Khóa luận tốt nghiệp: Tách chiết hoạt chất ức chế α-glucosidase từ Aspergillus niger

Khóa luận tốt nghiệp nghiên cứu điều kiện tách chiết hoạt chất ức chế α glucosidase từ chủng Aspergillus niger, ứng dụng trong y học và dược phẩm.

Chuyên ngành

Dược học

Người đăng

Ẩn danh

Thể loại

Khóa luận tốt nghiệp đại học

2021

58
1
0

Phí lưu trữ

30 Point

Mục lục chi tiết

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

1. ĐẶT VẤN ĐỀ

1.1. Bệnh đái tháo đường

1.2. Cơ chế bệnh sinh và biến chứng

1.3. Các nguyên tắc điều trị bệnh đái tháo đường

1.4. Giới thiệu chung về α-glucosidase

1.5. Cấu trúc của α-glucosidase

1.6. Cơ chế hoạt động của enzyme trong cơ thể

1.7. Chất ức chế α-glucosidase

1.7.1. Giới thiệu và cơ chế hoạt động của chất ức chế enzyme α-glucosidase

1.7.2. Phân loại chất ức chế enzyme α-glucosidase

1.7.3. Nguồn gốc chất ức chế enzyme α-glucosidase

1.8. Giới thiệu về chủng nấm sợi Aspergillus niger

1.9. Tình hình nghiên cứu hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase từ chủng Aspergillus trong nước và quốc tế

2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu. Thời gian và địa điểm nghiên cứu

2.2. Thiết bị phòng thí nghiệm và hóa chất

2.3. Môi trường nuôi cấy. Quy trình tiến hành nghiên cứu

2.4. Phương pháp nghiên cứu. Xác định hoạt tính chất ức chế α-glucosidase

2.5. Tách chiết, tinh sạch hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase từ dịch nuôi cấy

2.6. Xác định giá trị IC50

2.7. Kiểm tra độ tinh sạch bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao và sắc ký lỏng khối phổ

2.8. Phương pháp xử lý số liệu

3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1. Kết quả tinh sạch hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase từ chủng A.

3.2. Kết quả quá trình tách chiết hoạt chất ức chế α-glucosidase với các dung môi

3.3. Nghiên cứu chọn lựa các hệ dung môi pha động chạy sắc ký cột

3.4. Kết quả tinh sạch bằng cột sắc ký silica gel 60

3.5. Xác định IC50 của dịch chiết n-butanol và của mẫu tinh sạch cuối cùng

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tách chiết hoạt chất ức chế α glucosidase

Nghiên cứu tập trung vào tách chiết các hoạt chất có khả năng ức chế α-glucosidase từ chủng Aspergillus niger. Quá trình này bao gồm việc sử dụng các phương pháp tách chiết khác nhau để thu nhận các hợp chất có hoạt tính sinh học. Các dung môi như n-butanol được sử dụng để chiết xuất các hoạt chất từ dịch nuôi cấy của nấm. Kết quả cho thấy dịch chiết n-butanol có hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase đáng kể, với giá trị IC50 được xác định để đánh giá hiệu quả.

1.1. Phương pháp tách chiết

Các phương pháp tách chiết được áp dụng bao gồm sử dụng hệ dung môi pha động và sắc ký cột silica gel. Quá trình này giúp phân lập các hoạt chất từ dịch nuôi cấy của Aspergillus niger. Sắc ký lớp mỏng (TLC) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) được sử dụng để kiểm tra độ tinh sạch của các phân đoạn. Kết quả cho thấy các phương pháp này hiệu quả trong việc thu nhận các hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme.

1.2. Đánh giá hoạt tính sinh học

Hoạt tính ức chế α-glucosidase của các dịch chiết được đánh giá thông qua giá trị IC50. Dịch chiết n-butanol cho thấy hoạt tính ức chế mạnh, với giá trị IC50 thấp hơn so với các dung môi khác. Điều này chứng tỏ hoạt chất từ Aspergillus niger có tiềm năng ứng dụng trong điều trị bệnh đái tháo đường.

