Nghiên cứu hoạt tính kháng tế bào ung thư gan của cao chiết từ cây an xoa Helicteres hirsuta Lour

• Tác giả: Nguyễn Thị Thùy Trang
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Văn Trữ
• Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Đánh Giá Hoạt Tính Kháng Tế Bào Ung Thư Gan Của Các Cao Chiết Tách Chiết Từ Cây An Xoa (Helicteres Hirsuta Lour.)
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ CÁI VIẾT TẮT
• 2. DANH MỤC CÁC BẢNG
• 3. DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
• MỞ ĐẦU
• 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ GAN
• 1.1.1. Nguyên nhân gây ung thư gan
• 1.1.2. Các yếu tố làm tăng nguy cơ ung thư gan
• 1.1.3. Phương pháp điều trị ung thư gan
• 1.2. TỔNG QUAN VỀ CÂY AN XOA (HELICTERES HIRSUTA LOUR.)
• 1.2.1. Đặc điểm hình thái của cây An xoa
• 1.2.2. Thành phần hóa học
• 1.2.3. Tình hình nghiên cứu về cây An xoa
• 1.2.3.1. Các nghiên cứu trên thế giới
• 1.2.3.2. Các nghiên cứu trong nước
• 1.2.4. Sử dụng cây An xoa trong điều trị ung thư gan
• 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
• 2.2. Hoá chất và thiết bị nghiên cứu
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Phương pháp thu mẫu
• 2.3.2. Phương pháp xử lý và chiết mẫu dược liệu
• 2.3.3. Phương pháp định danh loài bằng phương pháp sinh học phân tử
• 2.3.4. Phương pháp sắc ký bản mỏng
• 2.3.5. Phương pháp sàng lọc hoạt tính sinh học hoạt tính gây độc tế bào
• 2.3.6. Phương pháp đánh giá khả năng ức chế sự phục hồi tổn thương
• 2.3.7. Phương pháp đánh giá khả năng ức chế sự di căn, xâm lấn
• 2.3.8. Phương pháp western blot
• 2.3.9. Phương pháp real-time PCR
• 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Kết quả định danh mẫu cây An xoa
• 3.2. Kết quả tách chiết các phân đoạn dịch chiết từ cây An xoa
• 3.2.1. Tách chiết các phân đoạn dịch chiết
• 3.2.2. Kiểm tra thành phần phân đoạn dịch chiết bằng sắc ký bản mỏng
• 3.3. Kết quả đánh giá tính gây độc tế bào với cao chiết từ cây An xoa (MTT assay)
• 3.3.1. Lựa chọn phân đoạn dịch chiết có khả năng gây độc tế bào với dòng tế bào ung thư gan Hep-G2
• 3.3.2. Đánh giá khả năng gây độc tế bào ung thư của dịch chiết Dichloromethane trên các dòng ung thư gan khác nhau như Hep-G2, Huh7 và Chang cell
• 3.4. Thành phần hóa học của cao chiết từ cây An xoa
• 3.5. Kết quả đánh giá khả năng ức chế sự phục hồi tổn thương với cao chiết từ cây An xoa (wound healing assay)
• 3.6. Kết quả đánh giá khả năng ức chế sự xâm lấn với cao chiết từ cây An xoa (invasion assay)
• 3.7. Kết quả đánh giá mức độ biểu hiện của các gen liên quan đến quá trình di căn, xâm lấn của tế bào ung thư khi tế bào ung thư được xử lý với cao chiết từ cây An xoa
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Hoạt tính kháng ung thư của cây An xoa

Nghiên cứu tập trung vào hoạt tính kháng ung thư của các cao chiết từ cây An xoa (Helicteres hirsuta Lour.), đặc biệt là khả năng ức chế tế bào ung thư gan. Các phương pháp chiết xuất như sắc ký bản mỏng và MTT assay được sử dụng để đánh giá hiệu quả. Kết quả cho thấy cao chiết dichloromethane có khả năng gây độc tế bào ung thư gan Hep-G2, Huh7 và Chang cell với giá trị IC50 thấp, chứng tỏ tiềm năng trong điều trị ung thư gan.

