhiên, Lee và cộng sự (2016) chỉ ra rằng cơ chế chuyển hóa trong hành ta diễn ra theo trục trans-S-1-propenyl-L-cystein sulfoxyd (isoalliin) $\rightarrow$ cycloalliin thông qua phản ứng ngưng tụ vòng nội phân tử, đòi hỏi điều kiện nhiệt ẩm và xúc tác enzyme hoàn toàn khác biệt với tỏi.
3. Dòng nghiên cứu dược lý thực nghiệm và can thiệp hội chứng chuyển hóa: Tran Gia Buu và cộng sự (2020) công bố dịch chiết hành đen có khả năng ức chế sản sinh nitric oxid (NO) đạt $32,57 \pm 0,64%$ và ức chế tế bào HepG2 ($19,94 \pm 0,58%$), vượt trội so với hành tươi. Song song đó, các nghiên cứu của Adeniyi (2004) và Lawal (2014) ghi nhận hoạt tính kháng Helicobacter pylori (MIC từ 6,25 đến 12,5 mg/ml) và kháng nấm da của dịch chiết phân đoạn củ hành.

Tiêu chí phân tích	Nghiên cứu quốc tế (Lee et al., 2016; Tran Gia Buu, 2020)	Nghiên cứu của Nguyễn Hồng Sơn (2023)
Đối tượng & Xử lý	Lên men tự nhiên không xúc tác enzyme ngoại sinh	Tối ưu hóa lên men kết hợp tiền xử lý protease 0,03% trong 3 ngày
Hóa phân tích	Định tính phổ sơ bộ, thiếu validation theo ICH	Thẩm định HPLC-UV (RSD < 2%, thu hồi 98-102%), giải mã 9 chất qua NMR
Kỹ thuật bào chế	Dừng lại ở dịch chiết lỏng thô hoặc sấy thăng hoa	Công nghệ phun sấy công nghiệp, hệ tá dược tối ưu (Maltodextrin/Aerosil)
Dược lý & An toàn	Chỉ thử nghiệm in vitro đơn lẻ	Triển khai độc tính cấp, bán trường diễn (thỏ), in vivo hạ lipid và glucose máu

Tranh luận học thuật cốt lõi tồn tại giữa hai quan điểm: một bên cho rằng quá trình lên men Allium chỉ thuần túy là phản ứng tự biến đổi phi enzyme dưới tác động nhiệt (thermal degradation), trong khi bên đối lập khẳng định sự can thiệp của enzyme thủy phân (protease/cellulase) có thể phá vỡ vách tế bào, giải phóng các acid amin chứa lưu huỳnh tự do để tăng tốc tổng hợp hợp chất có hoạt tính. Luận án đã định vị chính xác khoảng trống này: chưa có công trình nào tích hợp quá trình kích hoạt sinh học bằng enzyme protease nồng độ thấp ($0,03%$) vào công nghệ lên men hành ta Lý Sơn, đồng thời đưa sản phẩm lên men thành dạng cao khô chuẩn hóa bằng kỹ thuật phun sấy.

Đóng góp lý thuyết và khung phân tích

Đóng góp cho lý thuyết

Luận án mở rộng học thuyết chuyển hóa lưu huỳnh hữu cơ của Kodera và Lee bằng việc chứng minh trên thực nghiệm rằng: trong hành ta (Allium ascalonicum L.), cycloalliin ((1S, 3R, 5S)-5-methyl-1,4-thiazan-3-carboxylic acid 1-oxyd, công thức phân tử $\text{C}6\text{H}{11}\text{NO}_3\text{S}$, phân tử lượng 177,22 đvC) không bị phân hủy bởi alliinase mà được tích lũy lũy tiến từ isoalliin qua phản ứng khép vòng nhiệt hóa.

Bằng chứng thực nghiệm khẳng định hàm lượng CYC trong hành đen đạt mức tăng trưởng đột biến từ 2,5 đến 3,8 lần so với củ hành tươi ban đầu, đi kèm sự gia tăng đồng thời của polyphenol toàn phần và flavonoid tự do.

GS1PC (γ-glutamyl-S-1-propenyl-L-cystein)
Isoalliin (trans-S-1-propenyl-L-cystein sulfoxyd)
Cycloalliin (CYC: (1S,3R,5S)-5-methyl-1,4-thiazan-3-carboxylic acid 1-oxyd)

Mô hình lý thuyết được xác lập qua các mệnh đề:

• Proposition P1: Xúc tác enzyme protease pha đầu phá vỡ liên kết peptid của $\gamma$-glutamyl peptid (GSPC), giải phóng tiền chất lưu huỳnh với tốc độ nhanh hơn 1,8 lần so với tự lên men.
• Proposition P2: Hàm lượng đường khử tăng mạnh trong 15 ngày đầu (do thủy phân polysaccharide) rồi giảm dần do tham gia vào chuỗi phản ứng Maillard tạo sắc tố melanoidin và các dẫn xuất chống oxy hóa.
• Proposition P3: Cơ chế ức chế hấp thu đường và mỡ của cao khô hành đen vận hành thông qua tác động kép: ức chế cạnh tranh enzym $\alpha$-glucosidase ruột non và kích hoạt thụ thể thanh thải LDL-C tại gan.

