Luận văn thạc sĩ: Nghiên cứu đặc điểm bacteriocin của vi khuẩn Lactobacillus plantarum UL487

Nghiên cứu đặc điểm bacteriocin của vi khuẩn Lactobacillus plantarum UL487 trong luận văn thạc sĩ HUS, góp phần vào lĩnh vực vi sinh vật học.

• Tác giả: Đồng Thị Hoàng Anh
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Quỳnh Uyển
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Nghiên cứu một số đặc điểm bacteriocin của vi khuẩn Lactobacillus plantarum UL487
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC VIẾT TẮT
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
• 1.1. Vi khuẩn lactic
• 1.2. Đặc trưng của vi khuẩn lactic
• 1.3. Đặc trưng di truyền của vi khuẩn lactic
• 1.4. Cơ chế tổng hợp của bacteriocin
• 1.5. Các đặc tính của bacteriocin
• 1.6. Bacteriocin từ vi khuẩn lactic
• 1.7. Một số phương pháp tinh sạch bacteriocin từ Lactobacillus plantarum
• 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum
• 2.2. Nguồn vi sinh vật
• 2.3. Môi trường, hóa chất và thiết bị
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.5. Nghiên cứu điều kiện thích hợp cho khả năng sinh tổng hợp bacteriocin
• 2.6. Một số tính chất của bacteriocin
• 2.7. Tinh sạch bacteriocin. Phương pháp nhân dòng gen
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Nghiên cứu điều kiện thích hợp cho khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của chủng vi khuẩn L.
• 3.2. Một số tính chất của bacteriocin từ chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum UL487
• 3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính bacteriocin
• 3.4. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính bacteriocin
• 3.5. Khảo sát khả năng kháng khuẩn của bacteriocin từ chủng L.
• 3.6. Tinh sạch bacteriocin sinh tổng hợp từ chủng Lactobacillus plantarum UL487
• 3.7. Tinh sạch trên hệ thống AKTA
• 3.8. Chương trình tinh sạch trên hệ thống HPLC
• 3.9. Nhân dòng và giải trình tự gen
• 3.10. Phát hiện các gen mã hóa cho bacteriocin từ chủng L.
• 3.11. Nhân dòng các gen trong chủng L.
• 3.12. Phân tích trình tự các gen và so sánh với các chủng Lactobacillus plantarum khác
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về bacteriocin của Lactobacillus plantarum UL487

Bacteriocin là các peptide kháng khuẩn được sản xuất bởi vi khuẩn, đặc biệt là các vi khuẩn lactic như Lactobacillus plantarum. Chúng có khả năng ức chế sự phát triển của các vi sinh vật gây bệnh, từ đó giúp bảo quản thực phẩm và nâng cao sức khỏe con người. Nghiên cứu về bacteriocin từ Lactobacillus plantarum UL487 đã chỉ ra rằng chúng có tiềm năng lớn trong việc ứng dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm và dược phẩm.

1.1. Đặc điểm sinh học của Lactobacillus plantarum

Lactobacillus plantarum là một trong những loài vi khuẩn lactic phổ biến, có khả năng sinh acid lactic từ carbohydrate. Chúng có hình dạng tế bào dạng que, Gram dương và không sinh bào tử. Đặc điểm nổi bật của chúng là khả năng sinh ra nitric oxide, giúp ngăn chặn sự phát triển của các vi sinh vật gây bệnh.

1.2. Vai trò của bacteriocin trong bảo quản thực phẩm

Bacteriocin từ Lactobacillus plantarum UL487 có khả năng ức chế nhiều loại vi khuẩn gây bệnh như Staphylococcus aureus và Listeria monocytogenes. Chúng được coi là một giải pháp tự nhiên an toàn cho việc bảo quản thực phẩm, thay thế cho các hóa chất độc hại.

II. Thách thức trong nghiên cứu bacteriocin từ Lactobacillus plantarum

Mặc dù bacteriocin có nhiều lợi ích, nhưng việc nghiên cứu và ứng dụng chúng vẫn gặp nhiều thách thức. Một trong những vấn đề chính là sự đa dạng về cấu trúc và hoạt tính của các loại bacteriocin, điều này làm cho việc tinh sạch và xác định hoạt tính trở nên phức tạp.

2.1. Khó khăn trong việc tinh sạch bacteriocin

Quá trình tinh sạch bacteriocin từ Lactobacillus plantarum UL487 thường gặp khó khăn do sự tương đồng về cấu trúc với các protein khác trong môi trường nuôi cấy. Việc sử dụng các phương pháp sắc ký hiện đại như HPLC là cần thiết để đạt được độ tinh khiết cao.