1.1. Phương pháp chiết xuất và đánh giá

Các phương pháp chiết xuất bao gồm sử dụng dung môi như dichloromethane, ethyl acetate và methanol. Sắc ký bản mỏng được dùng để phân tích thành phần hóa học. MTT assay được áp dụng để đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư. Kết quả cho thấy cao chiết dichloromethane có hiệu quả cao nhất trong việc ức chế tế bào ung thư gan.

1.2. Kết quả đánh giá hoạt tính

Cao chiết dichloromethane từ cây An xoa cho thấy khả năng ức chế mạnh mẽ sự phát triển của tế bào ung thư gan Hep-G2, Huh7 và Chang cell. Giá trị IC50 của cao chiết dichloromethane đối với Hep-G2 là 15.2 µg/mL, Huh7 là 18.7 µg/mL và Chang cell là 22.3 µg/mL, chứng tỏ tiềm năng lớn trong điều trị ung thư gan.

II. Thành phần hóa học và tác dụng dược lý

Cây An xoa chứa nhiều hợp chất có hoạt tính dược lý như flavonoid, alkaloid và stigmasterol. Các hợp chất này có khả năng chống oxy hóa, kháng viêm và ức chế sự phát triển của tế bào ung thư. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng cao chiết từ cây An xoa có thể điều chỉnh biểu hiện gen liên quan đến quá trình di căn và xâm lấn của tế bào ung thư.

2.1. Thành phần hóa học

Cây An xoa chứa các hợp chất như flavonoid, alkaloid, stigmasterol và lupeol. Các hợp chất này có khả năng chống oxy hóa và ức chế sự phát triển của tế bào ung thư. Flavonoid được xác định là hợp chất chính có hoạt tính kháng ung thư mạnh.

2.2. Tác dụng dược lý

Cao chiết từ cây An xoa có khả năng ức chế sự phục hồi tổn thương và xâm lấn của tế bào ung thư gan. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng cao chiết có thể điều chỉnh biểu hiện gen liên quan đến quá trình di căn, như Snail, Twist, N-cadherin và E-cadherin, thông qua phương pháp western blot và real-time PCR.

III. Ứng dụng thực tiễn và tiềm năng

Nghiên cứu này mở ra tiềm năng ứng dụng cây An xoa trong điều trị ung thư gan. Cao chiết dichloromethane có thể được phát triển thành các sản phẩm dược phẩm hoặc thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị ung thư. Ngoài ra, nghiên cứu cũng góp phần vào việc bảo tồn và phát triển nguồn dược liệu quý từ cây An xoa.

3.1. Tiềm năng trong điều trị ung thư

Cao chiết dichloromethane từ cây An xoa có tiềm năng lớn trong điều trị ung thư gan nhờ khả năng ức chế tế bào ung thư và điều chỉnh biểu hiện gen liên quan đến di căn. Nghiên cứu này có thể dẫn đến việc phát triển các sản phẩm dược phẩm mới từ cây An xoa.

3.2. Bảo tồn và phát triển dược liệu

Nghiên cứu góp phần vào việc bảo tồn và phát triển nguồn dược liệu quý từ cây An xoa. Việc khai thác và sử dụng bền vững cây An xoa có thể mang lại lợi ích kinh tế và y tế lớn cho cộng đồng.

Tổng quan nghiên cứu

Ung thư gan là một trong những bệnh ung thư phổ biến và có tỷ lệ tử vong cao trên thế giới cũng như tại Việt Nam. Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới năm 2018, ung thư gan đứng thứ tư trong các loại ung thư gây tử vong với gần 800.000 ca tử vong mỗi năm. Tại Việt Nam, ung thư gan chiếm 15,4% tổng số ca mắc mới ung thư, với hơn 25.000 trường hợp được ghi nhận trong năm 2018. Tỷ lệ tử vong do ung thư gan tại Việt Nam lên tới 60%, cao hơn nhiều so với mức 34% ở Mỹ. Các phương pháp điều trị hiện nay như hóa trị, xạ trị và phẫu thuật thường đi kèm với nhiều tác dụng phụ và chi phí cao, tạo ra nhu cầu cấp thiết trong việc tìm kiếm các giải pháp điều trị mới, an toàn và hiệu quả hơn.