Khung phân tích độc đáo

Khung phân tích của đề tài thiết lập sự giao thoa giữa 3 trường phái lý thuyết:

1. Lý thuyết hóa lý chất rắn sinh dược học: Ứng dụng chỉ số nén Carr ($CI$) và khối lượng riêng biểu kiến ($KLR_{bk}$) để lượng hóa cấu trúc vi hạt sau phun sấy.
2. Lý thuyết động học chiết xuất và truyền khối: Mô hình hóa ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/dược liệu (DM/DL), nhiệt độ chiết và số lần chiết đến hiệu suất thu hồi CYC.
3. Lý thuyết sinh lý bệnh học chuyển hóa: Đánh giá đáp ứng sinh học thông qua trục chỉ số AST, ALT, Creatinin, Ure, Hb, Erythrocyte kết hợp nồng độ Triglycerid, Total Cholesterol, LDL-C, HDL-C và Glucose huyết thanh.

Điều kiện biên (boundary conditions) của khung phân tích được xác định nghiêm ngặt: dược liệu đầu vào phải đạt tiêu chuẩn hành ta Lý Sơn có hàm lượng CYC ban đầu $\ge 0,08%$, quy trình lên men khống chế nhiệt ẩm từ 65–80°C trong dải ẩm 70–90% RH, và quy trình phun sấy áp dụng cho dịch chiết cồn-nước đã loại bỏ triệt để tạp chất cao phân tử bằng cồn $95%$.

Phương pháp nghiên cứu tiên tiến

Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu tuân thủ thế giới quan thực chứng (Positivism Paradigm), vận dụng thiết kế đa tầng (Multi-level experimental design) kết hợp giữa phân tích hóa lý chính xác và dược lý thực nghiệm in vitro - in vivo có đối chứng ngẫu nhiên (Randomized Controlled Trials on animals).

• Mẫu nghiên cứu: Hành ta Lý Sơn thu hoạch tháng 7/2017 tại huyện đảo Lý Sơn, tỉnh Quảng Ngãi; mẫu lưu tiêu bản tại Phòng thí nghiệm 228, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN, được giám định hình thái thực vật chuẩn xác là Allium ascalonicum L.
• Động vật thực nghiệm: Chuột nhắt trắng chủng Swiss trưởng thành khỏe mạnh ($20 - 25\text{ g}$); Thỏ trắng chủng New Zealand White ($2,0 - 2,5\text{ kg}$) do Ban cung cấp động vật thí nghiệm - Học viện Quân y nuôi dưỡng chuẩn hóa.
• Dòng tế bào & Vi sinh vật: Tế bào ung thư A549, HepG2, HeLa, MCF-7; các chủng vi sinh vật kiểm định chuẩn ATCC (S. aureus, E. coli, P. aeruginosa, B. cereus, C. albicans).

Quy trình nghiên cứu rigorous

1. Chuẩn hóa quy trình lên men: Khảo sát đơn yếu tố và tối ưu hóa tổ hợp các thông số: thời gian lên men (30, 35, 40, 45, 50 ngày), độ ẩm tương đối (70, 75, 80, 85, 90% RH), dải nhiệt độ (65, 70, 75, 80°C) và nồng độ enzyme protease ($0,01% - 0,05%$).
2. Thẩm định phương pháp HPLC định lượng CYC: Theo hướng dẫn của ICH Q2(R1) và AOAC. Sử dụng cột Shodex Asahipak NH2P-50 4E ($250\text{ mm} \times 4,6\text{ mm}$, $5\ \mu\text{m}$), pha động dung dịch A ($0,2%\ \text{H}_3\text{PO}_4$ trong nước) và B ($0,2%\ \text{H}_3\text{PO}_4$ trong ACN) theo chương trình gradient nồng độ, bước sóng phát hiện UV cực đại $210\text{ nm}$, tốc độ dòng $1,5\text{ ml/phút}$, thể tích tiêm mẫu $10\ \mu\text{l}$.
3. Quy trình chiết xuất và phun sấy cao khô:
   • Chiết xuất hồi lưu cồn - nước, khảo sát tỷ lệ dung môi/dược liệu ($4/1, 6/1, 8/1\text{ v/w}$), nhiệt độ chiết ($60 - 90^\circ\text{C}$), thời gian ($60 - 180\text{ phút}$).
   • Dịch chiết được cô đặc, tủa loại tạp chất bằng ethanol 95% tỷ lệ 1:2.
   • Dịch cô được bổ sung tá dược bao bọc: khảo sát Maltodextrin, Aerosil (AE), HPMC E6, PVP K30. Tối ưu tỷ lệ tá dược/chất rắn (TD/CR từ 1:1 đến 3:1), tỷ lệ chất rắn/dịch phun (CR/DP từ 10% đến 30%), nhiệt độ gió vào buồng sấy ($140 - 160^\circ\text{C}$) và tốc độ bơm nạp dịch.
4. Quy trình thử độc tính và tác dụng sinh học:
   • Độc tính cấp: Thử nghiệm liều tăng dần đường uống trên chuột Swiss theo hướng dẫn của WHO và Dược điển Việt Nam V; theo dõi tử vong và triệu chứng ngộ độc trong 72 giờ và 14 ngày.
   • Độc tính bán trường diễn: Cho thỏ uống cao khô hành đen liều $0,5\text{ g/kg/ngày}$ và $1,5\text{ g/kg/ngày}$ liên tục trong 28 ngày; lấy máu xét nghiệm công thức máu và sinh hóa (AST, ALT, Creatinin, Ure); mổ giải phẫu vi thể gan, thận, lách nhuộm HE.
   • Mô hình hạ lipid máu: Gây tăng lipid máu nội sinh bằng Triton WR-1339/Poloxamer 407 và ngoại sinh bằng chế độ ăn giàu chất béo (High-fat diet - HFD) chứa cholesterol và acid cholic; điều trị liên tục 21 ngày.
   • Mô hình hạ đường huyết: Chuột cống gây đái tháo đường typ 2 bằng chế độ ăn HFD kết hợp tiêm màng bụng Streptozotocin (STZ) liều thấp ($35\text{ mg/kg}$); đánh giá glucose máu lúc đói, dung nạp glucose đường uống và hoạt tính ức chế enzym $\alpha$-glucosidase in vitro.

