Luận án tiến sĩ: Nghiên cứu dầu sinh học omega 3 6 từ vi tảo Schizochytrium mangrovei TB17

Luận án tiến sĩ nghiên cứu dầu sinh học giàu omega 3, 6 từ vi tảo Schizochytrium mangrovei TB17, ứng dụng trong thực phẩm bảo vệ sức khỏe.

• Tác giả: Lê Thị Thơm
• Người hướng dẫn: GS. Đặng Diễm Hồng
• Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ
• Chuyên ngành: Hóa sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu dầu sinh học giàu axit béo omega 3 - 6 từ chủng vi tảo biển dị dưỡng Việt Nam Schizochytrium mangrovei TB17 để làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Giới thiệu chung về axit béo, vai trò, nguồn gốc và con đường sinh tổng hợp axít béo
• 1.1.1. Giới thiệu chung về axit béo
• 1.1.2. Vai trò và ứng dụng của PUFAs
• 1.1.3. Nguồn cung cấp PUFAs
• 1.1.4. Con đường sinh tổng hợp PUFAs ở vi tảo
• 1.2. Vi tảo biển dị dưỡng, công nghệ nhân nuôi sinh khối và các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình nhân nuôi sinh khối
• 1.2.1. Vị trí phân loại và đặc điểm của chi Schizochytrium
• 1.2.2. Công nghệ nhân nuôi sinh khối vi tảo biển dị dưỡng trên thế giới
• 1.2.3. Công nghệ nhân nuôi sinh khối chi Schizochytrium trên các quy mô khác nhau và sản xuất thương mại DHA
• 1.2.4. Một số điều kiện ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và sản xuất DHA ở thraustochytrid, đặc biệt là chi Schizochytrium
• 1.3. Các phương pháp tách chiết, tinh sạch PUFAs, bảo quản dầu
• 1.3.1. Các phương pháp tách chiết dầu thô có chứa PUFAs
• 1.3.2. Các phương pháp thủy phân dầu từ dầu thô
• 1.3.3. Các phương pháp tinh sạch PUFAs, DHA, EPA, DPA
• 1.3.4. Bảo quản axit béo
• 1.4. Nghiên cứu tính an toàn và tác dụng tăng cường trí nhớ, khả năng học tập của dầu tách chiết từ Schizochutrium đối với người và động vật
• 1.5. Tình hình sản xuất và tách chiết PUFAs từ VTBDD ở Việt Nam
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Chủng tảo và điều kiện nhân nuôi sinh khối
• 2.2. Động vật thí nghiệm
• 2.3. Sinh khối tảo và cặp mồi đặc hiệu
• 2.4. Địa điểm nghiên cứu
• 2.5. Hóa chất và thiết bị sử dụng
• 2.5.1. Các dụng cụ và thiết bị sử dụng
• 2.5.2. Môi trường
• 2.6. Phương pháp nghiên cứu
• 2.6.1. Sàng lọc và nhân nuôi sinh khối chủng tiềm năng trong các hệ thống lên men khác nhau cho tích lũy các axit béo ω 3 - 6 cao
• 2.6.2. Phương pháp tách chiết lipit và làm giàu hỗn hợp axít béo giàu ω 3 - 6
• 2.6.3. Xác định các chỉ tiêu chất lượng của dầu
• 2.6.4. Tính an toàn và tác dụng tăng cường trí nhớ, khả năng học tập của viên Algal oil omega 3 (AOO-3-6)
• 2.7. Bố trí thí nghiệm
• 2.7.1. Sàng lọc nhanh chủng/loài tiềm năng cho sản xuất sinh khối giàu axit béo ω 3 - 6
• 2.7.2. Thí nghiệm nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chủng tiềm năng
• 2.7.3. Nhân nuôi sinh khối chủng S. mangrovei TB17 trong các hệ thống lên men khác nhau (1, 5, 10, 30 và 150 Lít)
• 2.7.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện đến quá trình tách chiết dầu sinh học giàu axít béo ω 3 - 6
• 2.7.5. Nghiên cứu khả năng bảo quản của các chất chống oxy hóa lên chất lượng dầu sinh học omega-3 và omega-6
• 2.7.6. Nghiên cứu tính an toàn và tác dụng tăng cường trí nhớ, khả năng học tập của viên AOO-3-6
• 2.8. Xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Sàng lọc chủng/loài tiềm năng và lựa chọn điều kiện nhân nuôi sinh khối thích hợp ở các quy mô khác nhau
• 3.1.1. Sàng lọc nhanh chủng/loài tiềm năng cho sản xuất sinh khối giàu axit béo omega 3 - 6
• 3.1.2. Lựa chọn điều kiện nhân nuôi sinh khối thích hợp chủng TB17 ở quy mô bình tam giác lên sinh trưởng và tích lũy axit béo
• 3.1.3. Nhân nuôi sinh khối ở các hệ thống lên men 5 và 10 Lít
• 3.1.4. Nhân nuôi sinh khối ở hệ thống lên men 30 Lít
• 3.1.5. Nhân nuôi sinh khối ở các hệ thống lên men 150 Lít
• 3.1.6. Các phương pháp nhân nuôi khác nhau để cung cấp sinh khối giàu axít béo ω 3 – 6
• 3.1.7. Thu hoạch sinh khối chủng S.
• 3.2. Tách chiết dầu sinh học giàu axit béo ω 3 - 6 từ SKK chủng TB17
• 3.2.1. Sản xuất dầu sinh học giàu axít béo ω 3 - 6 dạng FFA
• 3.2.2. Sản xuất dầu sinh học giàu axít béo ω 3 - 6 dạng methyl este
• 3.2.3. So sánh 2 phương pháp tách chiết dầu (dạng FFA và dạng methyl ester) từ sinh khối tươi và SKK
• 3.2.4. Sản xuất và đánh giá chất lượng dầu sinh học giàu axit béo ω 3 - 6 ở quy mô 100g SKK/mẻ
• 3.3. Các điều kiện bảo quản dầu, sản xuất viên nang mềm và đánh giá tính an toàn, tác dụng tăng cường trí nhớ, khả năng học tập của viên nang mềm AOO-3-6
• 3.3.1. Ảnh hưởng của các chất chống oxy hóa đến quá trình bảo quản dầu giàu các axit béo ω 3 - 6
• 3.3.2. Nghiên cứu sản xuất viên nang mềm algal oil omega 3 - 6 từ dầu sinh học giàu axit béo ω 3 – 6
• 3.3.3. Nghiên cứu tính an toàn và tác dụng tăng cường trí nhớ, khả năng học tập của viên dầu tảo AOO-3-6
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Giới thiệu về dầu sinh học và axit béo omega 3 omega 6

Dầu sinh học từ vi tảo, đặc biệt là từ chủng Schizochytrium mangrovei, đã trở thành một nguồn cung cấp quan trọng cho các axit béo omega 3 và omega 6. Các axit béo này đóng vai trò thiết yếu trong dinh dưỡng con người, giúp cải thiện sức khỏe tim mạch, hỗ trợ chức năng não bộ và có tác dụng chống viêm. Nghiên cứu cho thấy rằng việc bổ sung các axit béo này có thể giảm nguy cơ mắc các bệnh mãn tính như bệnh tim mạch và tiểu đường. Theo một nghiên cứu, việc tiêu thụ dầu sinh học giàu omega 3 có thể làm giảm mức cholesterol xấu trong cơ thể, từ đó cải thiện sức khỏe tim mạch.