2.2. Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của bacteriocin

Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của bacteriocin cần phải thực hiện qua nhiều phương pháp khác nhau, bao gồm thử nghiệm khuếch tán và xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC). Điều này đòi hỏi sự chuẩn bị kỹ lưỡng và điều kiện thí nghiệm chính xác.

III. Phương pháp nghiên cứu bacteriocin từ Lactobacillus plantarum UL487

Nghiên cứu bacteriocin từ Lactobacillus plantarum UL487 được thực hiện thông qua nhiều phương pháp khác nhau, bao gồm nuôi cấy vi khuẩn, tinh sạch bacteriocin và phân tích gen. Các phương pháp này giúp xác định đặc điểm và hoạt tính của bacteriocin một cách chính xác.

3.1. Nuôi cấy và thu nhận bacteriocin

Việc nuôi cấy Lactobacillus plantarum UL487 được thực hiện trong môi trường thích hợp để tối ưu hóa khả năng sinh tổng hợp bacteriocin. Sau đó, dịch nuôi cấy được thu nhận và chuẩn bị cho các bước tinh sạch tiếp theo.

3.2. Tinh sạch bacteriocin bằng phương pháp sắc ký

Sắc ký là phương pháp chính được sử dụng để tinh sạch bacteriocin. Các bước sắc ký trao đổi ion và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) giúp loại bỏ các tạp chất và thu được bacteriocin với độ tinh khiết cao.

IV. Kết quả nghiên cứu bacteriocin từ Lactobacillus plantarum UL487

Kết quả nghiên cứu cho thấy bacteriocin từ Lactobacillus plantarum UL487 có hoạt tính kháng khuẩn mạnh mẽ đối với nhiều vi sinh vật gây bệnh. Các thí nghiệm đã chỉ ra rằng bacteriocin này có thể ức chế sự phát triển của các vi khuẩn như E. coli và Salmonella.

4.1. Hoạt tính kháng khuẩn của bacteriocin

Các thử nghiệm cho thấy bacteriocin từ Lactobacillus plantarum UL487 có khả năng ức chế sự phát triển của nhiều vi khuẩn gây bệnh, với nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) thấp. Điều này cho thấy tiềm năng ứng dụng của chúng trong bảo quản thực phẩm.

4.2. Ứng dụng thực tiễn trong ngành thực phẩm

Bacteriocin từ Lactobacillus plantarum UL487 có thể được ứng dụng trong sản xuất thực phẩm lên men, giúp kéo dài thời gian bảo quản và nâng cao chất lượng sản phẩm. Chúng cũng có thể được sử dụng như một chất phụ gia tự nhiên trong thực phẩm.

V. Kết luận và triển vọng nghiên cứu bacteriocin

Nghiên cứu về bacteriocin từ Lactobacillus plantarum UL487 mở ra nhiều triển vọng cho việc ứng dụng trong ngành thực phẩm và dược phẩm. Việc phát triển các phương pháp tinh sạch và đánh giá hoạt tính sẽ giúp nâng cao giá trị của bacteriocin trong tương lai.

5.1. Tương lai của nghiên cứu bacteriocin

Nghiên cứu về bacteriocin sẽ tiếp tục được mở rộng, với mục tiêu phát hiện và phát triển các loại bacteriocin mới từ các chủng vi khuẩn lactic khác. Điều này sẽ góp phần làm phong phú thêm nguồn nguyên liệu tự nhiên cho ngành công nghiệp thực phẩm.

5.2. Ứng dụng trong y học và sức khỏe

Bacteriocin không chỉ có tiềm năng trong ngành thực phẩm mà còn có thể được nghiên cứu để ứng dụng trong y học, giúp điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn. Việc phát triển các sản phẩm probiotic chứa bacteriocin sẽ mang lại lợi ích cho sức khỏe con người.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Tình trạng lạm dụng hóa chất bảo quản tổng hợp trong ngành công nghiệp thực phẩm chiếm tới hơn 65% các nguy cơ tiềm ẩn gây ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe cộng đồng. Trước thách thức đó, việc tìm kiếm các chất kháng khuẩn tự nhiên có nguồn gốc sinh học đang trở thành xu hướng nghiên cứu trọng tâm trên toàn cầu. Đề tài tập trung nghiên cứu sâu về đặc tính sinh học, khả năng kháng khuẩn và cấu trúc di truyền của bacteriocin sinh ra từ chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum UL487. Chủng vi khuẩn này được phân lập từ mẫu chao truyền thống tại Thừa Thiên Huế, lưu giữ tại Phòng Công nghệ Enzym và Protein thuộc Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội.

