Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu
Chi sắn dây (Pueraria), đặc biệt là hai loài Pueraria lobata (sắn dây thông thường) và Pueraria mirifica (sắn dây củ tròn hay sâm tố nữ), là các loài thực vật có lịch sử ứng dụng lâu đời trong y học cổ truyền và đời sống thực tiễn tại nhiều quốc gia châu Á. Các bộ phận của cây, đặc biệt là phần rễ củ, tích lũy hàm lượng rất cao các hợp chất chuyển hóa thứ cấp nhóm polyphenol, trong đó (iso)flavonoid là nhóm hoạt chất chủ đạo mang lại nhiều giá trị dược lý như chống oxy hóa, kháng đột biến, ức chế tăng sinh tế bào khối u và thể hiện hoạt tính tương tự estrogen (phytoestrogen).
Trong con đường sinh tổng hợp (iso)flavonoid, chalcone synthase (CHS) giữ vai trò là enzyme đầu tiên và mang tính quyết định ("người gác cổng" - gatekeeper), xúc tác cho phản ứng ngưng tụ tuần tự giữa một phân tử p-coumaroyl-CoA với ba phân tử malonyl-CoA để tạo nên bộ khung chalcone cơ bản. Mặc dù cấu trúc và chức năng của gen CHS đã được khảo sát trên một số loài thực vật họ Đậu trên thế giới, nhưng tại Việt Nam, các dữ liệu sinh học phân tử về trình tự gen CHS cũng như đặc tính cấu trúc enzyme tương ứng của hai loài Pueraria lobata và Pueraria mirifica phân bố bản địa còn rất hạn chế.
Đề tài khóa luận tốt nghiệp "Study on characterizations of Chalcone synthase (CHS) gene from Pueraria lobata and Pueraria mirifica in Vietnam" được thực hiện nhằm giải quyết khoảng trống dữ liệu này.
Mục tiêu nghiên cứu tổng quát của đề tài: Xác định và phân tích đặc điểm trình tự gen mã hóa chalcone synthase (CHS) phân lập từ hai loài Pueraria lobata và Pueraria mirifica tại Việt Nam, làm cơ sở khoa học phục vụ định hướng nhân dòng và biểu hiện protein tái tổ hợp trong hệ thống vi khuẩn.
Để đạt được mục tiêu nêu trên, khóa luận triển khai 4 nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể:
- Tách chiết thành công RNA tổng số từ mẫu mô thực vật đảm bảo độ tinh sạch cao và hạn chế tối đa sự thoái hóa.
- Thiết kế cặp mồi đặc hiệu, tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi (annealing temperature) và thực hiện phản ứng phiên mã ngược kết hợp khuếch đại chuỗi polymerase (RT-PCR) để nhân bản gen CHS.
- Tinh sạch sản phẩm PCR và giải trình tự nucleotit bằng phương pháp Sanger trên hệ thống tự động ABI 3500.
- Sử dụng các công cụ tin sinh học chuyên dụng để phân tích, so sánh trình tự nucleotit và trình tự axit amin dự đoán với các dữ liệu chuẩn trên cơ sở dữ liệu NCBI.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:
- Đối tượng: Mẫu mô thực vật của hai loài Pueraria lobata và Pueraria mirifica.
- Thời gian thực hiện: Từ tháng 8 năm 2020 đến tháng 12 năm 2020.
- Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm Đa dạng Di truyền, Viện Nghiên cứu Hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (VAST), phối hợp cùng Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam (VNUA).
Cơ sở lý thuyết và phương pháp
Khóa luận được xây dựng dựa trên nền tảng lý thuyết về con đường chuyển hóa phenylpropanoid và polyketide ở thực vật bậc cao, trong đó enzyme chalcone synthase (thuộc siêu họ enzyme polyketide synthase loại III) đóng vai trò trung tâm trong quá trình tạo ra naringenin chalcone. Các nghiên cứu cấu trúc tinh thể trước đây chỉ ra rằng enzyme CHS hoạt động dưới dạng homodimer với khối lượng phân tử mỗi tiểu đơn vị khoảng 42–43 kDa, sở hữu các vùng bảo tồn nghiêm ngặt như bộ tứ xúc tác (catalytic tetrad) Cys-His-Asn-Phe và các motif liên kết phân tử Coenzyme A.
Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm bao gồm chuỗi kỹ thuật sinh học phân tử chuẩn hóa:
- Tách chiết RNA tổng số: Quy trình sử dụng thuốc thử TRIzol Reagent được tối ưu hóa cho mô thực vật giàu hợp chất thứ cấp; phá mẫu bằng nitơ lỏng; tách pha hữu cơ - nước bằng Chloroform; kết tủa RNA bằng 2-propanol lạnh tại nhiệt độ -20°C; rửa kết tủa bằng ethanol 70% và hòa tan trong nước xử lý DEPC.
- Kiểm tra chất lượng và định lượng RNA: Đánh giá độ nguyên vẹn của RNA qua điện di gel agarose 0.8% ở điện thế 150 V trong 30 phút, nhuộm Ethidium Bromide (EtBr 1%); định lượng nồng độ và độ tinh sạch dựa trên tỷ số hấp thụ quang phổ A260/A280 bằng máy quang phổ NanoDrop One/OneC UV-Vis.
- Tổng hợp cDNA: Sử dụng bộ kít RevertAid First Strand cDNA Synthesis (Thermo Scientific) với chu trình nhiệt: 65°C trong 5 phút, 42°C trong 60 phút và kết thúc bằng 70°C trong 10 phút.
- Khuếch đại gen bằng RT-PCR: Phản ứng sử dụng enzyme DreamTaq Polymerase với cặp mồi chuyên biệt được tổng hợp bởi PHUSA Biochem (Mồi xuôi CHS F:
5'-TTGAGTTCGATCAAATCGCAG-3'và mồi ngược CHS R:5'-TAGGCATCTCAGATGGCC-3'). Khảo sát dải nhiệt độ gắn mồi ở 3 mức: 59°C, 61°C và 63°C trên máy luân nhiệt UV PCR Master Cycler Pro S (Eppendorf). - Tinh sạch sản phẩm PCR: Sử dụng bộ kit cột vi cột silica Cycle Pure Kit (OMEGA Bio-tek) theo quy trình 12 bước loại bỏ hoàn toàn mồi dư, enzyme và dNTP.
- Giải trình tự và phân tích dữ liệu: Sản phẩm tinh sạch được giải trình tự bằng công nghệ Sanger trên máy ABI 3500. Dữ liệu thô được lắp ráp và chỉnh sửa bằng phần mềm BioEdit; tìm kiếm độ tương đồng di truyền qua công cụ BLAST (NCBI); dự đoán các miền bảo tồn qua NCBI Conserved Domain Database (CDD) và tìm kiếm motif chức năng bằng công cụ GenomeNet MOTIF.
Nguồn dữ liệu đối chiếu: Các trình tự tham chiếu chuẩn được tải về từ ngân hàng gen GenBank (NCBI), bao gồm các mã số truy cập D10223.1 (P. lobata), JQ409456.1 (P. mirifica), NP_001304585.2 (Glycine max CHS8), NP_001340309.1 (Glycine max CHS7), ACT32034.1 (Glycine soja), XP_007158815.1 (Phaseolus vulgaris), AJZ72655.1 (Vigna radiata) và 24 trình tự protein CHS khác thuộc họ Fabaceae.
Nội dung chính theo từng chương
Overview of the Pueraria genus and Chalcone Synthase Gene
Chương này tổng quan về vị trí phân loại học, đặc điểm hình thái, sinh thái và hóa thực vật của chi Pueraria (họ Fabaceae, phân họ Faboideae, tông Phaseoleae, phân tông Glycininae). Tác giả làm rõ giá trị dược liệu của rễ củ P. lobata trong y học truyền thống (chữa sốt, cảm mạo, đái tháo đường, hỗ trợ giải độc rượu) và P. mirifica tại Thái Lan (liệu pháp thay thế hormone tự nhiên, cải thiện sức khỏe phụ nữ tiền và hậu mãn kinh nhờ chứa puerarin, daidzein, genistein, miroestrol và deoxymiroestrol).