1.1. Vai trò của omega 3 và omega 6 trong sức khỏe con người

Axit béo omega 3 và omega 6 là những thành phần quan trọng trong chế độ ăn uống hàng ngày. Chúng không chỉ giúp duy trì chức năng tế bào mà còn có tác dụng tích cực đến sức khỏe tâm thần. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng omega 3 có khả năng cải thiện trí nhớ và khả năng học tập, trong khi omega 6 cũng đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh các phản ứng viêm trong cơ thể. Việc bổ sung đầy đủ hai loại axit béo này từ các nguồn tự nhiên như dầu từ vi tảo có thể giúp cân bằng dinh dưỡng và nâng cao sức khỏe tổng thể.

II. Nguồn cung cấp và công nghệ sản xuất dầu sinh học từ vi tảo

Vi tảo Schizochytrium mangrovei là một trong những nguồn cung cấp dầu sinh học giàu axit béo omega 3 và omega 6. Công nghệ nuôi trồng vi tảo đã được phát triển để tối ưu hóa sản xuất sinh khối và hàm lượng lipid. Các nghiên cứu cho thấy rằng điều kiện nuôi trồng như nhiệt độ, độ mặn và nguồn dinh dưỡng có ảnh hưởng lớn đến năng suất và chất lượng dầu. Việc áp dụng công nghệ hiện đại trong nuôi trồng và thu hoạch vi tảo không chỉ giúp tăng hiệu suất sản xuất mà còn đảm bảo chất lượng dầu đạt tiêu chuẩn cao nhất cho sức khỏe con người.

2.1. Công nghệ tách chiết và tinh chế dầu từ vi tảo

Các phương pháp tách chiết dầu từ vi tảo bao gồm sử dụng dung môi hữu cơ, phương pháp thủy phân và các công nghệ hiện đại như siêu âm và enzym. Những phương pháp này giúp tối ưu hóa quá trình thu hồi lipid, đảm bảo giữ lại các axit béo thiết yếu như DHA và EPA. Nghiên cứu cho thấy rằng việc sử dụng công nghệ tách chiết tiên tiến không chỉ nâng cao hiệu suất thu hồi mà còn cải thiện chất lượng dầu, giúp sản phẩm cuối cùng an toàn và hiệu quả cho sức khỏe người tiêu dùng.

III. Tác dụng của dầu sinh học đối với sức khỏe con người

Dầu sinh học từ vi tảo không chỉ cung cấp các axit béo thiết yếu mà còn có tác dụng tích cực đến sức khỏe con người. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc tiêu thụ dầu sinh học giàu omega 3 có thể giúp cải thiện chức năng não bộ, tăng cường trí nhớ và khả năng học tập. Ngoài ra, dầu này còn có tác dụng chống viêm, giúp giảm nguy cơ mắc các bệnh mãn tính như bệnh tim mạch và tiểu đường. Việc bổ sung dầu sinh học vào chế độ ăn uống hàng ngày có thể mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe tổng thể.

3.1. Nghiên cứu về tác dụng của dầu sinh học đối với sức khỏe tim mạch

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng axit béo omega 3 có khả năng làm giảm mức cholesterol xấu và triglyceride trong máu, từ đó giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch. Việc tiêu thụ dầu sinh học từ vi tảo có thể giúp cải thiện sức khỏe tim mạch một cách hiệu quả. Một nghiên cứu gần đây cho thấy rằng những người tiêu thụ dầu sinh học thường xuyên có nguy cơ mắc bệnh tim mạch thấp hơn so với những người không sử dụng. Điều này cho thấy rằng dầu sinh học từ vi tảo không chỉ là nguồn dinh dưỡng mà còn là một biện pháp phòng ngừa bệnh tật.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ sinh học chuyên ngành Hóa sinh học (mã số: 9 42 01 16) của nghiên cứu sinh Lê Thị Thơm, với đề tài "Nghiên cứu dầu sinh học giàu axit béo omega 3 - 6 từ chủng vi tảo biển dị dưỡng Việt Nam Schizochytrium mangrovei TB17 để làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người", được hoàn thành năm 2021 tại Học viện Khoa học và Công nghệ thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam dưới sự hướng dẫn khoa học của GS. Đặng Diễm Hồng.

Về tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu, các axit béo không bão hòa đa nối đôi (PUFAs) nhóm omega-3 và omega-6 có mạch carbon dài (LC-PUFAs), đặc biệt là axit docosahexaenoic (DHA; C22:6 ω-3), axit eicosapentaenoic (EPA; C20:5 ω-3) và axit docosapentaenoic (DPA; C22:5), giữ vai trò thiết yếu đối với sức khỏe tim mạch, hoạt động hệ thần kinh và sự phát triển trí não. Nguồn cung cấp DHA và EPA truyền thống chủ yếu từ dầu cá biển có nhiều hạn chế: chất lượng phụ thuộc mùa vụ và ngư trường; nguy cơ tích tụ các hợp chất ô nhiễm biển như polychlorinated biphenyls (PCBs), dioxin và kim loại nặng; mùi tanh đặc trưng gây khó khăn khi sử dụng cho trẻ nhỏ; đồng thời thành phần axit béo trong mỡ cá phức tạp khiến chi phí tinh sạch tốn kém. Trong khi đó, việc nuôi trồng các loài vi tảo biển quang tự dưỡng truyền thống đòi hỏi diện tích mặt bằng lớn, chi phí đầu tư cao và tốc độ sinh trưởng phụ thuộc điều kiện thời tiết. Các chủng vi tảo biển dị dưỡng (VTBDD) thuộc chi Schizochytrium có tốc độ sinh trưởng nhanh trong điều kiện lên men kín, không phụ thuộc ánh sáng và có khả năng tích lũy lipit lên đến trên 50-70% trọng lượng sinh khối khô (SKK). Tại Việt Nam, nghiên cứu về chủng Schizochytrium sp. PQ6 trước đó cho thấy thành phần axit béo chỉ tập trung vào DHA và EPA, thiếu hụt hoặc không duy trì ổn định thành phần DPA ω-3 khi nâng quy mô nuôi cấy từ bình tam giác lên hệ thống lên men 5, 10 và 150 lít. Do đó, việc tìm kiếm chủng vi tảo bản địa có hàm lượng cân đối cả DHA, EPA và DPA ổn định qua các quy mô, đồng thời làm chủ công nghệ nhân nuôi, tách chiết, tinh sạch và chứng minh tính an toàn sinh học là khoảng trống khoa học cần giải quyết.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định gồm 3 nội dung:

1. Sàng lọc chủng/loài VTBDD và tối ưu điều kiện nhân nuôi sinh khối để thu được sinh khối giàu axit béo ω 3 - 6;
2. Tối ưu điều kiện tách chiết, tinh sạch và bảo quản dầu sinh học giàu axit béo ω 3 - 6 từ loài vi tảo biển dị dưỡng lựa chọn được;
3. Sản xuất viên nang dầu sinh học giàu axit béo ω 3 - 6 có tính an toàn cao và đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ, khả năng học tập của viên nang trên động vật thực nghiệm.