Mục tiêu cụ thể của luận văn bao gồm: tối ưu hóa các thông số nuôi cấy để thu nhận bacteriocin đạt hoạt tính cao nhất, khảo sát độ bền sinh hóa dưới tác động của nhiệt độ và thang pH, xác định phổ kháng khuẩn đối với 10 chủng vi sinh vật gây bệnh, thiết lập quy trình tinh sạch qua hệ thống sắc ký AKTA và HPLC, đồng thời nhân dòng và giải trình tự hai cụm gen mã hóa chủ đạo là plnA và plnEF. Nghiên cứu được thực hiện trong giai đoạn 2018 - 2020 trong khuôn khổ đề tài nghiên cứu nguồn gen vi khuẩn lactic bản địa do Bộ Khoa học và Công nghệ tài trợ. Kết quả thu được mang ý nghĩa khoa học và thực tiễn sâu sắc, cung cấp luận cứ sinh học phân tử vững chắc nhằm ứng dụng bacteriocin như một chất bảo quản sinh học thế hệ mới, có tiềm năng giảm thiểu từ 40% đến 50% lượng phụ gia hóa chất độc hại trong chế biến thực phẩm và dược phẩm.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn vận dụng lý thuyết về peptide kháng khuẩn tổng hợp trên ribosome (Ribosomally Synthesized Antimicrobial Peptides - RiPPs) từ vi khuẩn lactic (LAB). Khung phân loại bacteriocin quốc tế xếp các peptide từ Lactobacillus plantarum vào Lớp II (Non-lanthionine-containing bacteriocins), đặc trưng bởi kích thước phân tử nhỏ dưới 10 kDa, cấu trúc bền nhiệt và không trải qua các biến đổi hậu dịch mã phức tạp.

Mô hình nghiên cứu áp dụng lý thuyết điều hòa biểu hiện gen qua hệ thống dẫn truyền tín hiệu ba thành phần bao gồm: protein kinase cảm ứng màng (HPK), protein điều hòa đáp ứng phiên mã (RR) và peptide tín hiệu pheromone. Các khái niệm nền tảng được làm rõ gồm:

• Bacteriocin lớp IIb: Phức hợp kháng khuẩn hai peptide bổ trợ (PlnE 33 amino acid và PlnF 34 amino acid) tạo lỗ thủng điện sinh học trên màng tế bào đích.
• Peptide pheromone PlnA: Chuỗi 26 amino acid giữ vai trò cảm ứng hoạt hóa 5 operon tổng hợp bacteriocin (plnABCD, plnEFI, plnJKLR, plnMNOP, plnGHSTUV).
• Hoạt độ kháng khuẩn (AU/ml): Đại lượng định lượng hiệu lực ức chế vi sinh vật kiểm định qua nồng độ pha loãng bậc hai nhỏ nhất làm mất vòng kháng khuẩn.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng cỡ mẫu kiểm nghiệm chuẩn gồm 5 chủng vi khuẩn kiểm định (Micrococcus luteus IFO 12708, Lactococcus lactis subsp. lactis ATCC 1935, Lactobacillus sakei subsp. sakei JCM 1157, Pediococcus pentosaceus JCM 5885, Enterococcus faecalis JCM 5803T) và 10 chủng vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm (E. coli, S. aureus, Salmonella enterica, B. cereus, V. parahaemolyticus, P. aeruginosa,...). Phương pháp lấy mẫu là chọn lọc ngẫu nhiên từ nguồn vi khuẩn lactic bản địa phân lập từ chao Huế. Mọi thí nghiệm vật lý, sinh hóa và sinh học phân tử đều được tiến hành với 3 lần lặp lại độc lập nhằm đảm bảo độ tin cậy thống kê.

Phương pháp phân tích được lựa chọn dựa trên cơ sở khoa học chặt chẽ:

• Xác định hoạt tính sinh học: Dùng phương pháp khuếch tán giếng thạch đo đường kính vòng kháng khuẩn (mm) và xác định hoạt độ bacteriocin (AU/ml). Lý do lựa chọn là phương pháp này cho phép định lượng trực quan, nhanh chóng và chuẩn xác hoạt tính ức chế.
• Tinh sạch hai bước: Kết hợp sắc ký trao đổi cation HiTrap SP FF thể tích 1 ml trên hệ thống tự động AKTA và sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC) trên cột Semi C4 Dionex. Sự lựa chọn này dựa vào đặc tính tích điện dương (cationic) và tính chất kỵ nước của các chuỗi peptide bacteriocin, giúp loại bỏ tối đa tạp chất protein với tốc độ dòng 1 ml/phút đến 2 ml/phút.
• Định lượng protein: Áp dụng phương pháp Bradford đo quang ở bước sóng 595 nm với chuẩn Albumin huyết thanh bò nồng độ gốc 1 mg/ml.
• Kỹ thuật sinh học phân tử: Chiết tách DNA genome, khuếch đại gen đặc hiệu bằng phản ứng PCR với cặp mồi Pln A (sản phẩm 450 bp, Tm 53°C) và Pln EF (sản phẩm 430 bp, Tm 52.2°C), nhân dòng vào vector thương mại pGEM-T biến nạp vào tế bào khả biến Escherichia coli DH5α, giải trình tự nucleotide và phân tích bằng phần mềm BioEdit 7.0 cùng công cụ BLAST trên cơ sở dữ liệu GenBank.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình thực nghiệm đã thu được 4 nhóm kết quả cốt lõi với những số liệu định lượng chi tiết:

1. Điều kiện sinh tổng hợp tối ưu: Chủng L. plantarum UL487 đạt khả năng tổng hợp bacteriocin cao nhất sau 24 giờ nuôi cấy ở nhiệt độ 30°C trong môi trường MRS lỏng, tạo đường kính vòng kháng khuẩn đạt cực đại 6.5 mm đối với chủng kiểm định KĐ28. Khi kéo dài thời gian lên 48 giờ, hoạt tính ức chế giảm còn 88.35% và giảm sâu sau 72 giờ. Đáng chú ý, ở nhiệt độ 37°C, chủng vi khuẩn sinh trưởng nhưng hoàn toàn không sinh tổng hợp bacteriocin.
2. Hoạt độ kháng khuẩn vượt trội: Bacteriocin từ dịch nuôi cấy sau 48 giờ thể hiện hoạt độ kháng khuẩn rất cao, đạt 3200 AU/ml đối với Pediococcus pentosaceus JCM 5885 và 1600 AU/ml đối với Lactobacillus sakei JCM 1157. Hoạt độ kháng Micrococcus luteus đạt 800 AU/ml, trong khi Lactococcus lactis và Enterococcus faecalis đạt 400 AU/ml.
3. Độ bền nhiệt và khả năng thích ứng pH rộng: Khi xử lý ở nhiệt độ 100°C liên tục trong 60 phút, bacteriocin vẫn duy trì tới 98.93% hoạt tính kháng khuẩn ban đầu, và chỉ bị bất hoạt hoàn toàn khi hấp khử trùng ở 121°C trong 15 phút. Về độ bền pH, hoạt tính đạt cực đại ở pH 4.0 (vòng kháng khuẩn 10.2 mm), giữ được 87.12% ở pH 5.0, duy trì ổn định khoảng 77.00% trong khoảng pH từ 6.0 đến 8.0, và vẫn còn giữ được 68.45% hoạt tính tại môi trường kiềm pH 9.0.
4. Phổ ức chế vi khuẩn gây bệnh và đặc điểm gen: Dịch bacteriocin ức chế hiệu quả 5/10 chủng vi sinh vật gây bệnh, mạnh nhất trên tụ cầu vàng Staphylococcus aureus VTCCB 658 (vòng kháng khuẩn 7.8 mm), Bacillus cereus VTCCB 613, Acinetobacter baumannii VTCCB 823, Salmonella enterica VTCCB 480 và Vibrio parahaemolyticus VTCCB 652. Phân tích phân tử xác định thành công kích thước đoạn gen plnA 450 bp và plnEF 430 bp có độ tương đồng trên 99% với các trình tự chuẩn trên GenBank.

Thảo luận kết quả

Các dữ liệu nghiên cứu có thể được trực quan hóa tối ưu qua biểu đồ đường thể hiện động học suy giảm hoạt tính bacteriocin theo thời gian/nhiệt độ và bảng ma trận thể hiện phổ ức chế giữa các chủng vi sinh vật. Kết quả thực nghiệm khẳng định cơ chế điều hòa sinh tổng hợp của chủng UL487 phụ thuộc chặt chẽ vào nhiệt độ nuôi cấy. Việc mất hoàn toàn hoạt tính ở 37°C được giải thích do ở nhiệt độ cao, vi khuẩn chuyển dịch toàn bộ năng lượng sinh học cho quá trình duy trì sinh khối thay vì tổng hợp chất chuyển hóa thứ cấp.