Bên cạnh đó, chương tổng quan chi tiết cơ chế hóa sinh của chalcone synthase trong chuỗi phản ứng chuyển hóa phenylpropanoid: khởi đầu từ L-phenylalanine qua các enzyme PAL, C4H, 4CL tạo thành p-coumaroyl-CoA, sau đó enzyme CHS xúc tác phản ứng ngưng tụ tuần tự giải phóng naringenin chalcone. Tác giả phân tích cấu trúc không gian của CHS, cơ chế đóng vòng polyketide và tổng hợp các công trình nhân bản gen CHS đã công bố trên các đối tượng như kiều mạch (Fagopyrum esculentum), đậu cô ve (Phaseolus vulgaris), đại mạch (Hordeum vulgare), đậu tương (Glycine max) và đậu Hà Lan (Pisum sativum).
Materials and Methods
Nội dung chương trình bày chi tiết danh mục trang thiết bị (hệ thống tủ lạnh sâu -80°C, máy ly tâm lạnh Eppendorf 5424R, máy luân nhiệt Master Cycler Pro S, máy đọc gel GelDoc, máy đo quang phổ NanoDrop One/OneC), nguồn gốc hóa chất (ThermoFisher, OMEGA Bio-tek, PHUSA Biochem) và quy trình thực nghiệm.
Chương này mô tả chi tiết:
- Quy trình 10 bước tách chiết RNA tổng số.
- Thành phần phản ứng tổng hợp sợi cDNA thứ nhất với enzyme RevertAid Reverse Transcriptase.
- Thành phần phản ứng RT-PCR (25 µL) chứa 2.25 µL đệm DreamTaq, 1.0 µL mỗi mồi (CHS F và CHS R), 0.5 µL dNTPs (10 mM), 0.25 µL DreamTaq Polymerase, 1.0 µL cDNA khuôn mẫu.
- Chu trình nhiệt PCR gồm giai đoạn biến tính ban đầu, 30 chu kỳ lặp lại (biến tính, gắn mồi ở 59°C/61°C/63°C trong 30 giây, kéo dài ở 72°C) và giai đoạn kéo dài cuối cùng.
- Quy trình 12 bước tinh sạch sản phẩm PCR qua cột HiBind DNA mini column.
- Phương pháp luận phân tích tin sinh học in silico.
Results and Discussions
Chương kết quả và thảo luận trình bày toàn bộ số liệu thực nghiệm thu được từ quá trình triển khai:
- Chất lượng RNA tổng số: Điện di gel agarose cho thấy 3 vạch RNA đặc trưng gồm 28S rRNA (~2000 bp), 18S rRNA (~1500 bp) và 5S rRNA (~375 bp). Vạch 28S và 18S sáng rõ, sắc nét, không bị đứt gãy. Tỷ lệ quang phổ A260/A280 dao động trong khoảng 1.8 đến 2.0, nồng độ RNA thu nhận đạt từ 83.2 ng/µL đến 124.5 ng/µL, phản ánh dịch chiết sạch polyphenol và polysaccharide.
- Tối ưu hóa nhiệt độ RT-PCR: Thử nghiệm tại ba mốc nhiệt độ cho thấy sản phẩm nhân bản kích thước dự đoán khoảng 1.24 kb chỉ xuất hiện rõ nét ở nhiệt độ gắn mồi 59°C. Tại nhiệt độ 61°C và 63°C hoàn toàn không quan sát thấy vạch khuếch đại. Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch qua cột silica thu được một vạch đơn kích thước ~1.2 kb, loại bỏ toàn bộ mồi dimer và tạp chất.