Đối tượng nghiên cứu của luận án là chủng vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium mangrovei TB17 phân lập tại vùng rừng ngập mặn Diêm Điền, tỉnh Thái Bình năm 2010 (được sàng lọc và so sánh với hai chủng Schizochytrium khác là TG11(6) và PQ6), cùng đối tượng động vật thực nghiệm gồm chuột cống trắng và chuột nhắt trắng. Phạm vi nghiên cứu về không gian và công nghệ bao gồm: hệ thống nuôi cấy phòng thí nghiệm đến hệ thống lên men bioreactor dung tích 1, 5, 10, 30 và 150 lít tại Phòng Công nghệ Tảo thuộc Viện Công nghệ sinh học; phân tích thành phần axit béo tại Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên; đánh giá kiểm nghiệm chất lượng dầu tại Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng; bao gói viên nang mềm tại Công ty Cổ phần Dược phẩm Novaco; đánh giá dược lý và độc tính tại Khoa Dược lý - Học viện Quân Y. Phạm vi thời gian nghiên cứu thực hiện gắn liền với đề tài cấp Bộ Công Thương giai đoạn 2013 - 2015 và được hoàn thiện bảo vệ năm 2021.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Tổng quan tài liệu của luận án đã hệ thống hóa các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước trên các hướng tiếp cận sau:

Về phân loại học và đặc tính sinh học của chi Schizochytrium, tác giả trích dẫn các dấu mốc từ khi Thraustochytrids được phát hiện năm 1934 với loài Thraustochytrium proliferum tại Woods Hole, Massachusetts. Vị trí phân loại của nhóm sinh vật này từng trải qua nhiều biến động: từ việc xếp vào lớp nấm Phycomycetes, chuyển sang Oomycetes, đến các nghiên cứu phân tử gen 5S và 18S rRNA của Cavalier-Smith và cộng sự (1994), Honda và cộng sự (1998) chứng minh tính chất đơn ngành Stramenopiles phân lập khỏi giới nấm. Các công trình của Adl và cộng sự (2005), Anderson và Cavalier-Smith (2012), Gomaa và cộng sự (2013), Beakes và cộng sự (2014) đã xác lập vị trí của chi Schizochytrium thuộc họ Thraustochytriaceae, lớp Labyrinthulea, ngành Sagenista, giới Heterokonts.

Về cơ chế sinh tổng hợp PUFAs ở vi tảo biển dị dưỡng, luận án điểm lại hai con đường chính được Qiu (2003), Meesapyodsuk và Qiu (2016), Zhu và cộng sự (2020) xác lập: con đường hiếu khí thông qua phức hợp enzym kéo dài chuỗi (elongase) và enzym khử bão hòa phụ thuộc oxy (Δ4-desaturase); và con đường kỵ khí polyketide synthase (PKS) không phụ thuộc oxy phân tử. Mối liên hệ chuyển hóa giữa terpenoid, squalene và DHA thông qua chất trung gian Acetyl-CoA được dẫn chứng theo Xie và cộng sự (2017).

Về công nghệ nhân nuôi sinh khối thraustochytrid, tác giả điểm luận các mô hình nuôi theo mẻ (batch), nuôi mẻ có bổ sung cơ chất (fed-batch) và nuôi liên tục (continuous) từ các công bố của Wen và cộng sự (2002), Huang và cộng sự (2012), Guo và cộng sự (2018), Patel và cộng sự (2021). Các nghiên cứu quốc tế đã ghi nhận sinh khối khô có thể đạt đến 171,5 g/L, hàm lượng tổng axit béo đạt 83,84% SKK, và năng suất DHA đạt trên 300 mg/L/giờ khi kiểm soát tối ưu nguồn carbon (glucose, glycerol, malate), tỷ lệ C/N và oxy hòa tan.

Về kỹ thuật tách chiết, tinh sạch và bảo quản PUFAs, tài liệu tổng quan phân tích các phương pháp phá vỡ tế bào và chiết dầu: phương pháp cơ học, enzyme, dung môi hóa học thông thường, chiết bằng sóng siêu âm, chuyển este hóa trực tiếp và chiết bằng chất lỏng CO2 siêu tới hạn (trích dẫn tổng hợp từ Wanasundara, 2011; Yves và cộng sự, 2016; Mu và cộng sự, 2016). Kỹ thuật làm giàu PUFAs được điểm qua các phương pháp: sắc ký cột bạc (AgTCM), sắc ký lỏng đảo dòng, chưng cất phân đoạn, kết tinh nhiệt độ thấp và phương pháp tạo phức với urea. Trong đó, phương pháp tạo phức urea dựa trên nguyên lý sai khác cấu trúc không gian giữa chuỗi bão hòa/đơn nối đôi và chuỗi đa nối đôi được Mendes và cộng sự (2007) áp dụng thành công trên vi tảo Crypthecodinium cohnii, nâng hàm lượng DHA lên 99,2% so với TFA. Cơ chế chống oxy hóa lipid bằng các chất phenolic tổng hợp (BHA, BHT, TBHQ) và tự nhiên (α-tocopherol/vitamin E) được trích dẫn theo Dunn (2005), Taghvaei và cộng sự (2015).

Về tính an toàn sinh học và dược lý, luận án trích dẫn các quyết định công nhận GRAS của Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) đối với dầu tảo từ Schizochytrium sp.; các thử nghiệm độc tính bán trường diễn 28 ngày và 90 ngày của Lewis và cộng sự (2016), Falk và cộng sự (2017); nghiên cứu của Kris-Etherton và cộng sự (2003) về liều dùng an toàn và hiệu quả hạ triglyceride máu.

Vị trí của luận án: Tại Việt Nam, nhóm nghiên cứu của Đặng Diễm Hồng và cộng sự (2007-2016) đã công bố sự hiện diện của họ Thraustochytriaceae tại rừng ngập mặn Cát Bà, Xuân Thủy, Phú Quốc; các nghiên cứu trước đây chủ yếu tập trung vào chủng Schizochytrium sp. PQ6 phục vụ nuôi trồng thủy sản, tách chiết squalene hoặc nhiên liệu sinh học. Luận án này định vị vào khoảng trống: sàng lọc tuyển chọn chủng bản địa S. mangrovei TB17 có tích lũy đồng thời DHA, EPA và DPA cao và ổn định; tối ưu hóa nuôi cấy mở rộng đến 150 lít; hoàn thiện quy trình công nghệ làm giàu PUFAs bằng phương pháp tạo phức urea dạng methyl este và axit béo tự do (FFA); hoàn thiện dạng bào chế viên nang mềm Algal oil omega-3-6 (AOO-3-6) và cung cấp bộ dữ liệu thực nghiệm hoàn chỉnh về độc tính cấp, độc tính bán trường diễn 90 ngày cùng tác dụng cải thiện trí nhớ trên động vật thí nghiệm.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án được thiết kế theo hướng tiếp cận thực nghiệm định lượng, kết hợp giữa công nghệ sinh học vi sinh, hóa sinh phân tích và dược lý học thực nghiệm.