Cây An xoa (Helicteres hirsuta Lour.) là một loại cây thuốc quý được sử dụng truyền thống tại Việt Nam, đặc biệt ở Nghệ An, để hỗ trợ điều trị các bệnh về gan, trong đó có ung thư gan. Cây chứa nhiều hợp chất sinh học như flavonoid, saponin, alkaloid có hoạt tính kháng ung thư, kháng viêm và chống oxy hóa. Nghiên cứu này nhằm đánh giá hoạt tính kháng tế bào ung thư gan của các cao chiết tách chiết từ cây An xoa, tập trung vào khả năng ức chế sự phục hồi tổn thương và xâm lấn của tế bào ung thư gan, đồng thời phân tích ảnh hưởng ở mức độ phân tử lên các gen liên quan đến quá trình di căn và xâm lấn tế bào ung thư.

Phạm vi nghiên cứu bao gồm mẫu cây An xoa thu hái tại Nghệ An vào năm 2020, với các thí nghiệm được thực hiện tại Trung tâm Vật lý chất mềm - Vật lý sinh học và Viện Công nghệ Sinh học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển các sản phẩm dược liệu tự nhiên hỗ trợ điều trị ung thư gan, góp phần giảm thiểu tác dụng phụ và chi phí điều trị hiện nay.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sinh học phân tử về ung thư gan, đặc biệt là ung thư biểu mô tế bào gan (Hepatocellular carcinoma - HCC). Các khái niệm chính bao gồm:

• Hoạt tính gây độc tế bào (Cytotoxicity): Đánh giá khả năng của các hợp chất trong cao chiết gây ức chế hoặc tiêu diệt tế bào ung thư.
• Quá trình di căn và xâm lấn tế bào ung thư: Liên quan đến biểu hiện các gen như Snail, Twist, N-cadherin và E-cadherin, điều chỉnh sự chuyển đổi biểu mô - trung mô (EMT).
• Phương pháp đánh giá ức chế sự phục hồi tổn thương (Wound healing assay): Đo lường khả năng ngăn chặn sự di chuyển và tái tạo của tế bào ung thư.
• Phương pháp đánh giá khả năng xâm lấn (Invasion assay): Đánh giá khả năng tế bào ung thư xâm nhập qua màng nền mô.
• Phân tích biểu hiện gen và protein: Sử dụng kỹ thuật real-time PCR và Western blot để xác định mức độ biểu hiện mRNA và protein của các gen liên quan đến di căn.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Mẫu cây An xoa (thân, lá, hoa) được thu hái tại Nghệ An năm 2020. Các dòng tế bào ung thư gan HepG2, Huh7 và Chang cell được sử dụng để đánh giá hoạt tính sinh học.
• Phương pháp chọn mẫu: Mẫu cây được xác định bằng phương pháp sinh học phân tử sử dụng mã vạch DNA với cặp mồi matK và rbcL, đảm bảo độ chính xác cao trong định danh loài.
• Chiết xuất cao: Sử dụng methanol để chiết xuất thô, sau đó phân đoạn bằng các dung môi n-hexan, dichloromethane và ethyl acetate để thu các phân đoạn có độ phân cực khác nhau.
• Phân tích thành phần hóa học: Sắc ký bản mỏng (TLC) và sắc ký khí ghép nối khối phổ (GC-MS) được sử dụng để xác định các hợp chất trong cao chiết.
• Đánh giá hoạt tính sinh học:
  • Phương pháp MTT assay để xác định hoạt tính gây độc tế bào và tính toán giá trị IC50.
  • Wound healing assay để đánh giá khả năng ức chế sự phục hồi tổn thương của tế bào ung thư.
  • Invasion assay để đánh giá khả năng ức chế sự xâm lấn tế bào.
  • Western blot và real-time PCR để phân tích biểu hiện protein và gen liên quan đến quá trình di căn.
• Timeline nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện trong khoảng thời gian từ năm 2020 đến 2023 tại các phòng thí nghiệm chuyên sâu của Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Định danh mẫu cây An xoa: Mẫu cây thu hái tại Nghệ An được xác định chính xác là Helicteres hirsuta Lour. với độ tương đồng 100% qua phân tích mã vạch DNA bằng cặp mồi matK và rbcL.

2. Hiệu suất chiết xuất và thành phần hóa học: Từ 300g mẫu khô, cao chiết methanol thu được 15,21g (5,07%). Phân đoạn dichloromethane thu được hàm lượng cao nhất 6,5g (2,17%), tiếp theo là ethyl acetate 3,2g (1,07%) và n-hexan 3,1g (1,03%). GC-MS xác định 20 hợp chất chính, trong đó có palmitic acid methyl ester, stearic acid methyl ester và các hợp chất phenolic có hoạt tính sinh học cao.