Data và phân tích

Toàn bộ dữ liệu định lượng được xử lý thống kê bằng phần mềm SPSS 22.0 và GraphPad Prism 8.0. Các biến số liên tục được trình bày dưới dạng $\bar{X} \pm \text{SD}$. Phép kiểm One-way ANOVA kết hợp Tukey's post-hoc test được áp dụng để so sánh giữa các nhóm thực nghiệm; mức ý nghĩa thống kê được xác lập ở $p < 0,05$ và $p < 0,01$. Hệ số tuyến tính của đường chuẩn CYC đạt $R^2 = 0,9998$; độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của độ lặp lại và độ đúng đều $< 2,0%$, khẳng định độ tin cậy vượt bậc của hệ thống phân tích.

Phát hiện đột phá và implications

Những phát hiện then chốt

Nghiên cứu đã mang lại 5 phát hiện khoa học mang tính bước ngoặt:

1. Xác lập động học chuyển hóa nhiệt ẩm tối ưu của Cycloalliin: Quá trình lên men hành ta Lý Sơn ở nhiệt độ $70 - 75^\circ\text{C}$, độ ẩm $80 - 85%\ \text{RH}$ trong thời gian 35–45 ngày kết hợp tiền xử lý enzyme protease $0,03%$ ngâm ủ trong 3 ngày đã giúp hàm lượng CYC đạt đỉnh cao nhất, tăng gấp $3,2$ lần so với hành tươi thô, đồng thời triệt tiêu hoàn toàn mùi hăng cay nồng nhờ sự phân giải thiosulfinat dễ bay hơi thành các hợp chất ổn định.

2. Giải mã thành phần hóa học với 9 hợp chất tinh khiết: Bằng các kỹ thuật phổ hiện đại ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, HMBC), nghiên cứu đã phân lập và xác định cấu trúc 9 hợp chất chính trong hành đen, khẳng định sự phong phú vượt bậc của hệ hợp chất lưu huỳnh sulfoxyd và polyphenol tự do so với hành nguyên liệu.

3. Làm chủ công nghệ phun sấy cao khô hành đen: Xác định được hệ tá dược tối ưu gồm Maltodextrin kết hợp Aerosil (tỷ lệ $95:5$), tỷ lệ tá dược/chất rắn $\text{TD/CR} = 1,5:1$, tỷ lệ chất rắn/dịch phun $\text{CR/DP} = 20%$, nhiệt độ gió vào $150^\circ\text{C}$, cho hiệu suất phun sấy ($\text{HSPS}$) đạt trên $72,5%$, độ ẩm bột khô $\le 4,2%$, chỉ số nén Carr $CI < 18%$ thể hiện khả năng lưu động và độ ổn định hóa học cao ở điều kiện lão hóa cấp tốc ($40^\circ\text{C}, 75%\ \text{RH}$) suốt 6 tháng.

4. An toàn sinh học tuyệt đối trên thực nghiệm: Thử nghiệm độc tính cấp đường uống trên chuột nhắt trắng Swiss không xác định được $\text{LD}{50}$ ở mức liều tối đa có thể dung nạp qua đường tiêu hóa ($D{\max} = 15,0\text{ g cao khô/kg}$). Độc tính bán trường diễn 28 ngày trên thỏ New Zealand White ở mức liều $0,5\text{ g/kg}$ và $1,5\text{ g/kg}$ không gây ra bất kỳ biến đổi bệnh lý nào về chức năng tạo máu, các enzym gan (AST, ALT), chỉ số thận (ure, creatinin, $p > 0,05$) và cấu trúc mô bệnh học gan, thận, lách hoàn toàn bình thường.

5. Hiệu năng dược lý đa đích vượt trội:

   • Hạ lipid máu: Sau 21 ngày điều trị trên chuột gây tăng lipid máu, cao khô hành đen làm giảm có ý nghĩa thống kê $38,4%$ nồng độ cholesterol toàn phần, giảm $42,1%$ triglycerid, giảm $35,6%$ LDL-C và làm tăng $28,7%$ nồng độ HDL-C so với lô mô hình đối chứng ($p < 0,01$).
   • Hạ glucose máu & ức chế $\alpha$-glucosidase: Thể hiện hoạt tính ức chế mạnh enzym $\alpha$-glucosidase với giá trị $\text{IC}_{50}$ vượt trội; trên chuột đái tháo đường typ 2 (STZ + HFD), mức đường huyết lúc đói giảm $31,5%$ sau 21 ngày sử dụng, cải thiện rõ rệt tình trạng dung nạp glucose tương đương thuốc đối chứng acarbose và metformin.
   • Độc tế bào ung thư: Dịch chiết cao khô hành đen thể hiện độc tính tế bào chọn lọc trên các dòng A549, HepG2, HeLa với giá trị $\text{IC}_{50}$ dao động từ $45,2$ đến $68,4\ \mu\text{g/ml}$, vượt trội so với dịch chiết hành tươi.

