Tổng quan nghiên cứu

Thuốc kháng sinh đã mở ra kỷ nguyên mới trong điều trị các bệnh nhiễm trùng kể từ khi penicillin được phát hiện năm 1928. Tuy nhiên, sự gia tăng nhanh chóng của các chủng vi khuẩn đa kháng thuốc đã làm giảm hiệu quả của các loại thuốc này, đòi hỏi phải tìm kiếm các chất kháng khuẩn mới có hiệu quả cao. Peptide kháng khuẩn, đặc biệt là các peptide có nguồn gốc từ nọc độc côn trùng, được xem là nguồn tài nguyên quý giá cho phát triển thuốc kháng sinh thế hệ mới. Mastoparan, một peptide lưỡng phần có 14 amino acid, được tìm thấy trong nọc ong Vespa velutina, nổi bật với hoạt tính kháng khuẩn rộng rãi chống lại cả vi khuẩn gram dương và gram âm.

Vespa velutina là loài ong vò vẽ có nọc độc mạnh, phân bố rộng ở Đông Nam Á và đã được ghi nhận tại nhiều tỉnh ở Việt Nam như Hà Giang, Cao Bằng, Thái Nguyên, Nghệ An, Lâm Đồng. Nọc ong chứa nhiều enzyme, peptide và các phân tử nhỏ có hoạt tính sinh học đa dạng, trong đó mastoparan được xác định là thành phần quan trọng với tiềm năng ứng dụng trong y học, đặc biệt là kháng khuẩn và kháng ung thư.

Mục tiêu nghiên cứu là tinh chế peptide mastoparan từ nọc ong Vespa velutina thu thập tại Việt Nam, xác định trình tự amino acid và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của peptide này trên các chủng vi khuẩn chuẩn và đa kháng thuốc. Nghiên cứu được thực hiện trong giai đoạn 2020-2021 tại Hà Nội, nhằm góp phần phát triển các chất kháng sinh mới, đáp ứng nhu cầu cấp thiết trong điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn đa kháng thuốc, đồng thời mở rộng ứng dụng của peptide mastoparan trong y dược.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

  • Cấu trúc và hoạt tính của peptide mastoparan: Mastoparan là peptide lưỡng phần, cation, gồm 14 amino acid, có cấu trúc xoắn α lưỡng phần, giàu các gốc kỵ nước và lysine, tạo điều kiện cho sự tương tác với màng tế bào vi khuẩn, gây mất ổn định màng và tiêu diệt vi khuẩn.

  • Cơ chế tác động lên màng vi sinh vật: Các mô hình thẩm thấu màng như mô hình thảm (carpet model), mô hình thùng (barrel-stave model) và mô hình vòng xoắn (toroidal pore model) giải thích cách mastoparan tạo lỗ trên màng lipid kép của vi khuẩn, làm tăng tính thấm và gây chết tế bào.

  • Hoạt tính kháng khuẩn của peptide: Mastoparan thể hiện hoạt tính kháng khuẩn phổ rộng, bao gồm cả vi khuẩn gram dương, gram âm và các chủng đa kháng thuốc, với khả năng phối hợp tăng hiệu quả khi kết hợp với các kháng sinh truyền thống.

Các khái niệm chính bao gồm: peptide kháng khuẩn, cấu trúc xoắn α lưỡng phần, tương tác màng lipid kép, vi khuẩn đa kháng thuốc, và phương pháp tinh sạch peptide.

Phương pháp nghiên cứu

  • Nguồn dữ liệu và mẫu nghiên cứu: Nọc ong Vespa velutina cái được thu thập tại nhiều tỉnh Việt Nam, bảo quản ở -20°C. Các chủng vi khuẩn chuẩn và đa kháng thuốc được cung cấp từ Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương, Trung tâm Bệnh nhiệt đới Bệnh viện Bạch Mai và Viện Công nghệ Sinh học.

  • Phương pháp thu thập và tinh sạch peptide: Cơ quan nọc độc (ngòi và túi chứa nọc) được giải phẫu, chiết xuất protein/peptide bằng dung dịch acetonitrile 50% trong 3 giờ ở 4°C, ly tâm và làm khô bằng SpeedVac. Hỗn hợp peptide được tinh sạch bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC) với cột Luna C18, sử dụng gradient acetonitrile 5-60% chứa 0,1% TFA.

  • Xác định trình tự amino acid: Phân tích khối phổ MALDI-TOF/MS, phổ MS/MS được xử lý bằng phần mềm PEAK để nhận diện và xác định trình tự peptide mastoparan.

  • Tổng hợp peptide nhân tạo: Mastoparan được tổng hợp bằng phương pháp tổng hợp peptide pha rắn tự động sử dụng N-α F-moc amino acid, tinh sạch bằng RP-HPLC và xác nhận bằng khối phổ.

  • Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn: Phương pháp khoanh giấy khuếch tán trên môi trường thạch Muller-Hinton agar, thử nghiệm trên các chủng vi khuẩn gram dương, gram âm chuẩn và đa kháng thuốc. Mật độ vi khuẩn chuẩn hóa khoảng 10^6 CFU/mL, nồng độ peptide khác nhau được bổ sung trên giấy Whatman 6 mm, ủ 24 giờ ở 36±1°C, đo đường kính vùng ức chế (mm).

  • Xử lý số liệu: Dữ liệu được xử lý bằng Excel, trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± sai số chuẩn, các thí nghiệm lặp lại 3 lần để đảm bảo độ tin cậy.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

  1. Tinh sạch và nhận diện peptide mastoparan: Qua sắc ký RP-HPLC, 11 phân đoạn peptide được thu nhận, trong đó phân đoạn số 7 và 9 có diện tích đỉnh lớn nhất với độ hấp thụ UV lần lượt khoảng 1700 và 2000 mAu, cho thấy hàm lượng peptide cao. Phân tích MALDI-TOF/MS xác định hai phân đoạn này tương ứng với mastoparan-X và mastoparan-like peptide 12a, có khối lượng phân tử xấp xỉ 1444.4 Da.

  2. Trình tự amino acid của mastoparan: Phần mềm PEAK nhận diện trình tự peptide tương đồng với mastoparan từ các loài Vespa khác, khẳng định sự hiện diện của mastoparan trong nọc ong Vespa velutina thu thập tại Việt Nam.

  3. Hoạt tính kháng khuẩn của mastoparan tự nhiên: Mastoparan tinh sạch thể hiện khả năng ức chế sự phát triển của các chủng vi khuẩn gram dương và gram âm chuẩn như Escherichia coli, Shigella flexneri, Salmonella typhimurium và Staphylococcus aureus với đường kính vùng ức chế dao động từ 10 đến 22 mm, cho thấy hoạt tính kháng khuẩn rõ rệt.

  4. Hoạt tính kháng khuẩn của mastoparan tổng hợp trên vi khuẩn đa kháng thuốc: Peptide tổng hợp nhân tạo thể hiện hiệu quả ức chế các chủng vi khuẩn đa kháng thuốc như Salmonella spp kháng ampicillin, Klebsiella pneumoniae đa kháng thuốc, Acinetobacter baumannii đa kháng thuốc và MRSE với đường kính vùng ức chế từ 12 đến 20 mm, tương đương hoặc vượt trội so với một số kháng sinh truyền thống.

Thảo luận kết quả

Kết quả sắc ký và khối phổ cho thấy mastoparan từ nọc ong Vespa velutina Việt Nam có cấu trúc và trình tự amino acid tương đồng với các mastoparan đã được báo cáo từ các loài Vespa khác, khẳng định tính phổ biến và bảo tồn của peptide này trong chi Vespa. Hoạt tính kháng khuẩn của mastoparan được thể hiện rõ trên cả vi khuẩn chuẩn và đa kháng thuốc, phù hợp với các nghiên cứu trước đây cho thấy mastoparan có khả năng phá vỡ màng tế bào vi khuẩn qua cơ chế tương tác với lớp lipid kép, tạo lỗ và làm mất ổn định màng.

So sánh với các nghiên cứu quốc tế, hoạt tính của mastoparan thu được tương đương với các peptide mastoparan từ Vespa bicolor, Vespa tropica và Vespa affinis, đồng thời thể hiện ít độc tính tan huyết, phù hợp cho ứng dụng lâm sàng. Việc tổng hợp peptide nhân tạo cho phép kiểm soát chất lượng và tăng khả năng ứng dụng trong phát triển thuốc.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ sắc ký RP-HPLC thể hiện các peak phân đoạn peptide, biểu đồ khối phổ MALDI-TOF/MS minh họa khối lượng phân tử peptide, và bảng so sánh đường kính vùng ức chế kháng khuẩn giữa mastoparan và các kháng sinh đối chứng, giúp trực quan hóa hiệu quả kháng khuẩn.

Đề xuất và khuyến nghị

  1. Phát triển quy trình sản xuất peptide mastoparan tổng hợp quy mô lớn nhằm cung cấp nguồn nguyên liệu ổn định cho nghiên cứu và ứng dụng dược phẩm, với mục tiêu tăng sản lượng peptide lên khoảng 50 mg/mẻ trong vòng 12 tháng, do các viện nghiên cứu sinh học và công ty dược phẩm thực hiện.

  2. Nghiên cứu sâu về cơ chế tác động và độc tính peptide mastoparan trên các mô hình tế bào và động vật, nhằm đánh giá an toàn và hiệu quả, tiến hành trong 18 tháng tiếp theo bởi các trung tâm nghiên cứu sinh học phân tử.

  3. Thử nghiệm phối hợp mastoparan với các kháng sinh hiện có để tăng hiệu quả điều trị vi khuẩn đa kháng thuốc, giảm liều lượng thuốc và hạn chế tác dụng phụ, thực hiện trong 24 tháng với sự hợp tác giữa viện nghiên cứu và bệnh viện lâm sàng.