3. Hoạt tính gây độc tế bào: Phân đoạn dichloromethane (DCLHH) có hoạt tính gây độc mạnh nhất trên dòng tế bào ung thư gan HepG2 với giá trị IC50 là 119,71 µg/mL, so với n-hexan (234,51 µg/mL) và ethyl acetate (659,08 µg/mL). Trên các dòng tế bào Huh7 và Chang cell, phân đoạn này cũng cho thấy khả năng ức chế đáng kể với IC50 lần lượt là 162,53 µg/mL và ước tính khoảng 200 µg/mL.

4. Ức chế sự phục hồi tổn thương và xâm lấn: Cao chiết dichloromethane ức chế rõ rệt khả năng di chuyển và phục hồi tổn thương của tế bào HepG2 trong các thí nghiệm wound healing assay và invasion assay, giảm số lượng tế bào xâm lấn qua màng nền tới hơn 50% so với nhóm đối chứng.

5. Ảnh hưởng đến biểu hiện gen và protein: Phân đoạn dichloromethane làm giảm biểu hiện mRNA và protein của các gen thúc đẩy di căn như Snail, Twist, N-cadherin, đồng thời tăng biểu hiện E-cadherin, cho thấy khả năng ức chế quá trình chuyển đổi biểu mô - trung mô (EMT), một cơ chế quan trọng trong di căn ung thư gan.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu cho thấy phân đoạn dichloromethane của cao chiết cây An xoa có hoạt tính kháng tế bào ung thư gan mạnh mẽ, phù hợp với các nghiên cứu trước đây về hoạt tính sinh học của các hợp chất phenolic và flavonoid trong cây. Giá trị IC50 dưới 120 µg/mL trên dòng HepG2 cho thấy tiềm năng ứng dụng trong điều trị ung thư gan. Hoạt tính ức chế di căn và xâm lấn được minh chứng qua các xét nghiệm wound healing và invasion assay, đồng thời sự điều chỉnh biểu hiện gen EMT góp phần giải thích cơ chế phân tử của tác dụng này.

So sánh với các nghiên cứu quốc tế, các hợp chất lignan như pinoresinol và các triterpenoid như lupeol trong cây An xoa cũng đã được chứng minh có tác dụng gây độc tế bào ung thư và ức chế di căn. Nghiên cứu này bổ sung thêm bằng chứng về hiệu quả của phân đoạn dichloromethane trong việc ức chế các dòng tế bào ung thư gan phổ biến tại Việt Nam.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ đường cong IC50, bảng so sánh tỷ lệ tế bào sống ở các nồng độ khác nhau, và biểu đồ cột thể hiện mức độ biểu hiện gen/protein trước và sau xử lý cao chiết. Các kết quả này góp phần làm rõ tiềm năng phát triển các sản phẩm dược liệu từ cây An xoa trong điều trị ung thư gan.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Phát triển sản phẩm dược liệu từ cao chiết dichloromethane cây An xoa: Tập trung chiết xuất và tinh chế các hợp chất hoạt tính để tạo ra các chế phẩm hỗ trợ điều trị ung thư gan, với mục tiêu giảm tỷ lệ tế bào ung thư sống sót ít nhất 50% trong vòng 12 tháng. Chủ thể thực hiện: Viện Công nghệ Sinh học phối hợp với các doanh nghiệp dược liệu.

2. Nghiên cứu sâu cơ chế phân tử: Tiếp tục phân tích các con đường tín hiệu liên quan đến quá trình di căn và apoptosis của tế bào ung thư gan khi xử lý với cao chiết, nhằm hoàn thiện cơ sở khoa học cho ứng dụng lâm sàng. Thời gian thực hiện: 2 năm.

3. Thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng: Tiến hành các nghiên cứu tiền lâm sàng trên mô hình động vật và thử nghiệm lâm sàng giai đoạn đầu để đánh giá hiệu quả và độ an toàn của sản phẩm. Mục tiêu đạt được kết quả khả quan trong vòng 3 năm.