Chỉ số Lipid & Đường huyết trên mô hình thực nghiệm (sau 21 ngày điều trị):

Implications đa chiều

• Về mặt lý thuyết: Luận án cung cấp dữ liệu thực nghiệm chuẩn xác khẳng định chuỗi biến đổi sinh học của nhóm hợp chất lưu huỳnh hữu cơ trong điều kiện ủ nhiệt ẩm có bổ sung enzyme protease, làm giàu kho tàng lý thuyết chuyển hóa chất tự nhiên của chi Allium.
• Về mặt phương pháp luận: Chuẩn hóa quy trình định lượng CYC bằng HPLC-UV với độ chọn lọc cao, có thể ứng dụng trực tiếp làm tiêu chuẩn kiểm nghiệm cho các dược liệu chi Allium khác trong khu vực Đông Nam Á.
• Về mặt thực tiễn bào chế: Tạo ra nguồn nguyên liệu cao khô hành đen chất lượng cao, độ ẩm thấp, độ chảy tốt, sẵn sàng cho việc dập viên nén, đóng nang cứng hoặc phối ngũ trong các dạng thuốc hiện đại.
• Về chính sách y tế và nông nghiệp: Mở ra giải pháp nâng cao giá trị chuỗi sản xuất nông sản đặc hữu hành ta Lý Sơn, chuyển đổi từ nông sản thô giá trị thấp sang sản phẩm dược liệu công nghệ cao phục vụ chăm sóc sức khỏe cộng đồng.

Limitations và Future Research

Mặc dù đạt được những kết quả xuất sắc, luận án thẳng thắn ghi nhận 3 giới hạn nghiên cứu:

1. Giới hạn mẫu thực nghiệm in vivo: Nghiên cứu mới dừng lại ở các mô hình động vật gặm nhấm (chuột Swiss, thỏ New Zealand), chưa tiến hành thử nghiệm lâm sàng giai đoạn 1 trên người tình nguyện để đánh giá sinh khả dụng và dược động học (PK/PD) của cycloalliin trong huyết tương người.
2. Cơ chế phân tử chuyên sâu: Tác động hạ đường huyết và hạ lipid máu chưa được giải mã chi tiết ở cấp độ biểu hiện gen (chưa phân tích RT-PCR hoặc Western Blot đối với các thụ thể GLUT-4, AMPK, SREBP-1c, HMG-CoA reductase).
3. Quy mô sản xuất: Quy trình lên men và phun sấy mới được tối ưu hóa ở quy mô phòng thí nghiệm và pilot nhỏ (2 kg nguyên liệu/mẻ), cần tiếp tục thẩm định khi mở rộng quy mô công nghiệp (pilot 50–100 kg/mẻ).

Định hướng nghiên cứu tiếp theo (4–5 hướng cụ thể):

• Hướng 1: Nghiên cứu dược động học, phân bố sinh học và thời gian bán thải ($t_{1/2}$) của cycloalliin sau khi uống cao khô hành đen trên người.
• Hướng 2: Giải trình tự gen và phân tích proteomic nhằm làm rõ lộ trình tín hiệu nội bào mà cycloalliin và flavonoid hành đen tác động lên quá trình tân tạo glucose tại gan và dị hóa mỡ tại mô mỡ trắng.
• Hướng 3: Ứng dụng công nghệ nano (nano-phytosome, nano-emulsion) để bao gói cao khô hành đen nhằm tăng cường độ tan và sinh khả dụng qua đường uống.
• Hướng 4: Thiết kế thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên mù đôi đối chứng giả dược (Double-blind, Randomized Placebo-Controlled Trial) trên bệnh nhân tiền đái tháo đường và rối loạn lipid máu hỗn hợp.

Tác động và ảnh hưởng

• Tác động học thuật: Cung cấp cơ sở dữ liệu toàn diện đầu tiên về hành đen từ Allium ascalonicum L., ước tính tạo tiền đề cho hàng chục trích dẫn quốc tế trong các tạp chí chuyên ngành Hóa thực vật (Phytochemistry), Công nghệ Dược phẩm (Journal of Pharmaceutical Sciences) và Thực phẩm Chức năng (Journal of Functional Foods).
• Chuyển đổi công nghiệp Dược phẩm & Thực phẩm chức năng: Cung cấp quy trình công nghệ hoàn chỉnh từ nguyên liệu đến thành phẩm dạng bột cao khô chuẩn hóa, giúp các doanh nghiệp dược phẩm trong nước chủ động nguồn nguyên liệu điều trị bệnh chuyển hóa mà không phụ thuộc vào nhập khẩu.
• Tác động kinh tế - xã hội: Gia tăng giá trị gia tăng của nông sản hành tím Lý Sơn lên gấp 5–10 lần so với bán củ thô, góp phần bảo vệ sinh kế bền vững cho người nông dân tại các vùng chuyên canh biển đảo và ven biển miền Trung.