II. Ứng dụng y học của hoạt chất ức chế α glucosidase

Các hoạt chất ức chế α-glucosidase từ Aspergillus niger có tiềm năng lớn trong ứng dụng y học, đặc biệt là trong điều trị bệnh đái tháo đường tuýp 2. Nhóm thuốc này giúp kiểm soát đường huyết bằng cách ức chế sự hấp thu carbohydrate tại ruột non. So với các thuốc ức chế α-glucosidase tổng hợp, các hoạt chất tự nhiên từ nấm có thể giảm thiểu tác dụng phụ như đầy hơi và tiêu chảy.

2.1. Cơ chế ức chế enzyme

Các chất ức chế enzyme từ Aspergillus niger hoạt động bằng cách liên kết với vị trí hoạt động của enzyme α-glucosidase, ngăn cản quá trình thủy phân carbohydrate. Điều này làm giảm sự hấp thu glucose vào máu, giúp kiểm soát đường huyết hiệu quả. Cơ chế này tương tự như các thuốc ức chế α-glucosidase tổng hợp như acarbose và miglitol.

2.2. Tiềm năng trong nghiên cứu dược liệu

Nghiên cứu này mở ra hướng đi mới trong nghiên cứu dược liệu bằng cách khai thác các hoạt chất tự nhiên từ vi sinh vật. Aspergillus niger là nguồn nguyên liệu phong phú, dễ nuôi cấy và không gây ô nhiễm môi trường. Các hoạt chất từ nấm có thể được phát triển thành các sản phẩm dược phẩm an toàn và hiệu quả.

III. Phân lập và tinh sạch hoạt chất

Quá trình phân lập hoạt chất từ Aspergillus niger bao gồm các bước tinh sạch bằng sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng. Các phân đoạn thu được được kiểm tra độ tinh sạch bằng HPLC và LC/MS. Kết quả cho thấy mẫu tinh sạch cuối cùng có hoạt tính ức chế α-glucosidase cao, với giá trị IC50 thấp. Điều này chứng tỏ hiệu quả của quy trình tinh sạch trong việc thu nhận các hoạt chất có giá trị.

3.1. Quy trình tinh sạch

Quy trình tinh sạch bao gồm sử dụng cột sắc ký silica gel 60 để phân tách các hợp chất. Các phân đoạn được thu nhận và kiểm tra độ tinh sạch bằng TLC và HPLC. Kết quả cho thấy các phân đoạn từ 17 đến 21 có độ tinh sạch cao và hoạt tính ức chế enzyme mạnh.

3.2. Đánh giá độ tinh sạch

Độ tinh sạch của các mẫu được đánh giá bằng HPLC và LC/MS. Mẫu tinh sạch cuối cùng cho thấy hoạt tính ức chế α-glucosidase cao, với giá trị IC50 thấp hơn so với các mẫu khác. Điều này chứng tỏ hiệu quả của quy trình tinh sạch trong việc thu nhận các hoạt chất có giá trị.

12/02/2025

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, bệnh đái tháo đường đang được coi là một trong những vấn đề sức khỏe toàn cầu. Theo báo cáo của Liên đoàn Đái tháo đường quốc tế (IDF), số lượng bệnh nhân đái tháo đường trên toàn thế giới dự kiến có thể gần 700 triệu người vào năm 2045. Tại Việt Nam, theo ước tính của Bộ Y tế, đối với người tuổi từ 20 - 79, bệnh đái tháo đường sẽ tăng khoảng 78,5% trong giai đoạn 2017 - 2045 (từ 3,53 triệu bệnh nhân năm 2017 có thể tăng lên 6,3 triệu người mắc đái tháo đường vào năm 2045). Không những thế, dưới ảnh hưởng nghiêm trọng của đại dịch toàn cầu COVID-19, quá trình điều trị cho những bệnh nhân đái tháo đường càng trở nên khó khăn hơn.

Các nghiên cứu gần đây cho thấy bệnh nhân đái tháo đường kiểm soát đường huyết kém hơn khi mắc COVID-19 có tỷ lệ tử vong cao hơn khoảng 4 lần và thời gian nằm viện lâu hơn so với bệnh nhân không bị đái tháo đường [14, 64]. Một trong các nhóm thuốc đang được sử dụng để điều trị đái tháo đường hiện nay là nhóm chất ức chế α-glucosidase, được sử dụng phổ biến trên lâm sàng điển hình như: acarbose, voglibose, miglitol. Nhóm thuốc này thường được sử dụng phối hợp với các thuốc đầu tay khác như metformine, nhóm đồng vận thụ thể GLP-1 ,… cho kết quả điều trị tốt tuy nhiên chúng vẫn được ghi nhận những tác dụng không mong muốn như: đau đầu, mất ngủ, buồn nôn, đầy hơi và tiêu chảy [15]. Vì vậy việc tìm kiếm một hợp chất an toàn và thuận tiện cho việc sản xuất đang được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm.

