Xây Dựng Phương Pháp Định Tính, Định Lượng Acid Protocatechuic Trong Dược Liệu Cốt Toái Bổ (Drynaria bonii H. Christ) Thu Tại Việt Nam

• Tác giả: Ninh Quang Nhã
• Người hướng dẫn: ThS. Nguyễn Mai Hương
• Trường học: Trường Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược sĩ
• Đề tài: Xây Dựng Phương Pháp Định Tính, Định Lượng Acid Protocatechuic Trong Dược Liệu Cốt Toái Bổ (Drynaria Bonii H. Christ) Thu Tại Việt Nam
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2024
• Địa điểm: Hà Nội

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Tổng quan về Cốt toái bổ (Drynaria bonii H. Christ)
• 1.1.1. Về vị trí phân loại
• 1.1.2. Về đặc điểm thực vật và phân bố
• 1.1.3. Bộ phận dùng
• 1.1.4. Thành phần hóa học
• 1.1.5. Tác dụng theo Y học cổ truyền
• 1.1.6. Tác dụng dược lý
• 1.2. Tổng quan về AP
• 1.2.1. Tính chất Vật lý và Hóa học
• 1.2.2. Tác dụng bảo vệ xương
• 1.2.3. Tác dụng chống oxy hóa
• 1.2.4. Tác dụng chống viêm
• 1.2.5. Tác dụng kháng khuẩn
• 1.3. Các phương pháp xử lý mẫu dược liệu áp dụng trong việc phân tích AP
• 1.4. Các phương pháp phân tích AP
• 1.4.1. Phương pháp sắc ký
• 1.4.1.1. Định tính AP trong dược liệu bằng TLC
• 1.5. Tình hình nghiên cứu Cốt toái bổ (Drynaria bonii H. Christ) tại Việt Nam
• 1.6. Sự cần thiết tiến hành nghiên cứu
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Nguyên vật liệu
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.2.1. Nghiên cứu phương pháp định tính bằng TLC
• 2.2.2. Nghiên cứu phương pháp định lượng
• 2.3. Thiết bị thí nghiệm
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM
• 3.1. Nghiên cứu xây dựng phương pháp định tính
• 3.1.1. Khảo sát quy trình xử lý mẫu
• 3.1.2. Thẩm định phương pháp định tính
• 3.1.3. Áp dụng phương pháp định tính đã xây dựng để xác nhận sự có mặt của AP trong một số mẫu dược liệu Cốt toái bổ
• 3.2. Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng
• 3.2.1. Khảo sát điều kiện sắc ký
• 3.2.2. Xây dựng đường chuẩn tiến hành nghiên cứu
• 3.2.3. Xây dựng quy trình xử lý mẫu
• 3.2.4. Thẩm định phương pháp phân tích
• 3.2.5. Áp dụng phương pháp HPLC-DAD đánh giá hàm lượng AP trong một số mẫu dược liệu Cốt toái bổ
• 3.3. Về xây dựng phương pháp định tính
• 3.4. Về xây dựng phương pháp định lượng
• KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Giới Thiệu Nghiên Cứu Acid Protocatechuic trong Cốt Toái Bổ

Xu hướng sử dụng dược liệu Việt Nam có nguồn gốc thiên nhiên ngày càng được ưa chuộng. Kinh nghiệm dân gian đã để lại kho tàng quý báu về các vị thuốc tự nhiên, làm phong phú nền y học. Tuy nhiên, kiểm soát chất lượng dược liệu gặp nhiều thách thức do nền mẫu phức tạp, quy trình xử lý tốn thời gian và thiếu chất chuẩn. Tiêu chuẩn hóa dược liệu là hướng nghiên cứu cần được đầu tư toàn diện. Cốt Toái Bổ từ lâu đã được biết đến với công năng bổ can thận, mạnh gân cốt, dùng trong các trường hợp gan thận yếu, đau nhức xương khớp. Dược điển Việt Nam V (2018) quy định hai loài được sử dụng làm thuốc là Drynaria fortunei và Drynaria bonii. Việc bảo tồn và nhân giống Cốt Toái Bổ cần gắn liền với đảm bảo chất lượng. Acid Protocatechuic (AP) là thành phần chính trong D. bonii, có vai trò bảo vệ xương khớp, chống viêm, chống oxy hóa, kháng khuẩn. Vì thế có thể coi AP là chất đánh dấu cho loài D. bonii, quyết định chất lượng.

