Luận án nghiên cứu tạo rễ tơ từ cây bạch hoa xà và khảo sát khả năng tạo plumbagin trong nuôi cấy in vitro

• Tác giả: Bùi Đình Thạch
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Hữu Hổ
• Trường học: Viện Sinh học Nhiệt đới
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu tạo rễ tơ và khả năng tạo plumbagin từ cây bạch hoa xà
• Loại tài liệu: luận án
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• TÓM TẮT
• ABSTRACT
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Cây Bạch hoa xà
• 1.2. Nguồn gốc và phân loại
• 1.3. Đặc điểm hình thái
• 1.4. Thành phần hóa học
• 1.5. Công dụng của dịch trích ly từ rễ cây BHX
• 1.6. Cấu trúc và đặc tính hóa học
• 1.7. Sinh tổng hợp Plumbagin ở thực vật
• 1.8. Hoạt tính của Plumbagin
• 1.8.1. Hoạt tính kháng oxy hóa
• 1.8.2. Hoạt tính kháng viêm
• 1.8.3. Hoạt tính kháng ung thư
• 1.8.4. Hoạt tính kháng khuẩn
• 1.8.5. Hoạt tính kháng nấm
• 1.8.6. Độc tính của plumbagin
• 1.9. Tình hình nghiên cứu thu nhận hoạt chất Plumbagin từ thực vật
• 1.10. Chuyển hóa thứ cấp từ thực vật
• 1.10.1. Hợp chất thứ cấp từ thực vật
• 1.10.2. Con đường chuyển hóa các hợp chất thứ cấp
• 1.11. Dược tính của các hợp chất thứ cấp từ thực vật
• 1.12. Sự cần thiết nuôi cấy rễ tơ thu nhận hợp chất thứ cấp
• 1.13. Sự hình thành rễ tơ ở thực vật
• 1.14. Chuyển gen tạo rễ tơ nhờ Agrobacterium rhizogenes
• 1.14.1. Ri-plasmid của vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes
• 1.14.2. Sự chuyển nạp gen từ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes vào tế bào thực vật
• 1.14.3. Sự biểu hiện của các gen vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes trong mô thực vật
• 1.15. Tạo rễ tơ ở thực vật bằng Agrobacterium rhizogenes
• 1.16. Nuôi cấy rễ tơ ở thực vật
• 1.16.1. Ảnh hưởng của dòng rễ tơ
• 1.16.2. Nguồn dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy
• 1.16.3. Ảnh hưởng của elicitor
• 1.16.4. Nuôi cấy rễ tơ để thu nhận các hoạt chất thứ cấp
• 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Nguyên vật liệu
• 2.2. Môi trường và điều kiện nuôi cấy
• 2.3. Phương pháp thực nghiệm
• 2.3.1. Tạo và chọn nguồn vật liệu in vitro cây Bạch hoa xà dùng cho chuyển gen
• 2.3.2. Khảo sát điều kiện khử trùng mẫu
• 2.3.3. Khảo sát môi trường tối ưu để tạo chồi trực tiếp từ chồi ngủ
• 2.3.4. Phát triển cây hoàn chỉnh từ chồi in vitro
• 2.3.5. Khảo sát khả năng tạo rễ bất định từ lá và đoạn thân cây Bạch hoa xà in vitro
• 2.3.6. Ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự hình thành rễ tơ
• 2.3.7. Chuyển gen cảm ứng tạo rễ tơ
• 2.3.8. Kiểm tra sự hiện diện của gen rol trong T-DNA của vi khuẩn hợp nhất được vào bộ gen tế bào rễ tơ bằng phương pháp PCR
• 2.3.9. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và tích lũy hoạt chất plumbagin trong nuôi cây rễ tơ cây Bạch hoa xà
• 2.3.10. Ảnh hưởng trạng thái môi trường
• 2.3.11. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng lên khả năng sinh trưởng của rễ tơ
• 2.3.12. Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy lên sự sinh trưởng của rễ tơ
• 2.3.13. Ảnh hưởng khối lượng ban đầu
• 2.3.14. Xác định đường cong tăng trưởng
• 2.3.15. Ảnh hưởng của một số yếu tố dinh dưỡng và elicitor lên sự sinh trưởng của rễ tơ
• 2.3.16. Định tính và định lượng hoạt chất Plumbagin ở rễ tơ
• 2.3.16.1. Ly trích và chuẩn bị mẫu cho phân tích HPLC
• 2.3.16.2. Định tính Plumbagin bằng sắc ký lớp mỏng (TLC)
• 2.3.16.3. Định lượng Plumbagin bằng HPLC
• 2.3.17. Khảo sát khả năng kháng tế bào ung thư biểu mô gan của Plumbagin
• 2.3.18. Xử lý số liệu
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Tạo và chọn nguồn vật liệu in vitro
• 3.2. Xác định điều kiện khử trùng mẫu
• 3.3. Khảo sát tìm môi trường tối ưu để tạo chồi trực tiếp từ chồi ngủ
• 3.4. Phát triển cây hoàn chỉnh từ chồi in vitro
• 3.5. Khảo sát khả năng tạo rễ bất định của lá và đoạn thân cây Bạch hoa xà in vitro
• 3.6. Chuyển gen tạo rễ tơ cây Bạch hoa xà
• 3.7. Ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự hình thành rễ tơ
• 3.8. Xác định hoạt chất Plumbagin tích lũy trong rễ tơ
• 3.9. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và tổng hợp Plumbagin
• 3.9.1. Trạng thái môi trường
• 3.9.2. Điều kiện chiếu sáng
• 3.9.3. Ảnh hưởng của loại môi trường nuôi cấy lên sự sinh trưởng của rễ tơ
• 3.9.4. Ảnh hưởng của lượng rễ ban đầu đến tăng trưởng rễ tơ BHX nuôi cấy
• 3.9.5. Xác định đường cong tăng trưởng
• 3.9.6. Ảnh hưởng của một số yếu tố sinh dưỡng và elicitor lên sự sinh trưởng rễ tơ BHX nuôi cấy
• 3.10. Khảo sát khả năng kháng tế bào ung thư biểu mô gan của Plumbagin
• 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• 5. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
• 6. DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Giới thiệu về cây Bạch hoa xà

