CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về Cốt toái bổ (Drynaria bonii H.1 Về vị trí phân loại Cốt toái bổ có tên khoa học là Drynaria bonii H. Christ, thuộc họ Dương xỉ (Polypodiaceae) hay còn được gọi dưới các tên Tắc kè đá, Ráng bay, Hộc quyết, Hầu khương, Hồ tôn khương, Thân khương, Tổ phượng, Tổ rồng, Tổ diều, Co tạng tó, Co in tó [7].2 Về đặc điểm thực vật và phân bố Cây Cốt toái bổ mọc bám thành mảng trên các hốc đá, trên thân cây gỗ ở rửng kýn thường xanh ẩm. Cây sống lâu năm, có thân rễ mọc bò,dày, mọng nước, có lông dạng vảy cứng màu vàng nâu, vảy hình ngọn giáo. Có 2 loại lá: loại lá bất thụ là lá ở gốc có tác dụng hứng mùn, hình thận hay hình trái xoan, không cuống màu nâu, mép nguyên lượn sóng; loại lá hữu thụ - sinh sản có cuống dài 10 – 20 cm, phiến lá dài 25 - 40 cm, rộng 15- 20cm màu lục sẫm, chẻ lông chim thành 7- 9 thùy hình trái xoan – ngọn giáo, mép uốn lượn.
Các túi bào tử rất nhỏ, xếp hai hàng giữa gân phụ mặt duới lá, bào tử vàng nhạt, hình trái xoan [4] (Hình 1. Cây Cốt toái bổ - Drynaria bonii H. Christ Tại Việt Nam, D. bonii phân bố rộng rãi ở các tỉnh miền núi phía Bắc như Cao Bằng, Lạng Sơn, Quảng Ninh,… qua các tỉnh Tây Nguyên tới Đồng Nai, Kiên Giang (Phú Quốc).
Loài này còn được tìm thấy ở Trung Quốc và Lào [2, 4]. Cốt toái bổ sinh sản bằng bào tử, sinh trưởng chậm, phát tán nhờ gió và nước mưa. Mùa có sinh sản tháng 5 đến tháng 8 [2].3 Bộ phận dùng Thân rễ - Rhizoma Drynariae - đã phơi hay sấy khô của cây cốt toái bổ (Drynaria bonii H. Việc thu hái dược liệu này có thể diễn ra quanh năm, nhưng thường là vào tháng 4 đến tháng 8, 9.
Hái về, bỏ sạch đất cát, loại trừ các lá là dùng được. Nếu dùng khô thì sau khi rửa sach đất cát, hoặc phơi khô ngay, hoặc phơi sau khi đồ cho chín để dễ bảo quản. Muốn hết lông, người ta đốt nhẹ cho cháy hết lông nhỏ phủ trên thân rễ [4]. Đoạn thân rễ tương đối thẳng, ít phân nhánh, dài 5 cm đến 17 cm, rộng 0,6 cm đến 1 cm.
Lông dạng vẩy màu vàng nâu dễ rụng, để lộ thân rễ màu vàng nâu hoặc nâu nhạt. Mặt cắt màu vàng [2, 4].4 Thành phần hóa học Trong cây Cốt toái bổ (Drynaria bonii H. Christ), thành phần hóa học chính bao gồm các phenolic, các terpenoid, saponin. Ngoài ra còn có steroid, tanin, đường, vitamin,…[8, 30, 32, 36-38].
Các phenolic là thành phần quan trọng trong Cốt toái bổ, bao gồm: acid protocatechuic (PA), protocatechualdehyd, chrysophanol, nobiletin, isoliquiritigenin, rutin, nicotiflorin, linocaffein, kaempferol, drynaether A, 4'-hydroxy-7- methoxyflavan,…[37, 38]. Các terpenoid được phân lập từ Cốt toái bổ, bao gồm: 24-metylencycloartan-3β- ol, triphyllol,…[8, 32].5 Tác dụng theo Y học cổ truyền Theo Y học cổ truyền, Cốt toái bổ có vị đắng, tính ôn và không độc, quy vào hai kinh can và thận. Dược liệu có khả năng bổ thận, trị đau xương, hành huyết khứ ứ, làm thuốc hòa hoãn, sát trùng đỡ đau. Dùng chữa dập xương, đau xương, bong gân, sai khớp, ù tai, răng đau, thận hư.