Cơ sở lý thuyết và nguyên lý áp dụng

1. Sinh học vi tảo dị dưỡng: Schizochytrium mangrovei đồng hóa nguồn carbon hữu cơ (chủ yếu là glucose) và tích lũy triacylglycerol (TAG) dạng các thể cầu mỡ nội bào trong điều kiện cạn kiệt nguồn nitơ (tỷ lệ C/N cao).
2. Nguyên lý tạo phức urea: Urea kết tinh tạo mạng lưới tinh thể hình lục giác với các rãnh kênh có đường kính 8 - 12 Å. Các axit béo bão hòa (SFA) và không bão hòa một nối đôi (MUFA) có mạch thẳng dễ dàng đi vào rãnh kênh để tạo phức bao kết kết tinh dạng rắn ở nhiệt độ thấp. Các PUFAs mạch dài có nhiều liên kết đôi dạng cis (DHA 6 nối đôi, EPA 5 nối đôi, DPA 5 nối đôi) có cấu trúc không gian bị uốn cong, kích thước phân tử lớn hơn đường kính rãnh urea nên không tham gia tạo phức và nằm lại trong pha lỏng dung môi, cho phép tách chọn lọc bằng phương pháp lọc.
3. Cơ chế chống oxy hóa lipid: Sử dụng các chất có nhóm hydroxyl phenolic cho gốc hydro tự do nhằm cắt đứt phản ứng dây chuyền peroxy hóa lipid màng và axit béo chưa no trong quá trình bảo quản.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

[Chủng S. mangrovei TB17] 
[Thu hoạch sinh khối] (Ly tâm / Keo tụ Chitosan) -> [Sấy khô SKK]
[Dầu thô: Dạng FFA hoặc Dạng Methyl este]
[Dầu tinh sạch giàu PUFAs omega 3 - 6] 
[Đánh giá Độc tính (Cấp, Bán trường diễn 90 ngày) & Dược lý Trí nhớ (Mê lộ)]

Phương pháp nghiên cứu thực tế bao gồm:

• Phương pháp nhân nuôi và công nghệ lên men: Nuôi cấy khảo sát điều kiện sinh lý trên bình tam giác (nhiệt độ 20-35°C, độ mặn 0-35‰, pH 4,0-9,0, nguồn carbon, nồng độ glucose 10-90 g/L, nguồn nitơ, nồng độ cao nấm men 5-30 g/L). Nuôi cấy trong các hệ thống lên men tự động kiểm soát nhiệt độ, tốc độ khuấy, sục khí dung tích 1 L, 5 L, 10 L, 30 L và 150 L bằng hai phương pháp nuôi theo mẻ và nuôi theo mẻ có bổ sung cơ chất (fed-batch). Sử dụng môi trường M12 và P1, khảo sát thay thế cao nấm men tinh khiết (CNMTK) bằng cao nấm men công nghiệp (CNMCN).
• Phương pháp thu hoạch sinh khối: So sánh giữa phương pháp ly tâm và phương pháp keo tụ hóa học sử dụng polymer sinh học chitosan ở các dải nồng độ khác nhau.
• Phương pháp hóa lý và phân tích thành phần lipit: Phá vỡ tế bào và chiết lipit tổng số bằng các hệ dung môi hữu cơ (n-hexane, ethanol, chloroform/methanol); khảo sát sấy sinh khối (sấy đối lưu, sấy thăng hoa, sấy đông khô). Thủy phân kiềm (xà phòng hóa bằng dung dịch NaOH/ethanol) để điều chế axit béo tự do (FFA) và chuyển este hóa trực tiếp bằng xúc tác kiềm hoặc axit để điều chế dạng methyl este. Tinh sạch làm giàu PUFAs bằng phương pháp tạo phức urea với các biến số: tỷ lệ cơ chất/urea, tỷ lệ urea/dung môi (ethanol hoặc methanol), nhiệt độ kết tinh (từ nhiệt độ phòng đến -20°C).
• Phương pháp phân tích kiểm nghiệm: Xác định mật độ tế bào (MĐTB) bằng buồng đếm hồng cầu Neubauer; xác định khối lượng sinh khối khô (SKK) bằng phương pháp sấy khô đến khối lượng không đổi; định lượng glucose dư bằng phương pháp DNS; phân tích định tính và định lượng thành phần methyl este của các axit béo bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS) và GC-FID. Đánh giá các chỉ số hóa lý của dầu: chỉ số axit, chỉ số iod, chỉ số xà phòng hóa, chỉ số peroxide theo tiêu chuẩn TCVN và Dược điển.
• Phương pháp bảo quản: Đánh giá sự biến thiên chỉ số peroxide của dầu dưới tác động của các chất chống oxy hóa BHA, BHT, TBHQ, hỗn hợp ba chất (tỷ lệ 1:1:1) và vitamin E (α-tocopherol) ở các nồng độ và khoảng thời gian lưu giữ.
• Phương pháp dược lý và độc tính thực nghiệm:
  • Độc tính cấp: Thử nghiệm trên chuột nhắt trắng uống liều tối đa không gây chết để xác định LD50 theo phương pháp Litchfield - Wilcoxon.
  • Độc tính bán trường diễn (90 ngày): Thử nghiệm trên chuột cống trắng uống liều thử nghiệm liên tục 90 ngày. Đánh giá sự biến đổi trọng lượng cơ thể (lô n = 10); các chỉ số huyết học (hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, n = 8); các chỉ số sinh hóa máu gồm creatinin, AST, ALT, albumin huyết tương và cholesterol toàn phần (n = 8); giải phẫu đánh giá biến đổi đại thể và hình ảnh vi thể mô bệnh học của gan, thận, lách nhuộm HE độ phóng đại x400.
  • Tác dụng dược lý trên thần kinh: Đánh giá khả năng cải thiện trí nhớ và khả năng học tập bằng mô hình mê lộ có thưởng thức ăn; xác định tốc độ hình thành phản xạ có điều kiện và tốc độ dập tắt phản xạ có điều kiện của các lô chuột thực nghiệm (n = 8).

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Tổng quan tài liệu

Chương này gồm 34 trang, tập trung tổng hợp cơ sở lý luận và thực tiễn về axit béo không bão hòa đa nối đôi và tiềm năng khai thác từ vi tảo biển dị dưỡng. Nội dung chương trình bày chi tiết về cấu trúc phân tử, danh pháp và cấu hình đồng phân cis/trans của DHA (C22:6 ω-3), EPA (C20:5 ω-3) và DPA (C22:5 ω-3 và ω-6). Chương phân tích sâu vai trò sinh học của LC-PUFAs đối với việc hình thành màng nơ-ron thần kinh, cải thiện nhận thức, giảm triglyceride máu, ngăn chặn hình thành xơ vữa động mạch và ứng dụng trong thức ăn thủy sản cũng như chăn nuôi. Chương 1 phân tích vị trí phân loại học của chi Schizochytrium trong lớp Labyrinthulea, làm rõ hai con đường sinh tổng hợp PUFAs (con đường hiếu khí qua desaturase/elongase và con đường kỵ khí qua enzym PKS). Tác giả so sánh các chiến lược lên men (mẻ, fed-batch, liên tục), tổng kết các công nghệ phá vỡ tế bào, chiết xuất và tinh sạch axit béo (sắc ký, chưng cất, kết tinh nhiệt độ thấp, tạo phức urea), đồng thời tổng hợp các tài liệu quốc tế về thử nghiệm an toàn, liều lượng sử dụng và thực trạng nghiên cứu khai thác Thraustochytrids tại Việt Nam.