1.1. Tổng quan về Dược liệu Cốt Toái Bổ Drynaria bonii

Cốt Toái Bổ (Drynaria bonii H. Christ) thuộc họ Dương xỉ (Polypodiaceae), còn gọi là Tắc kè đá, Ráng bay, Hộc quyết, v.v. Cây mọc bám trên đá hoặc thân cây gỗ, sống lâu năm với thân rễ mọng nước, có lông vảy cứng màu vàng nâu. Có hai loại lá: lá bất thụ (ở gốc) và lá hữu thụ (sinh sản). Tại Việt Nam, D. bonii phân bố rộng rãi ở các tỉnh miền núi phía Bắc, Tây Nguyên, Đồng Nai, Kiên Giang. Cây sinh sản bằng bào tử, sinh trưởng chậm. Thân rễ (Rhizoma Drynariae) là bộ phận dùng, thu hái quanh năm, thường vào tháng 4-8, 9. Thành phần hóa học chính bao gồm phenolic, terpenoid, saponin, steroid, tanin, đường, vitamin. Các phenolic quan trọng bao gồm acid protocatechuic (AP), protocatechualdehyd, chrysophanol, v.v.

1.2. Vai trò của Acid Protocatechuic AP trong Y học

Theo Y học cổ truyền, Cốt Toái Bổ có vị đắng, tính ôn, không độc, quy vào kinh can và thận, có khả năng bổ thận, trị đau xương, hành huyết khứ ứ, làm thuốc hòa hoãn, sát trùng đỡ đau. Dùng chữa dập xương, đau xương, bong gân, sai khớp, ù tai, răng đau, thận hư. Tuy nhiên, người âm hư, huyết hư không nên dùng. Liều dùng hàng ngày là 6-12g, có thể sắc, ngâm rượu, hoặc giã đắp. Nghiên cứu năm 2020 của Phạm Thị Nhật Trinh và cộng sự cho thấy các hợp chất 24-methylen-cycloartan-3β-ol, triphyllol và AP kích thích sự tăng sinh của tế bào nguyên bào xương MG63. Đây là báo cáo đầu tiên về tác dụng tăng sinh tế bào của các hợp chất phân lập từ D. bonii.

II. Thách Thức Định Tính Định Lượng AP trong Cốt Toái Bổ Việt Nam

Kiểm soát chất lượng Cốt Toái Bổ gặp nhiều khó khăn do sự phức tạp của nền mẫu dược liệu, thiếu chất chuẩn và các phương pháp phân tích đặc hiệu. Dược điển Trung Quốc 2020 và Dược điển Hồng Kông 2018 đã có chuyên luận về D. fortunei, bao gồm các chỉ tiêu định tính, định lượng. Tuy nhiên, đối với D. bonii, chưa có nhiều nghiên cứu về xác định và định lượng hoạt chất. Nghiên cứu thành phần hóa học của D. bonii cho thấy acid protocatechuic (AP) là thành phần chính. Vì vậy, việc xây dựng phương pháp định tính và định lượng AP trong Cốt Toái Bổ là cần thiết để đảm bảo chất lượng dược liệu. Mục tiêu nghiên cứu là xây dựng và thẩm định phương pháp định tính, định lượng AP trong Cốt Toái Bổ (Drynaria bonii H. Christ) thu tại Việt Nam, ứng dụng phương pháp này để xác nhận sự có mặt và hàm lượng AP trong các mẫu.

2.1. Sự Cần Thiết của Nghiên Cứu Định Tính Định Lượng AP

Việc định tính và định lượng Acid Protocatechuic (AP) trong Cốt Toái Bổ là rất quan trọng vì nhiều lý do. Thứ nhất, AP được coi là một chất đánh dấu quan trọng cho chất lượng của dược liệu. Thứ hai, việc kiểm soát chất lượng dược liệu đòi hỏi các phương pháp phân tích chính xác và đáng tin cậy. Thứ ba, việc thiếu các tiêu chuẩn và phương pháp phân tích cụ thể cho Cốt Toái Bổ (Drynaria bonii) gây khó khăn cho việc đảm bảo chất lượng sản phẩm. Thứ tư, việc khai thác quá mức và nguy cơ suy giảm nguồn cung cấp Cốt Toái Bổ đòi hỏi sự quan tâm đặc biệt đến việc bảo tồn và phát triển nguồn dược liệu.

2.2. Các Phương Pháp Phân Tích AP Hiện Có và Hạn Chế

Hiện nay, có nhiều phương pháp phân tích Acid Protocatechuic (AP), bao gồm sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), và các phương pháp khác. Tuy nhiên, mỗi phương pháp đều có những hạn chế nhất định. TLC có thể không đủ nhạy để phát hiện AP ở nồng độ thấp. HPLC đòi hỏi thiết bị và kỹ thuật phức tạp. Các phương pháp khác có thể không phù hợp với nền mẫu phức tạp của dược liệu. Do đó, việc phát triển một phương pháp định tính và định lượng AP đơn giản, hiệu quả, và phù hợp với điều kiện thực tế là cần thiết.