Cây Bạch hoa xà (Plumbago zeylanica L.) là một loài cây dược liệu quan trọng, thuộc họ Plumbaginaceae. Cây có nguồn gốc từ vùng Tây Bắc Châu Á và phân bố rộng rãi ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Rễ cây chứa thành phần chính là Plumbagin, một hợp chất naphthoquinone có nhiều đặc tính dược liệu như kháng tế bào ung thư, kháng khuẩn và kháng nấm. Theo y học cổ truyền, cây được sử dụng để điều trị nhiều bệnh lý, đặc biệt là các bệnh về da. Nghiên cứu cho thấy, Plumbagin có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư và có tác dụng kháng viêm, kháng khuẩn. Việc nghiên cứu và phát triển nguồn nguyên liệu từ cây Bạch hoa xà thông qua nuôi cấy rễ tơ là cần thiết để đáp ứng nhu cầu dược liệu ngày càng tăng.

II. Tạo rễ tơ từ cây Bạch hoa xà

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc tạo rễ tơ từ cây Bạch hoa xà có thể thực hiện thông qua kỹ thuật chuyển gen. Cơ quan thực vật được chọn để chuyển gen là lá, với hiệu quả chuyển gen cao nhất đạt được khi sử dụng Agrobacterium rhizogenes. Thời gian ủ và hàm lượng acetosyringone cũng có ảnh hưởng đáng kể đến tỷ lệ chuyển gen. Kết quả cho thấy, điều kiện tối ưu để tạo rễ tơ là môi trường MS, nuôi cấy trong điều kiện tối và ở dạng lỏng. Việc sử dụng ma trận Plackett-Burman giúp xác định các yếu tố dinh dưỡng và elicitor ảnh hưởng đến sự phát triển và tích lũy Plumbagin trong rễ tơ. Điều này mở ra hướng đi mới trong việc sản xuất dược liệu từ cây Bạch hoa xà.

III. Khả năng tích lũy Plumbagin trong rễ tơ

Khả năng tích lũy Plumbagin trong rễ tơ cây Bạch hoa xà phụ thuộc vào nhiều yếu tố như môi trường nuôi cấy, điều kiện ánh sáng và dinh dưỡng. Nghiên cứu cho thấy, môi trường nuôi cấy có bổ sung nước dừa, chitosan, salicylic acid và peptone cho kết quả tối ưu về trọng lượng tươi, trọng lượng khô và hàm lượng Plumbagin. Việc xác định các yếu tố này không chỉ giúp tối ưu hóa quy trình nuôi cấy mà còn nâng cao hiệu quả sản xuất Plumbagin. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển nguồn nguyên liệu dược liệu từ cây Bạch hoa xà, phục vụ cho nhu cầu y học hiện đại.

IV. Tác động của Plumbagin đến tế bào ung thư

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng Plumbagin có tác dụng kháng tế bào ung thư biểu mô gan. Qua các thí nghiệm, Plumbagin đã làm giảm mật độ tế bào HepG2, gây ra sự phân mảnh của nhân và ảnh hưởng đến biểu hiện của các gene liên quan đến quá trình apoptosis như bax và bcl-2. Những kết quả này cho thấy Plumbagin không chỉ có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư mà còn kích thích quá trình chết theo chương trình của tế bào. Điều này mở ra triển vọng cho việc sử dụng Plumbagin như một liệu pháp hỗ trợ trong điều trị ung thư.