Chương 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương này gồm 21 trang, mô tả nguồn gốc vật liệu, thiết bị và chi tiết các quy trình bố trí thí nghiệm:

• Chủng giống: Chủng vi tảo Schizochytrium mangrovei TB17 phân lập tại Thái Bình, lưu giữ tại Phòng Công nghệ Tảo; hai chủng đối chứng so sánh là S. mangrovei TG11(6) và Schizochytrium sp. PQ6.
• Môi trường và điều kiện lên men: Môi trường M12 (thành phần gồm glucose, cao nấm men, muối biển nhân tạo) và môi trường P1. Hệ thống thiết bị lên men từ bình tam giác lắc 250 mL, 1 L đến bioreactor 5 L, 10 L, 30 L (hãng B. Braun/Bioflo) và hệ thống lên men 150 L.
• Thiết kế thí nghiệm: Quy trình khảo sát từng yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng tế bào và tích lũy lipit (nhiệt độ, độ mặn, nguồn C, nồng độ glucose, nguồn N, pH, mật độ cấy ban đầu). Quy trình thu hoạch bằng keo tụ chitosan.
• Quy trình công nghệ tách chiết và làm giàu: Bố trí thí nghiệm tối ưu phương pháp sấy sinh khối, dung môi chiết, nhiệt độ, thời gian và tốc độ khuấy phản ứng. Tối ưu phản ứng thủy phân kiềm (nồng độ NaOH, nhiệt độ, thời gian) và phản ứng chuyển este hóa. Quy trình kết tinh tạo phức urea làm giàu PUFAs ở dạng FFA và methyl este.
• Bào chế và kiểm nghiệm: Phương pháp phối trộn chất chống oxy hóa, quy trình bao viên nang mềm thực phẩm chức năng AOO-3-6 tại dây chuyền đạt chuẩn GMP của Công ty Novaco.
• Quy trình đánh giá an toàn và tác dụng dược lý: Mô hình động vật chuột cống trắng và chuột nhắt trắng tại Học viện Quân Y. Các quy trình xét nghiệm huyết học, sinh hóa lâm sàng, cắt lát mô bệnh học HE và thử nghiệm hành vi tìm thức ăn trong mô hình mê lộ hình chữ nhật. Quy trình xử lý số liệu thống kê (tính giá trị trung bình x̄ ± SD, phân tích sai khác ý nghĩa bằng ANOVA).

Chương 3. Kết quả và thảo luận

Chương này gồm 65 trang, được chia thành 3 phần chính với các số liệu thực nghiệm trọng tâm:

3.1. Sàng lọc chủng/loài tiềm năng và lựa chọn điều kiện nhân nuôi sinh khối thích hợp ở các quy mô khác nhau

Kết quả so sánh 3 chủng vi tảo sau 144 giờ nuôi cấy trong bình tam giác 250 mL cho thấy chủng TB17 vượt trội về sự cân đối axit béo:

Chỉ tiêu theo dõi	Chủng TG11(6)	Chủng TB17	Chủng PQ6
Mật độ tế bào ($10^6$ tế bào/mL)	$82,33 \pm 1,53$	$95,67 \pm 2,08$	$88,00 \pm 1,00$
Sinh khối khô (g/L)	$15,12 \pm 0,35$	$18,45 \pm 0,42$	$16,80 \pm 0,28$
Hàm lượng lipit tổng số (% SKK)	$48,25 \pm 1,12$	$56,70 \pm 1,35$	$52,10 \pm 0,95$
Hàm lượng DHA (% so với TFA)	$35,12 \pm 1,20$	$42,68 \pm 1,76$	$43,58 \pm 1,45$
Hàm lượng DPA (% so với TFA)	$7,85 \pm 0,55$	$11,02 \pm 1,14$	$0,00 \pm 0,00$
Hàm lượng EPA (% so với TFA)	$0,55 \pm 0,08$	$0,82 \pm 0,11$	$0,75 \pm 0,09$

Chủng TB17 được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo vì vừa có sinh khối và hàm lượng lipit cao, vừa chứa đồng thời DHA (42,68%) và DPA (11,02% TFA), khắc phục hoàn toàn nhược điểm thiếu DPA của chủng PQ6.

Khảo sát điều kiện sinh lý tối ưu cho chủng TB17 tại quy mô bình tam giác xác định được: nhiệt độ thích hợp là 28°C; độ mặn 15‰; nguồn carbon tốt nhất là glucose ở nồng độ 60 g/L; nguồn nitơ tối ưu là cao nấm men ở nồng độ 20 g/L; pH môi trường khởi đầu là 6,5 - 7,0; mật độ tế bào cấy ban đầu thích hợp là $1,5 - 2,0 \times 10^6$ tế bào/mL.

Khi nâng quy mô lên các hệ thống bioreactor:

• Tại hệ thống 5 L và 10 L: Sinh khối khô đạt từ 22,5 đến 25,8 g/L; hàm lượng lipit duy trì 58 - 61% SKK.
• Tại hệ thống 30 L: Nghiên cứu sinh đã thử nghiệm thành công việc thay thế cao nấm men tinh khiết (CNMTK) bằng cao nấm men công nghiệp (CNMCN) để hạ giá thành sản xuất. Trong môi trường M12 sử dụng CNMCN, chủng TB17 đạt mật độ tế bào $128,42 \pm 0,27 \times 10^6$ tế bào/mL, sinh khối khô đạt $30,83 \pm 0,25$ g/L, hàm lượng lipit đạt $65,96 \pm 0,31$% SKK, tổng hàm lượng axit béo ω 3 - 6 đạt $47,35 \pm 1,39$% so với TFA, năng suất tạo DHA đạt $40,17 \pm 1,75$ mg/L/giờ.
• So sánh phương pháp nuôi cấy: Nuôi cấy theo mẻ có bổ sung cơ chất (fed-batch) cho hiệu quả tích lũy sinh khối và lipit cao hơn phương pháp nuôi mẻ thông thường, hạn chế sự ức chế do nồng độ đường ban đầu quá cao.
• Quy mô 150 L: Thử nghiệm thành công khẳng định khả năng phát triển của chủng TB17 ở quy mô bán công nghiệp, sinh khối khô đạt trên 28 g/L sau 120 giờ nuôi.
• Thu hoạch sinh khối: Nghiên cứu chỉ ra việc sử dụng chất keo tụ sinh học chitosan ở nồng độ thích hợp cho phép lắng thu hồi trên 95% tế bào tảo, môi trường trong suốt sau thu hoạch, giảm chi phí năng lượng so với ly tâm trực tiếp toàn bộ thể tích dịch nuôi lớn.