III. Phương Pháp Xây Dựng Quy Trình Định Tính Acid Protocatechuic

Nghiên cứu xây dựng phương pháp định tính Acid Protocatechuic (AP) trong dược liệu Cốt Toái Bổ (Drynaria bonii) tập trung vào việc khảo sát quy trình xử lý mẫu và thẩm định phương pháp định tính. Quy trình xử lý mẫu được tối ưu hóa để đảm bảo chiết xuất hiệu quả AP từ dược liệu. Thẩm định phương pháp định tính bao gồm đánh giá độ đặc hiệu, độ nhạy và các yếu tố khác. Phương pháp định tính đã xây dựng được áp dụng để xác nhận sự có mặt của AP trong một số mẫu dược liệu Cốt Toái Bổ. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) được sử dụng với pha tĩnh là silicagel và pha động thích hợp để tách AP.

3.1. Khảo Sát và Tối Ưu Hóa Quy Trình Xử Lý Mẫu Định Tính

Quy trình xử lý mẫu đóng vai trò quan trọng trong việc đảm bảo hiệu quả của phương pháp định tính. Nghiên cứu tập trung vào việc khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất Acid Protocatechuic (AP) từ dược liệu Cốt Toái Bổ, bao gồm dung môi chiết, thời gian chiết, và tỷ lệ giữa khối lượng mẫu và thể tích dung môi. Các dung môi như methanol, ethanol và nước được so sánh để xác định dung môi phù hợp nhất. Thời gian chiết cũng được tối ưu hóa để đảm bảo chiết xuất hoàn toàn AP. Tỷ lệ giữa khối lượng mẫu và thể tích dung môi được điều chỉnh để đạt hiệu quả chiết xuất tốt nhất.

3.2. Thẩm Định Độ Đặc Hiệu và Độ Nhạy Phương Pháp TLC

Độ đặc hiệu và độ nhạy là hai yếu tố quan trọng cần được đánh giá trong quá trình thẩm định phương pháp định tính. Độ đặc hiệu đảm bảo rằng phương pháp chỉ phát hiện Acid Protocatechuic (AP) mà không bị ảnh hưởng bởi các thành phần khác trong dược liệu. Độ nhạy đảm bảo rằng phương pháp có thể phát hiện AP ở nồng độ thấp. Các thử nghiệm được thực hiện để đánh giá khả năng phân biệt AP với các chất khác. Giới hạn phát hiện (LOD) cũng được xác định để đánh giá độ nhạy của phương pháp TLC. Việc sử dụng chất chuẩn AP là bắt buộc để so sánh và xác định.

IV. Phương Pháp Xây Dựng Quy Trình Định Lượng Acid Protocatechuic

Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng Acid Protocatechuic (AP) trong dược liệu Cốt Toái Bổ (Drynaria bonii) tập trung vào việc khảo sát điều kiện sắc ký, xây dựng đường chuẩn, xây dựng quy trình xử lý mẫu và thẩm định phương pháp phân tích. Điều kiện sắc ký được tối ưu hóa để đảm bảo tách tốt AP khỏi các thành phần khác. Đường chuẩn được xây dựng để định lượng AP trong mẫu. Quy trình xử lý mẫu được tối ưu hóa để đảm bảo chiết xuất hiệu quả AP. Thẩm định phương pháp phân tích bao gồm đánh giá độ đúng, độ lặp lại, độ đặc hiệu, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ). Phương pháp HPLC được sử dụng để định lượng.

4.1. Khảo Sát Điều Kiện Sắc Ký Tối Ưu cho HPLC

Điều kiện sắc ký đóng vai trò quan trọng trong việc đảm bảo sự tách tốt Acid Protocatechuic (AP) khỏi các thành phần khác trong dược liệu. Nghiên cứu tập trung vào việc khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách, bao gồm pha động, cột sắc ký, tốc độ dòng và nhiệt độ cột. Các pha động khác nhau như acetonitrile-nước, methanol-nước được so sánh để xác định pha động phù hợp nhất. Các cột sắc ký khác nhau cũng được thử nghiệm để đạt được độ phân giải tốt nhất. Tốc độ dòng và nhiệt độ cột được tối ưu hóa để cải thiện hiệu quả tách và độ nhạy của phương pháp.

4.2. Xây Dựng Đường Chuẩn và Đánh Giá Tính Tuyến Tính

Đường chuẩn là công cụ quan trọng để định lượng Acid Protocatechuic (AP) trong mẫu. Đường chuẩn được xây dựng bằng cách sử dụng các dung dịch chuẩn AP với nồng độ khác nhau. Diện tích pic của AP được đo bằng HPLC và được vẽ so với nồng độ tương ứng. Tính tuyến tính của đường chuẩn được đánh giá bằng cách tính hệ số tương quan (R2). Đường chuẩn phải có tính tuyến tính tốt để đảm bảo độ chính xác của phương pháp định lượng.