- Phân tích trình tự gen CHS của P. lobata: Trình tự thu được có chiều dài khung đọc mở hoàn chỉnh (full-length ORF) là 1170 bp, bắt đầu bằng bộ ba mở đầu ATG và kết thúc bằng bộ ba kết thúc TGA, mã hóa chuỗi polypeptide gồm 389 axit amin. Đối chiếu bằng BLASTn với trình tự chuẩn trên GenBank (mã truy cập D10223.1) cho thấy mức độ đồng nhất đạt 100%, không phát hiện bất kỳ sai khác nucleotit nào.
- Phân tích trình tự gen CHS của P. mirifica: Khung đọc mở đầy đủ có chiều dài 1170 bp mã hóa 389 axit amin. Khi so sánh với trình tự tham chiếu quốc tế (mã truy cập JQ409456.1), độ tương đồng di truyền đạt 97.78%, ghi nhận 26 vị trí sai khác nucleotit dẫn đến sự thay đổi của 16 vị trí axit amin, trong đó các biến dị tập trung nhiều hơn ở vùng đầu 5' của trình tự mã hóa.
- So sánh trình tự giữa hai loài phân lập tại Việt Nam: So sánh trực tiếp giữa P. lobata và P. mirifica cho thấy độ tương đồng đạt 98.4%, xuất hiện 19 vị trí sai khác nucleotit (tại các vị trí: 29, 30, 31, 33, 36, 39, 43, 60, 559, 621, 657, 684, 786, 804, 909, 1150, 1154, 1164, 1167), dẫn đến 7 vị trí sai khác axit amin trong chuỗi polypeptide.
| Vị trí nucleotit | Nucleotit P. lobata | Axit amin P. lobata | Nucleotit P. mirifica | Axit amin P. mirifica |
|---|---|---|---|---|
| 29, 30 | C, A | Alanine (A) | G, G | Glycine (G) |
| 31, 33 | C, A | Alanine (A) | A, C | Alanine (A) |
| 36 | G | Glutamine (Q) | T | Asparagine (N) |
| 39 | A | Arginine (R) | T | Serine (S) |
| 43 | G | Alanine (A) | A | Alanine (A) |
| 60 | T | Glycine (G) | C | Serine (S) |
| 559 | T | Valine (V) | C | Valine (V) |
| 621 | T | Leucine (L) | C | Leucine (L) |
| 657 | G | Leucine (L) | A | Leucine (L) |
| 684 | A | Proline (P) | T | Proline (P) |
| 786 | C | Leucine (L) | G | Leucine (L) |
| 804 | C | Glycine (G) | T | Glycine (G) |
| 909 | C | Histidine (H) | T | Histidine (H) |
| 1150 | C | Valine (V) | T | Valine (V) |
| 1154 | G | Leucine (L) | A | Leucine (L) |
| 1164 | C | Arginine (R) | T | Histidine (H) |
| 1167 | C | Alanine (A) | A | Alanine (A) |
- Phân tích miền bảo tồn và motif chức năng: Khảo sát trên cơ sở dữ liệu CDD nhận diện 4 miền chức năng quan trọng: PLN03173 (vị trí 1–388 aa), BH0617 (vị trí 17–388 aa), CHS_like (vị trí 16–384 aa) và FabH (vị trí 17–385 aa). Trình tự protein của cả hai loài đều bảo tồn hoàn toàn bộ tứ xúc tác Cys164, Phe215, His303, Asn336; các vị trí gắn Coenzyme A (Lys55, Arg58, Lys62); motif leucine zipper (Leu310, Leu317, Leu319, Leu331); và motif chữ ký họ
GVLFGFGPGLTI(chứa Pro375 trong vòng G372FGPG). - So sánh phát sinh phân loại trong họ Fabaceae: Độ tương đồng chuỗi axit amin giữa P. lobata, P. mirifica với các loài họ Đậu dao động từ 73% đến 96.24% (cao nhất với Glycine max CHS8 đạt 96.24% ở P. lobata và 95% ở P. mirifica; thấp nhất với Phaseolus vulgaris đạt 73%). Phân tích đối chiếu 26 loài họ Fabaceae cho thấy có 16 loài mang motif chữ ký
GVLFGFGPGLTIchính xác, trong khi một số loài có sự thay đổi axit amin cuối cùng thành Valine (V) hoặc Methionine (M).