3.2. Tách chiết dầu sinh học giàu axit béo ω 3 - 6 từ sinh khối khô chủng TB17

Nghiên cứu sinh khảo sát có hệ thống các yếu tố công nghệ tách chiết và làm giàu:

• Xử lý sinh khối và chiết xuất: Phương pháp sấy đông khô và sấy thăng hoa bảo toàn tốt nhất cấu trúc axit béo chưa no so với sấy nhiệt thông thường. Dung môi tối ưu để chiết lipit từ SKK là n-hexane hoặc ethanol ở tỷ lệ dung môi/sinh khối thích hợp, nhiệt độ chiết 60°C trong 90 - 120 phút kết hợp khuấy trộn.
• Thủy phân xà phòng hóa điều chế FFA: Phản ứng xà phòng hóa dầu thô đạt hiệu suất cao nhất khi sử dụng dung dịch NaOH trong ethanol ở nhiệt độ 65°C trong 120 phút.
• Chuyển este hóa trực tiếp điều chế dạng methyl este: Tối ưu hóa phản ứng sử dụng xúc tác axit ($H_2SO_4$) hoặc bazơ kết hợp methanol cho hiệu suất chuyển hóa thành axit béo methyl este (FAME) đạt trên 90%.
• Làm giàu bằng phương pháp tạo phức với urea:
  • Đối với hỗn hợp axit béo tự do (FFA): Tỷ lệ FFA:urea tối ưu là 1:3 đến 1:3,5 (w/w); tỷ lệ urea:ethanol là 1:4 đến 1:5; nhiệt độ kết tinh tối ưu ở -10°C đến -15°C.
  • Đối với hỗn hợp dạng methyl este: Tỷ lệ methyl este:urea là 1:3; tỷ lệ urea:methanol là 1:4; nhiệt độ kết tinh tại 4°C đến -5°C.
• Hiệu quả làm giàu: Sau quá trình tạo phức với urea, các axit béo bão hòa như C14:0, C16:0 kết tinh hoàn toàn trong pha rắn. Pha lỏng thu hồi chứa hàm lượng PUFAs rất cao: tổng hàm lượng các axit béo ω 3 - 6 chủ đạo (DHA, EPA, DPA) từ mức ban đầu ~47% tăng vọt lên $86,33 \pm 2,34$% so với TFA. Độ tinh sạch tổng số của toàn bộ phân đoạn axit béo chưa no trong dầu tinh chế đạt $99,46 \pm 2,66$% so với TFA.
• Luận án đã chuẩn hóa và vận hành ổn định quy trình tách chiết và làm giàu ở quy mô 100 g SKK/mẻ, tạo tiền đề nguyên liệu cho bào chế.

3.3. Bảo quản dầu, sản xuất viên nang mềm và đánh giá tính an toàn, tác dụng dược lý của viên AOO-3-6

• Bảo quản chống oxy hóa: Thử nghiệm chỉ ra việc bổ sung vitamin E (α-tocopherol) ở nồng độ 0,0075% giúp kiểm soát chỉ số peroxide của dầu ở mức thấp và ổn định qua thời gian bảo quản, vượt trội hơn về độ an toàn thực phẩm so với việc dùng các chất chống oxy hóa tổng hợp BHA, BHT hay TBHQ đơn lẻ.
• Bào chế viên nang mềm: Phối hợp với Công ty CP Dược phẩm Novaco đóng nang mềm Algal oil omega 3 - 6 (ký hiệu AOO-3-6). Kiểm tra chất lượng thành phẩm viên nang mềm cho thấy sản phẩm đạt toàn diện các chỉ tiêu cảm quan (viên nang mềm màu vàng sáng, không có mùi lạ), chỉ tiêu lý hóa (chỉ số axit < 3 mg KOH/g, chỉ số peroxide < 5 meq/kg), đạt độ đồng đều khối lượng theo quy định của Dược điển, đồng thời không phát hiện vi sinh vật gây bệnh (Samonella, E. coli, P. aeruginosa, S. aureus) và hàm lượng kim loại nặng (Pb, As, Cd, Hg) đều nằm dưới ngưỡng cho phép của Bộ Y tế đối với thực phẩm chức năng.
• Đánh giá tính an toàn (độc tính):
  • Độc tính cấp: Cho chuột nhắt trắng uống viên dầu tảo AOO-3-6 ở mức liều cao nhất có thể cho uống qua đường tiêu hóa không ghi nhận chuột chết, không xác định được trị số LD50, chứng minh sản phẩm có độ an toàn cấp tính cao.
  • Độc tính bán trường diễn 90 ngày: Chuột cống trắng được cho uống viên dầu tảo AOO-3-6 liều liên tục trong 90 ngày:
    • Trọng lượng cơ thể chuột ở các lô thử nghiệm (TN1, TN2) tăng trưởng bình thường, không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô đối chứng (ĐC) ($p > 0,05$, với $n = 10$).
    • Các chỉ số huyết học lâm sàng (số lượng hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, nồng độ huyết sắc tố) ở lô uống dầu tảo ổn định, tương đương lô đối chứng ($n = 8$).
    • Các chỉ số đánh giá chức năng gan (hoạt độ enzym AST, ALT, nồng độ albumin huyết tương) và chỉ số chức năng thận (nồng độ creatinin huyết thanh) ở chuột các lô thí nghiệm duy trì trong giới hạn sinh lý bình thường ($n = 8$), không gây độc tính trên gan, thận. Chỉ số cholesterol toàn phần có xu hướng được kiểm soát ổn định.
    • Hình thái giải phẫu đại thể gan, thận, lách ở các lô chuột uống AOO-3-6 không có biến đổi bệnh lý. Quan sát lát cắt mô bệnh học vi thể (nhuộm HE, độ phóng đại x400) cho thấy cấu trúc vi thể mô gan (tiểu thùy gan, tĩnh mạch trung tâm, bè tế bào gan), mô thận (cầu thận, ống lượn) và mô lách hoàn toàn nguyên vẹn, không có hiện tượng hoại tử, thoái hóa tế bào hay thâm nhiễm viêm.
• Đánh giá tác dụng tăng cường trí nhớ và khả năng học tập:
  • Thử nghiệm trên mô hình mê lộ tìm thức ăn ở chuột cống trắng ($n = 8$): Lô chuột được uống viên dầu tảo AOO-3-6 có tốc độ hình thành phản xạ có điều kiện tìm đường đến hộp thức ăn nhanh hơn rõ rệt (số lần chạy sai giảm có ý nghĩa thống kê, thời gian hoàn thành bài kiểm tra ngắn hơn) so với lô chuột đối chứng.
  • Khi ngừng củng cố thức ăn để đánh giá khả năng duy trì trí nhớ, tốc độ dập tắt phản xạ có điều kiện ở lô chuột uống AOO-3-6 diễn ra chậm hơn đáng kể so với lô đối chứng ($p < 0,05$), chứng minh lượng DHA và DPA hấp thu từ viên nang AOO-3-6 đã góp phần cải thiện khả năng ghi nhớ không gian và lưu giữ phản xạ thần kinh trên động vật thực nghiệm.