Hiện nay, một trong các nguồn nguyên liệu phong phú nhất là nguồn từ các chủng vi sinh vật do chúng có một quần thể vô cùng rộng lớn, có thể phát triển mạnh và không gây ô nhiễm môi trường xung quanh. Đặc biệt là chủng nấm Aspergillus với nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy ứng dụng của chúng đối với việc tổng hợp các hoạt chất thứ cấp do hoạt tính sinh học dùng để điều trị bệnh [16, 31, 39]. Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu với đề tài: “Nghiên cứu các điều kiện tách chiết hoạt chất ức chế α-glucosidase từ chủng Aspergillus niger” với các mục tiêu sau: - Mô tả kết quả tách chiết, tinh sạch hoạt chất chất ức chế α-glucosidase từ chủng Aspergillus niger; - Xác định độ tinh sạch và giá trị IC50 của dịch chiết và sản phẩm cuối tinh sạch chứa hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase từ chủng Aspergillus niger. Bệnh đái tháo đường 1.

Khái niệm Đái tháo đường (ĐTĐ) là hội chứng các rối loạn chuyển hóa mãn tính, phức tạp được đặc trưng bởi sự tăng glucose máu do tụy không sản xuất đủ insulin hoặc do cơ thể sử dụng insulin không hiệu quả hoặc cả hai [43]. Bệnh lý này có thể gây ra những tổn thương lâu dài trong nhiều hệ cơ quan như: tổn thương võng mạc, tim, thận, não và hệ thống mạch máu với các bệnh điển hình như bệnh thận do tiểu đường, bệnh võng mạc đái tháo đường, suy gan, tổn thương hệ thần kinh. nếu bệnh nhân không phát hiện, điều trị và tuân thủ điều trị nghiêm ngặt [15]. Phân loại Theo Hiệp hội Đái tháo đường Hoa Kỳ (ADA) năm 2021, ĐTĐ có các loại sau: ĐTĐ tuýp 1, ĐTĐ tuýp 2, ĐTĐ thai kỳ, ĐTĐ do các nguyên nhân khác [11].

Đái tháo đường tuýp 1 ĐTĐ tuýp 1, trước đó được gọi là ĐTĐ tuổi vị thành niên, được gây ra bởi quá trình tự miễn làm tổn thương tế bào beta (β) đảo tụy dẫn đến tình trạng giảm sản xuất tuyệt đối insulin. Về mặt dịch tễ học, nó chiếm 5-10% số người mắc ĐTĐ. Đái tháo đường tuýp 2 ĐTĐ tuýp 2, hay còn gọi là ĐTĐ không phụ thuộc insulin, ĐTĐ người lớn, chiếm khoảng 90-95% số người mắc ĐTĐ. Bệnh được gây ra trên nền tảng cơ thể giảm tiết insulin tương đối ở tế bào β tuyến tụy và hình thành sự kháng insulin ở tế bào.

Hầu như bệnh nhân không cần điều trị bằng liệu pháp insulin trong cả cuộc đời. Đái tháo đường do các nguyên nhân khác ĐTĐ do các nguyên nhân khác, hay còn gọi là đái tháo đường thứ cấp, gồm: hội chứng đái tháo đường đơn gen (gồm đái tháo đường khởi phát ở trẻ nhỏ và đái tháo đường sơ sinh), do bệnh tụy ngoại tiết, do bệnh nội tiết, do cảm ứng thuốc, đái tháo đường qua trung gian miễn dịch và đái tháo đường do các hội chứng di truyền. Đái tháo đường thai kỳ ĐTĐ thai kỳ - một loại rối loạn chuyển hóa phổ biến nhất ở phụ nữ mang thai - được định nghĩa là hiện tượng rối loạn dung nạp glucose, được phát hiện vào giai 2 đoạn thứ hai hoặc thứ ba của thai kỳ mà trước thời kỳ mang thai không có dấu hiệu rõ ràng của bệnh đái tháo đường. Một trong những hậu quả của tình trạng béo phì ngày càng phổ biến cũng như trường hợp khi thai phụ đã lớn tuổi là sự tăng lên về tỷ lệ ĐTĐ thai kỳ trên thế giới, đặt ra một gánh nặng lớn lên hệ thống y tế công [11, 65].