Những người âm hư, huyết hư đều không dùng được [4]. Dùng uống trong hay đắp ngoài. Liều dùng hàng ngày là 6 đến 12g, dùng ngoài không có liều lượng. Có thể dùng dưới hình thức thuốc sắc hay ngâm rượu, hoặc giã đắp lên vết thương [4].6 Tác dụng dược lý Trong nghiên cứu năm 2020, Phạm Thị Nhật Trinh và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng tăng sinh tế bào của các hợp chất đã phân lập được từ thân rễ D.
bonii trên tế bào MG63. Kết quả chỉ ra rằng các hợp chất 24-methylen-cycloartan-3β-ol, triphyllol và AP 3 kích thích sự tăng sinh của tế bào nguyên bào xương MG63 là 8,49%; 11,18% và 7,68% tương ứng ở các nồng độ 100 μg/mL [36]. Đây là báo cáo đầu tiên về tác dụng tăng sinh tế bào của các hợp chất phân lập được từ D. bonii đối với các tế bào như nguyên bào xương.2 Tổng quan về AP 1.1 Tính chất Vật lý và Hóa học Hình 1.
Công thức cấu tạo của AP Tên khoa học được biết đến của acid protocatechuic (PA) là acid 3,4- dihydroxybenzoic. AP có công thức phân tử là C7H6O4 và khối lượng phân tử là 154,12 g/mol [50]. Ở điều kiện thường, AP là chất rắn màu trắng, bị biến màu khi tiếp xúc với không khí. Nhiệt độ nóng chảy là 221oC.
Tan trong nước, methanol, ethanol, ether. Độ tan trong nước là 1,8g/L ở 14oC và 271g/L ở 80oC. Hệ số phân bố dầu nước logP = 0,84 [50]. Trong cấu trúc phân tử AP có nhóm chức -OH phenol và nhóm chức carboxylic nên AP thể hiện tính acid.
Các giá trị pKa của acid là 4,48; 8,83; 12,6 [50]. Tác dụng bảo vệ xương Nghiên cứu của Phạm Thị Nhật Trịnh cho thấy AP kých thích sự tăng sinh của tế bào nguyên bào xương MG63 là 7,68% tương ứng ở nồng độ 100 μg/ml [36]. Xi-yao Li và cộng sự [41] cho thấy AP ức chế sự biệt hóa tế bào xương và kích thích quá trình tự chết theo chương trình ở các tế bào xương trưởng thành. Tác dụng chống oxy hóa AP dễ bị oxy hóa thành dạng quinon.
Tính chất hóa học này thể hiện tiềm năng chống oxy hóa của hợp chất này. Jun Liu và cộng sự [23] đã chế tạo màng Chitosan gắn AP. Kết quả của họ cho thấy đây là một loại màng tiềm năng để chống oxy hóa cho thực phẩm. Tác dụng chống viêm Suresh R.
Naik và cộng sự [22] thí nghiệm trên chuột nhắt và cho thấy kết quả giảm đau, kháng viêm đáng kể của AP. Kết quả này hứa hẹn một loại thuốc giảm đau, kháng viêm mới đầy tiềm năng như AP sẽ được đưa vào sử dụng trong tương lai. Tác dụng kháng khuấn Nghiên cứu của Mei-chin Yin và cộng sự [24] cho thấy khả năng kháng Staphylococcus aureus kháng methicillin, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa và Acinetobacter baumanni của AP.3 Các phương pháp xử lý mẫu dược liệu áp dụng trong việc phân tích AP AP chứa nhóm hydroxy và carboxylic nên nó tương đối phân cực và hòa tan được vào trong nước. Tuy nhiên, nước mặc dù là dung môi rẻ tiền và an toàn nhưng nó không phải là dung môi phù hợp nhất để chiết AP nói riêng và các hợp chất phenolic nói chung ra khỏi nền mẫu thực vật.