Kết quả và những đóng góp mới

Luận án đã công bố những đóng góp mới về mặt lý luận khoa học và thực tiễn công nghệ:

Đóng góp về lý luận và khoa học

• Cung cấp dẫn liệu khoa học có hệ thống về đặc điểm sinh học, động học sinh trưởng và con đường tích lũy lipid giàu LC-PUFAs của chủng vi tảo biển dị dưỡng bản địa Schizochytrium mangrovei TB17 phân lập tại vùng rừng ngập mặn Diêm Điền, Thái Bình.
• Xác định được chủng TB17 có đặc tính sinh tổng hợp vượt trội so với các chủng thraustochytrid khác đã nghiên cứu ở Việt Nam: chứa hàm lượng DHA cao ($42,68 \pm 1,76$% TFA) và đồng thời tích lũy ổn định DPA ($11,02 \pm 1,14$% TFA) qua tất cả các cấp độ nhân nuôi.
• Làm sáng tỏ cơ chế và các thông số động học của phản ứng tạo phức urea trong việc phân tách chọn lọc các phân tử axit béo no/đơn nối đôi khỏi hỗn hợp PUFAs từ lipit vi tảo biển dị dưỡng, đạt độ tinh khiết omega 3 - 6 lên đến $86,33 \pm 2,34$% TFA và độ tinh sạch dầu đạt $99,46 \pm 2,66$% TFA.
• Cung cấp bộ dữ liệu thực nghiệm hoàn chỉnh chứng minh tính an toàn sinh học (không độc tính cấp, không gây biến đổi huyết học, chức năng gan thận và mô bệnh học sau 90 ngày) và tác dụng cải thiện trí nhớ, tăng tốc độ hình thành phản xạ có điều kiện trên mô hình mê lộ động vật thực nghiệm của dầu tảo S. mangrovei TB17.

Đóng góp về mặt thực tiễn và giải pháp công nghệ

• Hoàn thiện quy trình công nghệ nhân nuôi sinh khối chủng TB17 ở quy mô bioreactor 30 L sử dụng cao nấm men công nghiệp (giảm chi phí cơ chất đầu vào) đạt mật độ tế bào $128,42 \pm 0,27 \times 10^6$ tế bào/mL, SKK đạt $30,83 \pm 0,25$ g/L, hàm lượng lipit đạt $65,96 \pm 0,31$% SKK, năng suất DHA đạt $40,17 \pm 1,75$ mg/L/giờ; thử nghiệm thành công ở quy mô lên men 150 L.
• Xác lập giải pháp thu hoạch sinh khối bằng keo tụ polymer tự nhiên chitosan, thay thế việc ly tâm trực tiếp tốn kém năng lượng.
• Xây dựng thành công quy trình công nghệ làm giàu PUFAs quy mô 100 g SKK/mẻ và giải pháp chống oxy hóa bằng vitamin E 0,0075%.
• Chế tạo thành công viên nang mềm Algal oil omega 3 - 6 (AOO-3-6) đạt tiêu chuẩn chất lượng theo Dược điển, đáp ứng các tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm, sẵn sàng làm nguồn nguyên liệu thay thế dầu cá trong sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Căn cứ vào phạm vi và nội dung trình bày trong văn bản luận án, các hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp được xác định:

• Hạn chế: Thử nghiệm nuôi cấy bioreactor ở quy mô 150 Lít mới dừng ở mức độ thử nghiệm bước đầu theo mẻ, chưa thực hiện tối ưu hóa sâu phương thức nuôi fed-batch liên tục kéo dài ở quy mô này; quy trình tách chiết và làm giàu bằng phức urea được chuẩn hóa ở quy mô 100 g SKK/mẻ trong phòng thí nghiệm; các thử nghiệm dược lý tăng cường trí nhớ mới tiến hành trên động vật thực nghiệm (chuột), chưa triển khai thử nghiệm lâm sàng trên người.
• Hướng nghiên cứu tiếp: Tối ưu hóa chế độ cấp dịch tự động (fed-batch) ở quy mô bioreactor 150 Lít và lớn hơn nhằm nâng cao hơn nữa mật độ tế bào và sản lượng DHA/L/giờ; hoàn thiện dây chuyền thiết bị tách chiết, thu hồi dung môi và làm giàu PUFA liên tục ở quy mô pilot công nghiệp; triển khai nghiên cứu độc tính di truyền và các bước thử nghiệm lâm sàng viên nang AOO-3-6 trên người tình nguyện.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo có giá trị chuyên môn cao cho các nhóm đối tượng và lĩnh vực sau:

1. Nghiên cứu sinh và học viên cao học ngành Công nghệ sinh học, Hóa sinh học, Vi sinh vật học: Có thể tham khảo phương pháp luận sàng lọc vi tảo biển dị dưỡng, các kỹ thuật tối ưu hóa thông số lên men chìm, động học tích lũy lipid nội bào và kỹ thuật phân tích GC-MS/FID lipid.
2. Kỹ sư công nghệ thực phẩm và công nghệ hóa dược: Quy trình công nghệ thủy phân, phản ứng xà phòng hóa, chuyển este hóa và đặc biệt là bảng thông số tối ưu tạo phức urea (tỷ lệ cơ chất, dung môi, nhiệt độ kết tinh) là cơ sở kỹ thuật trực tiếp để làm giàu các axit béo chưa no mạch dài từ dầu thô.
3. Các nhà nghiên cứu dược lý và kiểm nghiệm thuốc: Tham khảo thiết kế thí nghiệm đánh giá độc tính bán trường diễn 90 ngày (huyết học, sinh hóa máu, kỹ thuật mô bệnh học vi thể gan thận) và mô hình mê lộ đánh giá phản xạ thần kinh trên động vật gặm nhấm.
4. Doanh nghiệp sản xuất thực phẩm chức năng và thức ăn thủy sản: Quy trình nuôi cấy bằng cao nấm men công nghiệp và công thức bào chế viên nang mềm AOO-3-6 cung cấp luận cứ kinh tế - kỹ thuật tin cậy để đầu tư sản xuất nguồn omega 3 - 6 nội địa thay thế nguồn dầu cá nhập khẩu.

Câu hỏi thường gặp

1. Điểm khác biệt cốt lõi về thành phần axit béo giữa chủng vi tảo Schizochytrium mangrovei TB17 và chủng Schizochytrium sp. PQ6 đã nghiên cứu trước đây là gì?
Chủng PQ6 chỉ tích lũy chủ yếu DHA (43,58% TFA) và EPA (0,75% TFA), hoàn toàn thiếu hụt axit béo DPA ω-3 khi mở rộng quy mô nuôi cấy. Ngược lại, chủng bản địa S. mangrovei TB17 tích lũy đồng thời cả DHA ($42,68 \pm 1,76$% TFA), EPA ($0,82 \pm 0,11$% TFA) và DPA ($11,02 \pm 1,14$% TFA), với tỷ lệ các axit béo này duy trì ổn định qua tất cả các cấp độ nhân nuôi từ bình tam giác đến bioreactor 150 lít.

2. Kết quả nuôi cấy chủng TB17 tại hệ thống bioreactor 30 Lít đạt các thông số sinh khối và lipit cụ thể nào khi sử dụng cao nấm men công nghiệp?
Trong hệ thống lên men 30 Lít với môi trường M12 sử dụng cao nấm men công nghiệp (CNMCN), chủng TB17 đạt mật độ tế bào $128,42 \pm 0,27 \times 10^6$ tế bào/mL, khối lượng sinh khối khô đạt $30,83 \pm 0,25$ g/L, hàm lượng lipit đạt $65,96 \pm 0,31$% SKK, tổng hàm lượng axit béo ω 3 - 6 đạt $47,35 \pm 1,39$% so với TFA và năng suất tạo DHA đạt $40,17 \pm 1,75$ mg/L/giờ.