Thực tế cho thấy ĐTĐ thai kỳ có nguy cơ gây ra nhiều biến chứng nghiêm trọng cho mẹ và thai nhi như phải sinh mổ, đẻ khó do kẹt vai, hội chứng macrosomia ở thai nhi … [21]. Hơn nữa, thai phụ mắc ĐTĐ thai kỳ dễ mắc ĐTĐ tuýp 2 hoặc các bệnh về tim mạch sau mang thai [12, 53]; trong khi thai nhi dễ phát triển mắc béo phì hoặc ĐTĐ tuýp 2 sớm trong khi lớn [20]. Cơ chế bệnh sinh và biến chứng 1. Cơ chế bệnh sinh của ĐTĐ tuýp 1 ĐTĐ tuýp 1 được đặc trưng bởi sự tấn công qua trung gian miễn dịch và phá hủy các tế bào β đảo tụy - sản xuất insulin.

Quá trình bệnh sinh được điều phối bởi các tế bào T-CD4 và T-CD8 đặc hiệu của tiểu đảo Langerhans, cũng như các tế bào B, và liên quan đến việc phá hủy các tế bào beta của tiểu đảo Langerhans. Trước tiên, các tế bào lympho (bạch huyết) bao quanh đảo nhỏ (viêm xung quanh tiểu đảo tụy), và sau đó xâm nhập vào vùng trung tâm của tiểu đảo, gây ra sự hủy hoại tế bào beta và cuối cùng là gây ra ĐTĐ tuýp 1. Bệnh phát sinh ở những người rối loạn về mặt di truyền, khởi phát trung bình lúc 10 – 14 tuổi. Tỷ lệ mắc bệnh ở các cặp song sinh là khoảng 60%, cho thấy các yếu tố môi trường cũng làm tăng nguy cơ mắc bệnh [38].

Trong số các yếu tố trên, các nghiên cứu cho thấy đặc điểm di truyền đóng vai trò quan trọng trong cơ chế phát sinh ĐTĐ tuýp 1, đặc biệt là những người mang kháng nguyên HLA DR3 và HLA DR4 vì chúng liên quan tới việc sản xuất các tự kháng thể như kháng thể kháng đảo tụy (ICA); kháng thể kháng acid glutamic decarboxylase 65 (GAD 65) và kháng thể kháng insulin (IAA: Insulin auto antibodies),…[27]. Những cá nhân có rối loạn về di truyền sẽ tăng nguy cơ bị ĐTĐ tuýp 1 khi bị tấn công bởi yếu tố môi trường bên ngoài như virus quai bị, rubella, virus coxsackie B4. Các tự kháng thể IAA và GAD sẽ tấn công tế bào β đảo tụy khiến nó bị phá hủy, mất khả năng sản xuất insulin và hậu quả là gây ra ĐTĐ tuýp 1 [27]. Cơ chế bệnh sinh của ĐTĐ tuýp 2 Yếu tố di truyền kết hợp với môi trường tác động lên cơ thể gây ra tình trạng kháng insulin và giảm bài tiết insulin, dần gây ra ĐTĐ tuýp 2.

Kháng insulin là sự hoạt động kém hiệu quả trong quá trình truyền tín hiệu của insulin từ receptor tới đích phân tử cuối cùng, dẫn tới giảm tác dụng của insulin. Gen mã hóa các enzyme và protein tham gia vào quá trình truyền tín hiệu của insulin như: insulin receptor substrate, phosphatidyl inositol-3-kinase hay tham gia vào quá trình bài tiết insulin như capain 10, yếu tố phiên mã 7-like 2 (the transcription factor 7-like 2) có liên quan tới bệnh ĐTĐ tuýp 2 [48]. Bên cạnh đó các yếu tố môi trường có thể làm tăng tiến triển của bệnh như lối sống không lành mạnh gồm việc giảm các hoạt động thể lực; thay đổi chế độ ăn uống theo hướng tăng tinh, giảm chất xơ gây dư thừa năng lượng. Ngoài ra chất lượng thực phẩm, các stress trong cuộc sống cũng tác động đến tình trạng bệnh.