Hỗn hợp của nước với các dung môi hữu cơ khác như methanol, ethanol, aceton, acetonitril hay DMSO ở các tỷ lệ khác nhau [25, 31, 44] được nghiên cứu và sử dụng rộng rãi do khả năng hòa tan tốt cũng như có đặc tính lý học phù hợp với các kĩ thuật chiết xuất hiện có trong phòng thí nghiệm. Các biến số như pH, nhiệt độ, thời gian chiết, số lần chiết, tỷ lệ giữa khối lượng mẫu – thể tích dung môi cũng đóng vai trò rất quan trọng đến hiệu quả của quá trình chiết [25]. Có rất nhiều kĩ thuật chiết xuất khác nhau đã được sử dụng để giải phóng AP ra khỏi nền mẫu. Ngành công nghiệp chiết xuất trên thế giới đã phát triển các kĩ thuật hiện đại như chiết xuất có hỗ trợ siêu âm (UAE), chiết xuất có hỗ trợ vi sóng (MAE), chiết xuất có sự hỗ trợ của siêu âm/vi sóng (UMAE), Chiết xuất enzyme có sự hỗ trợ của siêu âm (UAEE), chiết xuất enzyme có hỗ trợ vi sóng (MAEE), chiết xuất bằng dung môi tăng tốc (ASE), chiết với chất lỏng siêu tới hạn (SFE), chiết xuất với nước cận tới hạn (SCWE), chiết xuất với áp xuất thủy tĩnh cao (HHPE), chiết xuất với sự có mặt của Cyclodextrin,.
Tuy vậy, lựa chọn kĩ thuật chiết xuất nào cũng cần phải xem xét đến tính khả thi khi áp dụng vào phòng thí nghiệm đang vận hành, tính sẵn có của thiết bị hay dung môi. Nhìn chung, ở quy mô phòng thí nghiệm, chiết hồi lưu, chiết siêu âm, chiết soxhlet là phổ biến hơn cả. Dược điển Trung Quốc 2020 sử dụng phương pháp chiết siêu âm để định lượng AP trong Cibotium barometz [15]. Katarzyna Szewczyk và cộng sự đã so sánh các phương pháp như chiết soxhlet, chiết siêu âm, chiết bằng dung môi tăng tốc để lựa chọn phương pháp chiết phù hợp nhất trong việc phân tích AP và các acid phenolic khác có trong các loài Impatien [35].
Kết quả là phương pháp chiết siêu âm được lựa chọn. 5 Do tính phức tạp của nền mẫu, các chất hữu cơ khác trong thực vật có thể gây ra sự ảnh hưởng lớn đối với quá trình phân tích AP. Bước làm sạch nền mẫu trong một số trường hợp là cần thiết trước khi phân tích bằng HPLC hay GC [42, 43]. Ngoài ra, bước làm sạch này có thể giúp làm giàu mẫu, tăng độ nhạy của phương pháp phân tích và rất thích hợp cho các phân tích vết hoặc siêu vết.
Mặc dù vậy, việc phân tích sắc ký (LC hay GC), nếu chương trình sắc ký là đủ tốt để tách AP ra khỏi các chất khác, đạt độ phân giải mong muốn thì có thể bỏ qua bước này. Ngoài ra các kĩ thuật sắc ký mới nổi hiện nay như sắc ký cột song song hay sắc ký hai chiều có thể giải quyết được toán này [39]. Chiết lỏng – lỏng (LLE), chiết pha rắn (SPE) là hai phương pháp làm sạch mẫu được sử dụng nhiều nhất [25, 31]. Ngoài LLE hay SPE còn một số phương pháp khác như chưng cất và chiết xuất đồng thời (SDE) [34], vi chiết pha rắn (SPME) [16],.4 Các phương pháp phân tích AP 1.
Phương pháp sắc ký a. Định tính AP trong dược liệu bằng TLC Sắc ký lớp mỏng (TLC) là một kĩ thuật phân tích nhanh, trực quan, được áp dụng rộng rãi trong phân tích định tính, đặc biệt là đối với dược liệu. Trong hầu hết các chuyên luận về dược liệu của Dược điển Việt Nam, Trung Quốc, Hồng Kông hay Đài Loan,… đều sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng để định tính. Một số phương pháp định tính AP trong dược liệu bằng sắc ký lớp mỏng Đối tượng Xử lý mẫu Điều kiện sắc ký TLTK phân tích - Pha tĩnh: Silicagel G.
2g bột dược liệu Định tính - Pha động: Chloroform – Ethyl được chiết siêu âm Cibotium acetat – Methanol – Acid acetic với methanol, dịch barometz, sử (12:2:1:0,8). [15] chiết được cô đến dụng AP làm - Dẫn xuất hóa: Sắt (III) chlorid 2% còn 1mL làm dịch chất đối chiếu. - Quan sát dưới ánh sáng thường. 2g bột dược liệu Định tính được chiết siêu âm Cibotium - Pha tĩnh: HPTLC silica gel F254 với methanol, dịch barometz, sử (2-10 µm).
chiết được cô cắn, [9] dụng AP và - Pha động: n-Hexan - Ethyl acetat - hòa tan cắn bằng aldehyd Acid acetic băng (5:5:0,1).