Đối tượng hưởng lợi

• Nghiên cứu sinh & Nhà khoa học trẻ: Tiếp cận một mô hình mẫu mực về phương pháp luận nghiên cứu dược học từ hóa thực vật, bào chế đến độc tính và dược lý sàng lọc.
• Các giáo sư, chuyên gia nghiên cứu đầu ngành: Sở hữu hệ dữ liệu chuẩn hóa về phổ NMR 9 chất, phương pháp HPLC thẩm định của cycloalliin và cơ chế tương tác đa hoạt chất trong chiết xuất Allium.
• Bộ phận R&D các tập đoàn dược phẩm: Ứng dụng trực tiếp thông số phun sấy (tá dược Maltodextrin:Aerosil, nhiệt độ $150^\circ\text{C}$, $\text{CR/DP} = 20%$) vào dây chuyền sản xuất viên nang/viên nén hành đen quy mô công nghiệp.
• Nhà hoạch định chính sách & Cơ quan quản lý Dược: Có cơ sở khoa học tin cậy để thẩm định Tiêu chuẩn cơ sở (TCCS) và cấp phép lưu hành cho các sản phẩm bảo vệ sức khỏe có nguồn gốc từ hành đen Việt Nam.

Câu hỏi chuyên sâu

1. Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất của luận án là gì?
Trả lời: Luận án đã mở rộng lý thuyết chuyển hóa lưu huỳnh hữu cơ của Kodera và Lee thông qua việc chứng minh cơ chế tích lũy cycloalliin từ isoalliin trong loài Allium ascalonicum L. dưới tác động của xúc tác enzyme protease $0,03%$, khẳng định cycloalliin là chất chỉ thị hóa học bền vững tuyệt đối qua quá trình gia nhiệt và chuyển hóa sinh học.

2. Đổi mới phương pháp luận bào chế so với các nghiên cứu trước đây?
Trả lời: So với công trình của Ichikawa (2006) hay Tran Gia Buu (2020) chỉ dừng lại ở dịch chiết lỏng thô hoặc sấy thăng hoa đắt đỏ, luận án đã tiên phong ứng dụng công nghệ phun sấy công nghiệp với hệ tá dược kết hợp Maltodextrin - Aerosil ($95:5$), kiểm soát hoàn hảo chỉ số nén Carr ($CI < 18%$) và độ ẩm bột khô $\le 4,2%$, tạo ra dạng bào chế rắn có độ ổn định vượt trội.

3. Phát hiện thực nghiệm nào gây bất ngờ nhất về mặt dược lý?
Trả lời: Đó là khả năng hạ lipid máu kép (giảm cả Cholesterol toàn phần $38,4%$ và Triglycerid $42,1%$) đi kèm tác dụng tăng cường HDL-C ($28,7%$) trên chuột thực nghiệm, kết hợp với hoạt tính ức chế enzym $\alpha$-glucosidase in vitro mạnh mẽ, chứng minh cao khô hành đen có hiệu năng điều hòa chuyển hóa toàn diện tương đương các hợp chất tổng hợp đơn đích mà hoàn toàn không gây độc tính trên gan, thận khi dùng kéo dài.

4. Đề tài có cung cấp đầy đủ quy trình lặp lại (Replication Protocol)?
Trả lời: Có. Toàn bộ thông số từ nguồn nguyên liệu định danh, điều kiện lên men nhiệt ẩm, chương trình sắc ký HPLC-UV (dung môi, gradient, bước sóng $210\text{ nm}$), tỷ lệ phối trộn tá dược phun sấy đến các mô hình gây bệnh thực nghiệm in vivo đều được mô tả chi tiết với độ lặp lại cao ($\text{RSD} < 2%$).

5. Lộ trình nghiên cứu 10 năm được phác thảo ra sao?
Trả lời: Lộ trình tập trung vào 3 giai đoạn: (1) Nâng cấp quy trình phun sấy lên quy mô công nghiệp 100 kg/mẻ và hoàn thiện hồ sơ đăng ký lưu hành thuốc y học cổ truyền; (2) Giải mã cơ chế thụ thể phân tử GLUT-4/AMPK; (3) Tiến hành các thử nghiệm lâm sàng pha II/III đánh giá hiệu quả hỗ trợ điều trị đái tháo đường typ 2 và xơ vữa động mạch trên bệnh nhân Việt Nam.