3. Hiệu quả làm giàu axit béo omega 3 - 6 của phương pháp tạo phức với urea đạt mức độ nào?
Phương pháp tạo phức với urea đã loại bỏ triệt để các axit béo bão hòa (C14:0, C16:0) vào pha rắn. Trong pha lỏng thu hồi, tổng hàm lượng các axit béo ω 3 - 6 thiết yếu (DHA, EPA, DPA) được nâng từ mức ~47% ban đầu lên $86,33 \pm 2,34$% so với TFA; độ tinh sạch tổng số của toàn bộ phân đoạn axit béo chưa no trong sản phẩm dầu đạt $99,46 \pm 2,66$% so với TFA.

4. Dữ liệu thử nghiệm độc tính bán trường diễn 90 ngày của viên nang AOO-3-6 trên chuột cống trắng cho thấy điều gì?
Thử nghiệm 90 ngày cho thấy chuột cống trắng uống viên AOO-3-6 tăng trọng bình thường ($p > 0,05$, $n = 10$). Các chỉ số huyết học (hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu), nồng độ creatinin huyết thanh và hoạt độ enzym gan AST, ALT đều duy trì trong giới hạn sinh lý bình thường ($n = 8$). Quan sát đại thể và lát cắt vi thể mô bệnh học (nhuộm HE, x400) xác nhận gan, thận, lách không có tổn thương, hoại tử hay biến đổi cấu trúc tế bào.

5. Viên nang dầu tảo AOO-3-6 tác động như thế nào đến khả năng ghi nhớ và học tập của chuột trong thử nghiệm mô hình mê lộ?
Chuột cống trắng uống viên AOO-3-6 ($n = 8$) có tốc độ hình thành phản xạ có điều kiện tìm thức ăn trong mê lộ nhanh hơn rõ rệt (rút ngắn thời gian di chuyển và giảm số lần vào ngõ cụt sai) so với lô đối chứng; đồng thời, tốc độ dập tắt phản xạ có điều kiện khi không còn mồi thưởng diễn ra chậm hơn có ý nghĩa thống kê ($p < 0,05$), chứng minh tác dụng cải thiện trí nhớ không gian và khả năng lưu giữ phản xạ của sản phẩm.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Lê Thị Thơm đã thực hiện một công trình nghiên cứu thực nghiệm trọn vẹn từ khâu phân lập, sàng lọc chủng vi tảo bản địa Schizochytrium mangrovei TB17 đến việc tối ưu hóa công nghệ lên men ở các quy mô từ phòng thí nghiệm đến bioreactor 150 lít. Tác giả đã hoàn thiện quy trình công nghệ làm giàu PUFAs đạt độ tinh khiết cao bằng phương pháp tạo phức urea, giải quyết được giải pháp bảo quản chống oxy hóa bằng vitamin E và bào chế thành công viên nang mềm Algal oil omega-3-6 (AOO-3-6). Kết quả thử nghiệm trên động vật thực nghiệm đã cung cấp đầy đủ luận cứ khoa học về tính an toàn sinh học và hiệu quả tăng cường trí nhớ của sản phẩm, khẳng định giá trị ứng dụng của nguồn sinh khối vi tảo biển dị dưỡng Việt Nam trong sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe con người.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Giới thiệu chung về axit béo, vai trò, nguồn gốc và con đường sinh tổng hợp axít béo Các axít béo ω 3 - 6 có nhiều chức năng sinh học như: cải thiện hiệu quả bệnh tim mạch; giảm nguy cơ loạn nhịp tim (có thể dẫn tới đột tử); có hiệu quả rõ rệt trong điều trị suy nhược; giảm nguy cơ hình thành khối u tuyến tiền liệt (có thể dẫn đến đau tim và đột quỵ); làm chậm tốc độ tăng trưởng của mảng xơ vữa động mạch; cải thiện chức năng nội mô; hạ huyết áp (nhẹ) và giảm phản ứng viêm. Chính những đặc điểm trên mà các axít béo ω 3 - 6 ngày càng được ứng dụng trong thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người. Do vậy, những đặc điểm chính về axít béo ω 3 - 6 sẽ được trình bày khái quát dưới đây.

Giới thiệu chung về axit béo Axít béo có công thức tổng quát: CH3-(CH2)n-COOH. PUFAs là các axít béo mạch dài (18 - 22 nguyên tử cacbon) có chứa hai hoặc nhiều hơn các liên kết đôi. Mạch hydrocarbon có 2 đầu: một đầu là nhóm methyl và một đầu là nhóm cacboxyl. Chúng được phân loại theo vị trí của liên kết đôi đầu tiên tính từ gốc methyl hay gốc cacboxyl.

Để chỉ vị trí nối đôi đầu tiên trên mạch cacbon được tính từ đầu methyl người ta có thể sử dụng ký hiệu “n” hoặc “ω”. Các liên kết đôi trong PUFAs cũng có thể được tính từ gốc carboxyl và được ký hiệu “Δ”. Những nhóm ω-3, ω-6 hay ω-9 PUFAs có liên kết đôi đầu tiên tương ứng tại vị trí cacbon số 3, 6 hay 9 tính từ gốc methyl [1]. Mạch cacbon của axít béo no thường có dạng zíc zắc, kéo thành chuỗi dài không cong.

Các axít béo không no, có một liên kết đôi dạng cis thì mạch cacbon bị uốn cong 30°, càng có nhiều liên kết đôi, mạch cacbon càng bị uốn cong nhiều hơn. Có giả thiết cho rằng mạch cacbon của axít béo không no dạng cis có ý nghĩa quan trọng đối với màng sinh học. Theo nghiên cứu của Kelter và cộng sự (1999) [2] cho thấy các phân tử không thể chuyển từ dạng cis- sang dạng trans- hoặc ngược lại trong trường hợp bình thường. Kiểu đồng phân cis- hoặc trans- là nguyên nhân dẫn đến tính chất khác nhau của các axít béo.

Vị trí của các nối đôi trong chuỗi cacbon của PUFAs tạo nên một sự khác biệt lớn trong việc cơ thể con người chuyển hóa chúng. Các tế bào của cơ thể con người chỉ có thể tạo nối đôi C = C tổng hợp axít béo kể từ cacbon thứ 9 trở đi. Điều này có nghĩa là con người không thể tự tổng hợp được axít béo ω - 3 và ω - 6. Do đó hai loại axít béo này chỉ có thể được lấy qua chế độ ăn uống hàng ngày [3].

Hoạt 5 tính sinh học của các axít béo phụ thuộc vào các dạng cấu trúc hóa học đặc trưng của chúng. Axít béo có một số dạng cấu trúc chính như ethyl este (EE), axít béo tự do (free fatty acid - FFA) và triacylglycerols (TAGs). Một số nghiên cứu đã chứng minh rằng các axít béo dạng EE có hoạt tính sinh học thấp hơn so với dạng FFA và TAG [4]. Sự hấp thụ EPA ở dạng triglycerid là 90% trong khi ở dạng ethyl ester chỉ là 60% [5].

Có hai nhóm axít béo không thay thế quan trọng là ω - 3 và ω - 6. Các axít béo ω - 3 quan trọng nhất là: ALA (C18:3), EPA, DHA, DPA. Các axít béo ω - 6 chính là: axit linoleic (LA; C18:2 ω-6), gama linoleic (GLA - C18:3), eicosadienoic, dihomo-gamma-linoleic (DGLA), ARA (C20:4), DPA [6].