  4. Ứng dụng mastoparan trong phát triển thuốc điều trị các bệnh nhiễm trùng da và mô mềm tại các cơ sở y tế, với mục tiêu đưa sản phẩm thử nghiệm lâm sàng giai đoạn I trong vòng 3 năm, do các công ty dược phẩm và bệnh viện chuyên khoa phối hợp thực hiện.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

  1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành sinh học phân tử, sinh học thực nghiệm: Nghiên cứu cung cấp dữ liệu chi tiết về tinh sạch, xác định cấu trúc và hoạt tính peptide mastoparan, hỗ trợ phát triển đề tài liên quan đến peptide kháng khuẩn.

  2. Chuyên gia phát triển dược phẩm và công nghệ sinh học: Thông tin về quy trình tổng hợp peptide pha rắn và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn giúp thiết kế sản phẩm thuốc mới dựa trên peptide tự nhiên.

  3. Bác sĩ và nhà lâm sàng chuyên về bệnh truyền nhiễm: Kết quả nghiên cứu mở ra hướng điều trị mới cho các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn đa kháng thuốc, hỗ trợ lựa chọn liệu pháp phối hợp thuốc.

  4. Cơ quan quản lý và hoạch định chính sách y tế: Cung cấp cơ sở khoa học để đánh giá tiềm năng phát triển thuốc peptide kháng khuẩn, góp phần xây dựng chiến lược phòng chống kháng thuốc quốc gia.

Câu hỏi thường gặp

  1. Mastoparan là gì và tại sao nó quan trọng trong nghiên cứu kháng khuẩn?
    Mastoparan là peptide lưỡng phần gồm 14 amino acid, có khả năng tương tác và phá vỡ màng tế bào vi khuẩn, thể hiện hoạt tính kháng khuẩn phổ rộng. Nó được xem là ứng viên tiềm năng để phát triển thuốc kháng sinh mới, đặc biệt chống lại vi khuẩn đa kháng thuốc.

  2. Phương pháp tinh sạch mastoparan trong nghiên cứu này như thế nào?
    Peptide được chiết xuất từ nọc ong Vespa velutina bằng dung dịch acetonitrile 50%, sau đó tinh sạch bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC) với cột Luna C18, sử dụng gradient acetonitrile 5-60% chứa 0,1% TFA, đảm bảo thu được peptide tinh khiết phục vụ phân tích tiếp theo.

  3. Hoạt tính kháng khuẩn của mastoparan được đánh giá ra sao?
    Hoạt tính được xác định bằng phương pháp khoanh giấy khuếch tán trên môi trường thạch Muller-Hinton agar, đo đường kính vùng ức chế sự phát triển vi khuẩn sau 24 giờ ủ ở 36±1°C, so sánh với các kháng sinh đối chứng để đánh giá hiệu quả.

  4. Mastoparan có hiệu quả trên vi khuẩn đa kháng thuốc không?
    Nghiên cứu cho thấy mastoparan tổng hợp nhân tạo có khả năng ức chế các chủng vi khuẩn đa kháng thuốc như Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii và MRSE với đường kính vùng ức chế từ 12 đến 20 mm, chứng tỏ tiềm năng ứng dụng trong điều trị các bệnh nhiễm trùng khó chữa.

  5. Có những thách thức nào trong việc phát triển mastoparan thành thuốc?
    Các thách thức bao gồm chi phí tổng hợp peptide, độ ổn định và dược động học của peptide trong cơ thể, độc tính tiềm ẩn và khả năng phát triển kháng thuốc. Nghiên cứu sâu về cơ chế tác động và thử nghiệm lâm sàng là cần thiết để giải quyết các vấn đề này.

Kết luận

  • Đã tinh sạch và xác định thành công peptide mastoparan từ nọc ong Vespa velutina thu thập tại Việt Nam, với trình tự amino acid tương đồng các mastoparan đã biết.
  • Mastoparan thể hiện hoạt tính kháng khuẩn rõ rệt trên các chủng vi khuẩn chuẩn và đa kháng thuốc, mở ra hướng phát triển thuốc kháng sinh mới.
  • Phương pháp tổng hợp peptide pha rắn cho phép sản xuất mastoparan nhân tạo với chất lượng cao, phục vụ nghiên cứu và ứng dụng.
  • Nghiên cứu góp phần làm rõ cơ chế tác động của mastoparan lên màng vi khuẩn, hỗ trợ phát triển các liệu pháp điều trị hiệu quả.
  • Các bước tiếp theo bao gồm mở rộng quy mô sản xuất, đánh giá độc tính và thử nghiệm phối hợp thuốc để phát triển sản phẩm dược phẩm ứng dụng lâm sàng.

Khuyến khích các nhà nghiên cứu, chuyên gia y dược và cơ quan quản lý quan tâm, hợp tác phát triển các ứng dụng của mastoparan trong điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn đa kháng thuốc.