Kết luận

1. Xây dựng thành công quy trình lên men hành đen sinh học: Xác lập bộ thông số tối ưu (ủ nhiệt ẩm $70 - 75^\circ\text{C}$, $\text{RH } 80 - 85%$, 35–45 ngày kết hợp protease $0,03%$), làm tăng hàm lượng cycloalliin gấp hơn 3 lần và gia tăng mạnh mẽ polyphenol toàn phần.
2. Chuẩn hóa hệ thống phân tích và xác định cấu trúc chất: Thẩm định thành công phương pháp HPLC-UV định lượng CYC theo chuẩn quốc tế ICH và giải mã cấu trúc 9 hợp chất chuyển hóa tinh khiết qua phổ NMR.
3. Làm chủ công nghệ bào chế cao khô chất lượng cao: Thiết lập quy trình phun sấy với hệ tá dược Maltodextrin:Aerosil, hiệu suất thu hồi $> 72,5%$, độ ẩm $\le 4,2%$, đạt tiêu chuẩn cơ sở và ổn định qua thử nghiệm lão hóa cấp tốc.
4. Chứng minh tính an toàn sinh học tuyệt đối: Không xác định được liều độc cấp $\text{LD}{50}$ ($D{\max} = 15,0\text{ g/kg}$); dùng liều cao bán trường diễn 28 ngày trên thỏ không làm biến đổi bất kỳ chỉ số huyết học, sinh hóa hay mô bệnh học gan, thận, lách nào.
5. Khẳng định hiệu lực dược lý đa mục tiêu: Chứng minh tác dụng hạ lipid máu rõ rệt ($p < 0,01$), giảm glucose máu trên mô hình đái tháo đường typ 2 thực nghiệm thông qua ức chế enzym $\alpha$-glucosidase và thể hiện độc tính tế bào chọn lọc trên các dòng ung thư A549, HepG2, HeLa.
6. Mở ra hướng đi đột phá cho dược liệu Việt Nam: Chuyển giao thành công chuỗi giá trị khoa học công nghệ cao cho nông sản đặc hữu hành ta Lý Sơn, tạo tiền đề vững chắc cho việc phát triển các chế phẩm thuốc và thực phẩm bảo vệ sức khỏe đạt chuẩn quốc tế.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. TỔNG QUAN VỀ CÂY HÀNH TA Hành ta có tên khoa học là Allium ascalonicum L., thuộc họ Hành (Liliaceae) [1]. Đặc điểm thực vật và phân bố Cây thảo, sống 1 - 2 năm, cao 15 - 50 cm.

Bản chất hình thái thân hành ta phình to nên thường gọi là củ hành, có kích thước thay đổi, có cạnh, gồm nhiều vẩy thịt mỏng như giấy, có chứa nhiều chất dinh dưỡng. Hành ta có hình dạng trong hơi dẹt, hình bầu dục hoặc hình bầu dục dài, thường có màu đỏ, tím hay màu trắng. Lá dài, hình trụ, nhọn, rỗng, tròn, màu xanh mốc. Cụm hoa dạng tán ở đầu một cán cao 20 - 50 cm, rộng, tán hoa hình cầu.

Hoa có 6 phiến hoa rời, màu trắng, hồng hay tím nhạt, cuống hoa dài 1 - 1,5 cm [1]. Hình ảnh hành ta * Nguồn: Ảnh chụp tại huyện đảo Lý Sơn tháng 8 năm 2017 Phân bố: Cây trồng làm rau ăn từ lâu đời, đầu tiên được trồng ở Tadzhikistan, Afghanistan, Iran sau đó du nhập khắp thế giới. Ở nước ta cây hành ta được trồng ở nhiều nơi như huyện Kinh Môn (tỉnh Hải Dương), huyện đảo Lý Sơn (tỉnh Quảng Ngãi), huyện Ninh Hải (tỉnh Ninh Thuận), thị xã Vĩnh Châu (tỉnh Sóc Trăng), huyện Gò Công Đông (tỉnh Tiền Giang) nhưng luan an 4 nổi tiếng nhất là ở thị xã Vĩnh Châu và huyện đảo Lý Sơn. Thường trồng ở rẫy và vùng đồng bằng.

Cây chịu được lạnh vào mùa đông. Vào tháng 7 - 8, lúc lá khô, đào lấy củ đem phơi khô, rồi để trong bóng mát [5]. Bộ phận dùng: Thân hành hay còn gọi là củ hành. Thành phần hóa học Theo các tài liệu thu thập được, thành phần hóa học của hành ta chủ yếu là các flavonoid, các hợp chất lưu huỳnh và các saponin.

Các hợp chất flavonoid Flavonoid trong hành ta chủ yếu thuộc nhóm flavonol như kaempferol, isorhamnetin, dẫn chất của quercetin: isoquercetin, quercetin monoglucosid, quercetin diglucosid và quercetin tự do. Theo nghiên cứu của Fattorusso E. và cộng sự, sau khi thu nhận cao methanol từ hành ta và phân lập bằng các hỗn hợp dung môi như n-butanol và nước, methanol và nước, thông qua nhiều loại cột khác nhau đã xác định được một số flavonoid và glycosid của chúng như quercetin, quercetin-4'-glucosid (spiraeosid), quercetin-7-glucosid, quercetin-3-4'-diglucosid, isorhamnetin và isorhamnetin-3-4'-diglucosid [2]. và cộng sự đã thực hiện nghiên cứu đánh giá hàm lượng flavonol glucosid trong một số loài hành, bằng phương pháp HPLC-DAD-ESI-MS-MS.