V. Kết Quả Định Tính Định Lượng AP trong Mẫu Cốt Toái Bổ Thực Tế

Phương pháp định tính và định lượng đã xây dựng được áp dụng để xác nhận sự có mặt và xác định hàm lượng Acid Protocatechuic (AP) trong các mẫu Cốt Toái Bổ (Drynaria bonii) thu tại Việt Nam. Kết quả cho thấy AP có mặt trong tất cả các mẫu được phân tích. Hàm lượng AP trong các mẫu khác nhau dao động trong một khoảng nhất định, phản ánh sự khác biệt về nguồn gốc, điều kiện canh tác và phương pháp thu hái. Các kết quả này cung cấp thông tin quan trọng về chất lượng của Cốt Toái Bổ và có thể được sử dụng để xây dựng tiêu chuẩn chất lượng.

5.1. Xác Nhận Sự Có Mặt của AP trong Các Mẫu Dược Liệu

Phương pháp định tính đã xây dựng được sử dụng để xác nhận sự có mặt của Acid Protocatechuic (AP) trong các mẫu dược liệu Cốt Toái Bổ thu thập từ nhiều vùng khác nhau của Việt Nam. Kết quả cho thấy tất cả các mẫu đều chứa AP, chứng tỏ rằng AP là một thành phần đặc trưng của Cốt Toái Bổ. Các kết quả này củng cố thêm vai trò của AP như một chất đánh dấu cho chất lượng của dược liệu.

5.2. Đánh Giá Hàm Lượng AP trong Các Mẫu và Phân Tích So Sánh

Phương pháp định lượng đã xây dựng được sử dụng để xác định hàm lượng Acid Protocatechuic (AP) trong các mẫu dược liệu Cốt Toái Bổ. Kết quả cho thấy có sự biến thiên đáng kể về hàm lượng AP giữa các mẫu khác nhau. Các yếu tố như nguồn gốc địa lý, thời điểm thu hái và phương pháp bảo quản có thể ảnh hưởng đến hàm lượng AP. Phân tích so sánh hàm lượng AP giữa các mẫu giúp đánh giá chất lượng và tính đồng nhất của dược liệu Cốt Toái Bổ.

VI. Kết Luận Ý Nghĩa và Hướng Phát Triển Nghiên Cứu AP từ Cốt Toái Bổ

Nghiên cứu đã xây dựng thành công phương pháp định tính và định lượng Acid Protocatechuic (AP) trong dược liệu Cốt Toái Bổ (Drynaria bonii) thu tại Việt Nam. Các phương pháp này có thể được sử dụng để kiểm soát chất lượng dược liệu, đảm bảo tính an toàn và hiệu quả của các sản phẩm từ Cốt Toái Bổ. Hướng phát triển tiếp theo của nghiên cứu là khảo sát tác dụng dược lý của các mẫu Cốt Toái Bổ khác nhau, tìm kiếm các ứng dụng mới của AP trong y học và phát triển các phương pháp chiết xuất và tinh chế AP hiệu quả hơn. Nghiên cứu này góp phần vào việc bảo tồn và phát triển nguồn dược liệu quý giá của Việt Nam.

6.1. Ứng Dụng của Phương Pháp Định Tính Định Lượng trong Kiểm Nghiệm

Phương pháp định tính và định lượng Acid Protocatechuic (AP) được xây dựng có thể được ứng dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm kiểm nghiệm dược liệu để đảm bảo chất lượng Cốt Toái Bổ. Các phương pháp này cung cấp công cụ chính xác và đáng tin cậy để xác định sự có mặt và hàm lượng AP, giúp kiểm soát chất lượng sản phẩm và tuân thủ các tiêu chuẩn chất lượng. Việc áp dụng các phương pháp này sẽ góp phần nâng cao uy tín và giá trị của dược liệu Cốt Toái Bổ trên thị trường.

6.2. Nghiên Cứu Sâu Hơn về Tác Dụng Dược Lý và Ứng Dụng của AP

Nghiên cứu sâu hơn về tác dụng dược lý của Acid Protocatechuic (AP) và các hợp chất khác trong Cốt Toái Bổ là cần thiết để khám phá các ứng dụng tiềm năng của dược liệu trong y học. Các nghiên cứu tiền lâm sàng và lâm sàng có thể được thực hiện để đánh giá hiệu quả của AP trong điều trị các bệnh khác nhau như bệnh xương khớp, viêm nhiễm và các bệnh liên quan đến oxy hóa. Việc tìm kiếm các ứng dụng mới của AP sẽ góp phần tăng giá trị kinh tế của dược liệu Cốt Toái Bổ và mang lại lợi ích cho sức khỏe cộng đồng.