Tuổi thọ càng tăng, nguy cơ mắc bệnh càng cao, đây là yếu tố không thể can thiệp được. Hầu hết bệnh nhân béo phì hoặc thừa cân và béo phì vùng bụng với vòng eo to trong khi đó béo phì vùng bụng có liên quan với tăng acid béo trong máu, mô mỡ cũng tiết ra một số hormon làm giảm tác dụng của insulin ở các cơ quan đích như gan, tế bào mỡ, tế bào cơ (kháng insulin tại các cơ quan đích). Do hiện tượng kháng insulin, ở giai đoạn đầu xảy ra sự “bù” của các tế bào β đảo tụy khiến nó tăng tiết insulin nhiều hơn và dần dẫn đến sự suy kiệt tế bào β đảo tụy khiến tăng đường huyết và cuối cùng là bệnh nhân bắt đầu có những triệu chứng lâm sàng của ĐTĐ tuýp 2 [5]. Biến chứng của ĐTĐ Bệnh ĐTĐ, cả tuýp 1 và 2, đều có thể gây ra những biến chứng từ nhẹ đến nghiêm trọng cho người bệnh với các biểu hiện cấp tính và mãn tính, đây là hậu quả từ tình trạng tăng glucose kéo dài.

Các biểu hiện cấp tính như: nhiễm khuẩn do đường máu cao và suy giảm hệ miễn dịch; hôn mê do tăng áp lực thẩm thấu, nhiễm toan thể ceton. Các biến chứng mạn tính như: biến chứng võng mạc, thận, xơ vữa động mạch. Các biến chứng cấp tính có thể đe dọa tính mạng của bệnh nhân nếu không được xử lý kịp thời còn các biến chứng mạn tính có thể gây ra hậu quả ở các mức độ khác nhau từ giảm chất lượng cuộc sống của bệnh nhân tới khiến cho bệnh nhân tử vong. Biến chứng cấp tính thường gặp đối với ĐTĐ tuýp 1 còn biến chứng mạn tính thường gặp hơn ở các bệnh nhân ĐTĐ tuýp 2.

Một trong những nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng 25% bệnh thận ĐTĐ có thể mắc các biến chứng về thận, gây ảnh hưởng lớn đến chức năng lọc của cầu thận, và 4 cuối cùng có thể dẫn đến suy thận nếu không điều trị kịp thời và đúng cách [2]. Ở Việt Nam, ước tính xấp xỉ 6% người lớn tuổi mắc ĐTĐ lâu ngày có nguy cơ mất thị lực do các biến chứng đáy mắt của bệnh lí võng mạc ĐTĐ. Phát hiện sớm và điều trị kịp thời võng mạc đái tháo đường có thể làm giảm nguy cơ ảnh hưởng tới thị lực của bệnh nhân ĐTĐ[1].

Nội dung được bảo vệ bản quyền — Tải xuống đầy đủ

Bài viết "Nghiên cứu tách chiết hoạt chất ức chế α-glucosidase từ Aspergillus niger" tập trung vào việc khám phá và tách chiết các hợp chất có khả năng ức chế enzyme α-glucosidase từ nấm Aspergillus niger. Enzyme này đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa carbohydrate, và việc ức chế nó có thể hỗ trợ kiểm soát đường huyết, đặc biệt hữu ích trong điều trị bệnh tiểu đường. Nghiên cứu này không chỉ mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các sản phẩm hỗ trợ sức khỏe mà còn góp phần vào việc tìm kiếm các nguồn hoạt chất tự nhiên hiệu quả.

Để hiểu sâu hơn về các phương pháp tách chiết và ứng dụng của các hoạt chất sinh học, bạn có thể tham khảo thêm bài viết Luận văn thạc sĩ kỹ thuật hóa học xây dựng quy trình tách hoạt chất có khả năng ức chế enzyme α-glucosidase và hoạt tính kháng oxy hóa từ cây diệp hạ châu đắng. Ngoài ra, nếu quan tâm đến các hợp chất tự nhiên khác, bạn có thể khám phá Luận văn nghiên cứu phân lập xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính sinh học các hợp chất steroid từ cây lá đắng hoặc Luận văn thạc sĩ kỹ thuật hóa học góp phần nghiên cứu thành phần hóa học rễ cây bá bệnh. Những bài viết này sẽ giúp bạn mở rộng kiến thức về các hợp chất sinh học và ứng dụng của chúng trong y học và dược phẩm.