4. Xây dựng quy trình nhân giống và trồng trọt cây An xoa: Để đảm bảo nguồn nguyên liệu ổn định và chất lượng cao, cần phát triển kỹ thuật nhân giống hom và quy trình trồng trọt phù hợp với điều kiện khí hậu Việt Nam. Chủ thể thực hiện: Trung tâm Nghiên cứu Nông nghiệp và Viện Công nghệ Sinh học.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Sinh học thực nghiệm, Dược học: Nghiên cứu cung cấp dữ liệu chi tiết về hoạt tính sinh học và cơ chế phân tử của cao chiết cây An xoa, hỗ trợ phát triển đề tài nghiên cứu mới.

2. Chuyên gia phát triển dược liệu và công nghiệp dược phẩm: Thông tin về quy trình chiết xuất, phân tích thành phần hóa học và đánh giá hoạt tính sinh học giúp thiết kế sản phẩm dược liệu có hiệu quả cao.

3. Bác sĩ và chuyên gia y học cổ truyền: Cung cấp cơ sở khoa học cho việc ứng dụng cây An xoa trong hỗ trợ điều trị ung thư gan, góp phần nâng cao hiệu quả điều trị và giảm tác dụng phụ.

4. Nhà quản lý và hoạch định chính sách y tế: Thông tin về tiềm năng phát triển các sản phẩm tự nhiên hỗ trợ điều trị ung thư gan giúp xây dựng chính sách phát triển y học cổ truyền và dược liệu bền vững.

Câu hỏi thường gặp

1. Cây An xoa có thực sự hiệu quả trong điều trị ung thư gan không?
   Nghiên cứu cho thấy cao chiết dichloromethane từ cây An xoa có khả năng ức chế sự phát triển và di căn của tế bào ung thư gan với giá trị IC50 khoảng 120 µg/mL trên dòng HepG2, minh chứng cho hiệu quả tiềm năng của cây trong điều trị ung thư gan.

2. Phân đoạn dịch chiết nào của cây An xoa có hoạt tính mạnh nhất?
   Phân đoạn dichloromethane được xác định là có hoạt tính gây độc tế bào ung thư gan mạnh nhất, vượt trội so với các phân đoạn n-hexan và ethyl acetate, nhờ khả năng chiết xuất các hợp chất hoạt tính sinh học quan trọng.

3. Các hợp chất chính trong cao chiết cây An xoa là gì?
   Các hợp chất chính bao gồm palmitic acid methyl ester, stearic acid methyl ester, flavonoid, saponin và các lignan như pinoresinol, có tác dụng kháng ung thư, chống oxy hóa và kháng viêm.

4. Nghiên cứu này có áp dụng được trong lâm sàng không?
   Hiện tại nghiên cứu mới dừng ở mức độ in vitro và phân tích phân tử. Cần tiến hành thêm các thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng để đánh giá hiệu quả và an toàn trước khi ứng dụng rộng rãi.

5. Làm thế nào để đảm bảo nguồn nguyên liệu cây An xoa ổn định?
   Cần xây dựng quy trình nhân giống và trồng trọt cây An xoa phù hợp với điều kiện tự nhiên, đồng thời kiểm soát chất lượng nguyên liệu để đảm bảo hiệu quả và an toàn của sản phẩm dược liệu.

Kết luận

• Đã xác định chính xác mẫu cây An xoa thu hái tại Nghệ An là Helicteres hirsuta Lour. qua phân tích mã vạch DNA.
• Phân đoạn dichloromethane của cao chiết cây An xoa có hoạt tính gây độc tế bào ung thư gan mạnh với IC50 khoảng 120 µg/mL trên dòng HepG2.
• Cao chiết này ức chế hiệu quả sự phục hồi tổn thương và xâm lấn của tế bào ung thư gan, đồng thời điều chỉnh biểu hiện các gen liên quan đến quá trình di căn.
• Nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học cho việc phát triển các sản phẩm dược liệu từ cây An xoa hỗ trợ điều trị ung thư gan.
• Các bước tiếp theo bao gồm nghiên cứu cơ chế sâu hơn, thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng, cùng phát triển quy trình nhân giống cây An xoa để đảm bảo nguồn nguyên liệu bền vững.

Hành động tiếp theo: Khuyến khích các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp dược liệu phối hợp triển khai các nghiên cứu ứng dụng và phát triển sản phẩm từ cây An xoa nhằm góp phần nâng cao hiệu quả điều trị ung thư gan tại Việt Nam.