Kết quả cho thấy hành ta có chứa các hợp chất quercetin 3,7,4'-triglucosid, quercetin 7,4'-diglucosid, quercetin 3,4'- diglucosid, isorhamnetin 3,4'-diglucosid, quercetin 3-glucosid, quercetin 4'- glucosid và isorhamnetin 4'-glucosid, trong đó quercetin 3,4'-diglucosid và quercetin 4'-glucosid có hàm lượng cao nhất, tương ứng là 516-605 mg/kg và 392-509 mg/kg [6]. Ngoài ra trong hành ta còn có một số glucosid khác của quercetin và isorhamnetin như quercetin-3-rhamnosid (quercitrin) và isorhamnetin-3- glucosid [7]. luan an 5 Theo kết quả của các nghiên cứu đã được thực hiện, các hợp chất flavonoid phân lập được từ hành ta được trình bày ở bảng 1. Các hợp chất flavonoid trong hành ta STT Tên hợp chất TLTK 1 Quercetin (1) [2], [7] 2 Quercetin 4'-O-glucosid (2) [7] 3 Quercetin 3-O-rhamnosid (3) [7] 4 Quercetin 3,4'-O-diglucosid (4) [7] 5 Quercetin 7-glucosid (5) [6] 6 Quercetin 3-glucosid (6) [6] 7 Quercetin 7,4'-diglucosid (7) [6] 8 Quercetin 3,7,4'-triglucosid (8) [6] 9 Isorhamnetin (9) [2] 10 Isorhamnetin 3,4'-O-diglucosid (10) [7] 11 Isorhamnetin 4'-glucosid (11) [6] 12 Isorhamnetin 3-O-glucosid (12) [7] 13 Kaemferol 3-O-glucosid (13) [7] 14 Kaemferol 3,4'-O-glucosid (14) [7] R1 R2 R3 R4 R1 R2 R3 R4 (1) H H H H (7) H Glc H Glc (2) H H H Glc (8) Glc Glc H Glc (3) Rha H H H (9) H H CH3 H (4) Glc H H Glc (10) Glc H CH3 Glc (5) H Glc H H (11) H H CH3 Glc (6) Glc H H H (12) Glc H CH3 H R1 R2 (13) Glc H (14) Glc Glc Hình 1.

Cấu trúc của các flavonoid phân lập từ hành ta * Nguồn: Theo Fatturuso E. Các hợp chất lưu huỳnh hữu cơ Các hợp chất lưu huỳnh hữu cơ trong hành ta tồn tại dưới 3 dạng chính là cystein sulfoxyd, γ-glutamylcystein và các hợp chất lưu huỳnh dễ bay hơi khác [8]. Hợp chất γ-glutamylcystein dễ bị oxy hóa và thủy phân thành thiosulfinat như là S-alky(en)yl-cystein sulfoxyd (ACSO) đại diện là các chất như alliin, isoalliin, methiin và propiin [8], [9], [10]. ACSO và các thiosulfinat khác có thể chuyển đổi thành các hợp chất có chứa lưu huỳnh dễ bay hơi như dithiin, allicin, vinyldithiin, bởi enzym allinase [8], [11].

Tuy nhiên, cycloalliin (CYC) không bị chuyển đổi thành thiosulfinat bởi enzym allinase và vẫn ổn định trong quá trình cắt hoặc nghiền hành ta [12], [13]. * Cycloalliin a) Nguồn gốc - CYC là một sulfoxyd mạch vòng bền vững với nhiều hoạt tính sinh học khác nhau, thuộc nhóm organosulfur, có màu trắng. - CYC có nhiều trong hành ta, hành tây, hẹ và tỏi tây. - CYC sử dụng trong các nghiên cứu thường ở dạng cycloalliin hydroclorid monohydrat [8], [12], [13].

b) Công thức hóa học Hình 1. Công thức hóa học của cycloalliin * Nguồn: Theo Ichikawa M. (2006) [12] - Tên IUPAC: (1S, 3R, 5S)-5-methyl-1,4-thiazan-3-carboxylic acid 1- oxyd. - Công thức phân tử: C6H11NO3S luan an 7 - Khối lượng mol phân tử: 177,22 đvC [14].

c) Tính chất vật lý - Cảm quan: Bột tinh thể màu trắng. - Độ tan: Trong môi trường nước là 52,3 g/l. - Khối lượng riêng: 1,4 g/cm3 [14]. - Một đặc điểm quan trọng của cycloalliin là có khả năng hấp thụ tia tử ngoại, có cực đại hấp thụ tại bước sóng 210 nm [15], [16].

d) Độ ổn định - CYC ổn định trong các dung dịch acid, dung dịch kiềm và các dịch sinh học như máu toàn phần, huyết tương. - CYC ổn định trong dung dịch HCl 0,1M và NaOH 0,1M ở 70°C trong 3 giờ, hầu như không chuyển hóa thành chất khác, lượng thu hồi là hơn 98%. Khi thêm CYC vào máu và huyết tương chuột thì hơn 96% CYC được thu hồi. Trong các thí nghiệm với các chất đồng nhất của gan chuột, hơn 97% CYC không bị phân hủy sau khi ủ ở 37°C, thời gian là 7 giờ và không có chất chuyển hóa nào của CYC được phát hiện [15].

e) Các phương pháp định lượng - Ichikawa M. và cộng sự sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để định lượng CYC. Pha động là hỗn hợp acetonitril/nước với tỷ lệ 84:16 (thể tích/ thể tích) và 0,2% acid phosphoric. Điều kiện sắc ký: Cột Shodex Asahipak NH2P-50 2D (150 mm x 2 mm, 5 µm), nhiệt độ cột 25°C, tốc độ dòng 0,2 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 1 µl và detector UV với bước sóng 210 nm [16].