Kết quả và đóng góp
Khóa luận đã thu được các kết quả cụ thể sau:
- Thiết lập quy trình tách chiết RNA tổng số và khuếch đại RT-PCR tối ưu cho gen CHS trên hai loài sắn dây tại nhiệt độ gắn mồi chính xác 59°C.
- Xác định đầy đủ trình tự khung đọc mở 1170 bp mã hóa 389 axit amin của gen CHS từ Pueraria lobata và Pueraria mirifica tại Việt Nam.
- Cung cấp số liệu so sánh chi tiết về độ tương đồng và biến dị nucleotit/axit amin: P. lobata tương đồng 100% với trình tự GenBank D10223.1; P. mirifica đạt 97.78% tương đồng với JQ409456.1 (26 sai khác nucleotit, 16 thay đổi axit amin); hai loài trong nghiên cứu có độ tương đồng 98.4% (19 sai khác nucleotit, 7 thay đổi axit amin).
- Chứng minh tính bảo tồn nghiêm ngặt của các miền cấu trúc cốt lõi (PLN03173, BH0617, CHS-like, FabH), bộ tứ xúc tác C164-F215-H303-N336, motif khóa leucine và motif chữ ký họ
GVLFGFGPGLTI.
Kiến nghị và đề xuất của tác giả:
- Tiến hành nhân bản dòng gen CHS đã phân lập vào vector biểu hiện chuyên dụng cho vi khuẩn (Escherichia coli).
- Thực hiện biểu hiện và tinh sạch protein CHS tái tổ hợp (rCHS) ở quy mô phòng thí nghiệm và mở rộng.
- Khảo sát hoạt tính enzyme xúc tác in vitro nhằm đánh giá chính xác tác động sinh học của các axit amin sai khác giữa hai loài đến hiệu suất tổng hợp chalcone.
Đóng góp của đề tài: Đây là công trình nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam phân lập, giải trình tự đầy đủ và phân tích toàn diện các đặc tính sinh học phân tử của gen chalcone synthase (CHS) ở cả mức độ nucleotit và axit amin trên hai loài dược liệu Pueraria lobata và Pueraria mirifica.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
Khóa luận dừng lại ở phạm vi phân lập, giải trình tự Sanger và phân tích cấu trúc chức năng thông qua các công cụ tin sinh học (in silico). Nghiên cứu chưa triển khai thực nghiệm biểu hiện gen trong tế bào chủ vi sinh vật, chưa thu nhận protein tái tổ hợp và chưa đo đạc động học enzyme thực tế.
Hướng nghiên cứu tiếp theo bao gồm việc thiết kế vector tái tổ hợp mang gen CHS, tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy biểu hiện trong E. coli, tinh sạch protein bằng sắc ký ái lực và kiểm tra hoạt tính sinh hóa trong việc chuyển hóa cơ chất p-coumaroyl-CoA thành chalcone.
Giá trị tham khảo
Khóa luận là nguồn tài liệu hữu ích cho:
- Sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu viên các ngành Công nghệ Sinh học, Sinh học Phân tử, Di truyền học Thực vật, Hóa thực vật và Dược học.
- Những người thực hiện các đề tài liên quan đến kỹ thuật tách chiết RNA từ các mẫu thực vật chứa hàm lượng tinh bột, polyphenol và chất chuyển hóa thứ cấp cao.
- Nghiên cứu tham khảo quy trình tối ưu RT-PCR một cặp mồi đặc hiệu, kỹ thuật tinh sạch sản phẩm PCR và quy trình sử dụng các phần mềm tin sinh học (BioEdit, BLAST, CDD, MOTIF Search) để giải mã cấu trúc phân tử của các enzyme thuộc họ polyketide synthase loại III.