và cộng sự cũng định lượng CYC theo phương pháp được mô tả bởi Ichikawa M. và cộng sự với một số thay đổi như cột sắc ký là cột Shodex Asahipak NH2P-50 4E (250 mm x 4,6 mm), pha động là dung dịch A luan an 8 (0,2%, thể tích/thể tích, acid phosphoric trong nước) và dung dịch B (0,2%, thể tích/thể tích, acid phosphoric trong acetonitril) chạy theo chương trình gradient (0-5 phút: 84% B, 5-15 phút: 84-80% B, 15-20 phút: 80-84% B, 20- 30 phút: 84% B), nhiệt độ cột 30°C, tốc độ dòng 1,5 ml/phút và thể tích tiêm mẫu là 10 µl [17]. f) Tác dụng dược lý CYC có tác dụng giảm nguy cơ mắc ung thư và bệnh tim mạch, cũng như đóng một vai trò quan trọng trong việc giảm chất béo trung tính trong huyết thanh ở chuột [18], [19]. Ngoài ra, CYC còn có tác dụng làm tăng đáng kể hoạt động tiêu sợi huyết của máu trong một thử nghiệm trên người nhưng không có tác dụng trên kết tập tiểu cầu [20], [21], [22].

g) Quá trình chuyển hóa các chất thành cycloalliin Trong hành ta có các hợp chất lưu huỳnh hữu cơ được sinh tổng hợp bằng cách sử dụng các hợp chất vô cơ có chứa lưu huỳnh. Lưu huỳnh kết hợp với L-cystein, sau đó trải qua hai quá trình chuyển đổi, glutamyl hóa và glycyl hóa để tạo ra glutathion. Sau quá trình cố định lưu huỳnh này, các hợp chất lưu huỳnh khác nhau được tạo ra dưới dạng một loạt các phân tử có chứa lưu huỳnh, chẳng hạn như S-alk (en) yl-L-cystein sulfoxyd, γ-glutamyl-S-alk (en) yl-L-cystein và γ -glutamyl-S-alk (en) yl-L-cystein sulfoxyd thông qua S-alk (en) yl hóa dư lượng L-cystein, tiếp theo là loại bỏ glycin để tạo thành γ- glutamyl peptid (GSPC). GSPC được chuyển đổi thành S-alk(en)yl-L-cystein sulfoxyd như alliin, isoalliin, methiin bởi γ-glutamyl transpeptidase và oxydase [23], [24], [25].

và cộng sự đã trình bày con đường sinh tổng hợp của các hợp chất S-1-propenyl bao gồm trans-S-1-propenyl-L-cystein sulfoxyd (trans-S1PCSO, isoalliin) trong hành tây, thông qua kỹ thuật đánh dấu đồng vị [26]. Trong hành tây, sau khi khử cacboxyl hóa dư lượng β- carboxypropenyl trong S- (β-carboxypropenyl) -γ-glutamyl-L cystein để tạo ra γ-glutamyl-S-1-propenyl-L-cystein (GS1PC), lưu huỳnh trong GS1PC bị luan an 9 oxy hóa bởi oxygenase và sau đó isoalliin được giải phóng khỏi GS1PC sulfoxyd bằng cách khử oxy hóa [27]. Quá trình sinh tổng hợp isoalliin * Nguồn: Theo Kodera Y. Vì vậy, hàm lượng CYC sẽ tăng lên trong quá trình bảo quản, đun nấu hành ta ở nhiệt độ cao cũng như lên men hành ta dưới tác động của nhiệt độ.

luan an 10 Hình 1. Cơ chế chuyển hóa isoalliin thành cycloalliin * Nguồn: Theo Lee H. (2016) [17] Ngoài ra, bằng phương pháp sắc ký khí, Wu J. và cộng sự đã xác định được trong tinh dầu chiết từ hành ta, các hợp chất lưu huỳnh hữu cơ có hàm lượng khoảng 0,03% (thể tích/khối lượng) so với khối lượng nguyên liệu khô kiệt (bảng 1.

luan an 11 Bảng 1. Các hợp chất lưu huỳnh hữu cơ trong hành ta Thành phần Hàm lượng (%)* Dimethyl disulfid 1,99 Propyl propenyl sulfid 0,28 Methyl propyl disulfid 3,59 Methyl cis-propenyl disulfid 2,91 Methyl trans-propenyl disulfid 5,09 Dimethyl trisulfid 18,81 Dipropyl disulfid 4,16 Propyl cis-propenyl disulfid 2,79 Propyl trans-propenyl disulfid 4,43 Methyl propyl trisulfid 19,93 Methyl propenyl trisulfid 4,85 Dipropyl trisulfid 5,55 1-methylthiopropyl ethyl disulfid 6,41 Propyl cis-propenyl trisulfid 4,50 Propyl trans-propenyl trisulfid 5,47 * so với tổng các hợp chất chiết được trong tinh dầu. * Nguồn: Theo Wu J. Các hợp chất chính trong tinh dầu hành ta * Nguồn: Theo Mnayer D.

Các hợp chất saponin Năm 2002, Fattorusso E. và cộng sự đã chiết xuất, phân lập được từ luan an 12 hành ta các hợp chất saponin mới là ascalonicosid A1/A2 và ascalonicosid B [2]. Đây là các hợp chất saponin furostanol lần đầu tiên được phân lập từ hành ta. và cộng sự đã chiết xuất, phân lập được từ hành ta 2 hợp chất saponin furostanol mới là ascalonicosid C, ascalonicosid D và 2 hợp chất đã biết là dichotomin, parisaponin [31].

Các hợp chất saponin phân lập được trình bày ở bảng 1.