Câu hỏi thường gặp
1. Nhiệt độ gắn mồi (annealing temperature) tối ưu cho phản ứng RT-PCR khuếch đại gen CHS trong nghiên cứu này là bao nhiêu?
Nhiệt độ gắn mồi tối ưu được xác định là 59°C. Tại nhiệt độ này, phản ứng tạo ra băng khuếch đại đơn, sắc nét với kích thước khoảng 1.24 kb sau 30 chu kỳ luân nhiệt. Ở hai mức nhiệt độ thử nghiệm còn lại là 61°C và 63°C, phản ứng hoàn toàn không tạo ra sản phẩm khuếch đại.
2. Chiều dài khung đọc mở (ORF) và chuỗi axit amin dự đoán của gen CHS phân lập từ hai loài sắn dây là bao nhiêu?
Khung đọc mở hoàn chỉnh (full-length ORF) của gen CHS phân lập từ cả Pueraria lobata và Pueraria mirifica đều có kích thước 1170 bp, bắt đầu bằng bộ ba mở đầu ATG, kết thúc bằng bộ ba dừng TGA và mã hóa cho chuỗi polypeptide gồm 389 axit amin.
3. Mức độ tương đồng di truyền giữa trình tự gen CHS của hai loài trong nghiên cứu là bao nhiêu?
Khi so sánh trực tiếp, trình tự gen CHS của Pueraria lobata và Pueraria mirifica phân lập được đạt độ tương đồng di truyền 98.4%. Có 19 vị trí nucleotit sai khác trên toàn bộ chiều dài 1170 bp, dẫn đến sự khác biệt ở 7 vị trí axit amin trong chuỗi polypeptide.
4. Những axit amin nào tạo nên bộ tứ trung tâm xúc tác (catalytic tetrad) của enzyme CHS trong nghiên cứu?
Bộ tứ xúc tác được bảo tồn nguyên vẹn trên chuỗi axit amin của cả hai loài gồm có Cysteine-164 (C164 đóng vai trò tác nhân ái nhân và vị trí gắn chất trung gian polyketide), Phenylalanine-215 (F215 định vị cơ chất trong quá trình kéo dài mạch), Histidine-303 (H303) và Asparagine-336 (N336 tham gia phản ứng khử carboxyl của malonyl-CoA).
5. Ý nghĩa của motif chữ ký họ "GVLFGFGPGLTI" là gì và mức độ xuất hiện của nó trong họ Fabaceae?
Motif GVLFGFGPGLTI là chữ ký đặc trưng của họ enzyme chalcone synthase (chứa gốc Pro375 nằm trong vòng G372FGPG), thuộc vùng tận cùng C của miền Chalcone-stilbene synthase, đóng vai trò cấu trúc khung trung tâm hoạt động để định hướng tính lập thể của phản ứng đóng vòng tạo chalcone. Phân tích đối chiếu 26 loài thuộc họ Fabaceae cho thấy motif này xuất hiện ở 16 loài (bao gồm cả chi Pueraria), trong khi các loài còn lại có sự biến đổi ở axit amin cuối cùng thành Valine hoặc Methionine.
Kết luận
Khóa luận đã phân lập và xác định thành công cấu trúc phân tử hoàn chỉnh của gen CHS (chiều dài 1170 bp, mã hóa 389 axit amin) từ hai loài dược liệu Pueraria lobata và Pueraria mirifica tại Việt Nam. Các phân tích tin sinh học khẳng định tính bảo tồn cao của các miền chức năng cốt lõi và bộ tứ xúc tác enzym, đồng thời chỉ ra các điểm sai khác nucleotit đặc trưng giữa hai loài cũng như so với cơ sở dữ liệu quốc tế. Kết quả này cung cấp cơ sở dữ liệu di truyền chuẩn xác và là bước đệm trực tiếp phục vụ các nghiên cứu biểu hiện protein tái tổ hợp và đánh giá hoạt tính sinh học của enzyme chalcone synthase trong tương lai.