Độ bền nhiệt lên tới 100°C trong 60 phút là bằng chứng xác thực cho cấu trúc peptide nhỏ, không chứa liên kết bậc ba phức tạp của nhóm non-lantibiotic. Đáng chú ý, khả năng hoạt động ổn định từ pH 4.0 đến pH 9.0 của chủng UL487 là một ưu thế vượt bậc, bởi phần lớn các nghiên cứu công bố trước đây chỉ ra rằng bacteriocin từ L. plantarum thường bị bất hoạt hoàn toàn khi môi trường chuyển sang kiềm (pH 7.0 - 9.0). Hoạt tính ức chế mạnh đối với Staphylococcus aureus và Vibrio parahaemolyticus mở ra tiềm năng to lớn trong việc kiểm soát các bệnh truyền nhiễm qua đường tiêu hóa và ngăn ngừa hiện tượng vi khuẩn kháng kháng sinh trong y học hiện đại.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các kết quả đạt được, luận văn đưa ra 4 nhóm khuyến nghị mang tính ứng dụng thực tiễn cao:

1. Phát triển chế phẩm bảo quản thực phẩm sinh học: Khuyến nghị các doanh nghiệp sản xuất thực phẩm ứng dụng chủng L. plantarum UL487 hoặc dịch chiết bacteriocin vào quy trình chế biến thịt lên men, thủy hải sản và rau quả đóng hộp. Mục tiêu là kéo dài thời hạn bảo quản thêm từ 30% đến 45% mà không làm biến đổi cảm quan, hoàn thành lộ trình thử nghiệm sản phẩm trong vòng 12 tháng do các trung tâm R&D ngành thực phẩm chủ trì.
2. Hoàn thiện quy trình công nghệ thu hồi và tinh sạch quy mô bán công nghiệp: Đề xuất các viện nghiên cứu kết hợp kỹ thuật siêu lọc qua màng 3 kDa với sắc ký trao đổi cation HiTrap SP FF nhằm nâng hiệu suất thu hồi peptide lên trên 75%, giảm giá thành tinh chế từ 20% đến 30% trong giai đoạn 2026 - 2027.
3. Biểu hiện tái tổ hợp cụm gen mã hóa bacteriocin: Khuyến nghị các phòng thí nghiệm công nghệ sinh học phân tử tiến hành tách dòng và biểu hiện cụm gen plnEF cùng peptide cảm ứng plnA trên hệ thống vi sinh vật chủ công nghiệp như Bacillus subtilis hoặc Pichia pastoris. Giải pháp này hướng tới mục tiêu tăng sản lượng bacteriocin lên gấp 10 lần so với nuôi cấy tự nhiên trong thời gian 18 tháng.
4. Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng và an toàn sinh học: Đề xuất Bộ Y tế phối hợp với Bộ Khoa học và Công nghệ ban hành quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về giới hạn sử dụng các chế phẩm bacteriocin tự nhiên thay thế chất bảo quản hóa học (như natri nitrit, kali sorbat), lộ trình ban hành trong vòng 24 tháng.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Luận văn là tài liệu chuyên khảo giá trị cho 4 nhóm đối tượng chính:

1. Nghiên cứu sinh và học viên cao học ngành Di truyền học, Vi sinh vật học và Công nghệ Sinh học: Cung cấp tài liệu tham khảo chi tiết về quy trình kỹ thuật tách chiết DNA, thiết kế mồi PCR, nhân dòng vector pGEM-T và phân tích cụm operon pln.
2. Kỹ sư công nghệ thực phẩm và chuyên gia R&D chế biến: Sử dụng làm cơ sở khoa học để thiết kế các quy trình bảo quản sinh học không gia nhiệt cho nông sản, đồ uống lên men và thực phẩm tươi sống.
3. Doanh nghiệp sản xuất dược phẩm và men vi sinh Probiotic: Ứng dụng nguồn gen chủng L. plantarum UL487 để tạo ra các dòng men tiêu hóa chất lượng cao, có khả năng ức chế vi khuẩn cơ hội trong đường ruột như tụ cầu vàng và trực khuẩn than.
4. Cán bộ quản lý an toàn thực phẩm và kiểm nghiệm sinh học: Tham khảo dữ liệu về phổ ức chế vi sinh vật gây bệnh để xây dựng các giải pháp kiểm soát ô nhiễm chéo trong chuỗi cung ứng thực phẩm.

Câu hỏi thường gặp

Bacteriocin từ chủng L. plantarum UL487 có thể chịu được nhiệt độ thanh trùng thực phẩm thông thường không? Có. Kết quả nghiên cứu chứng minh bacteriocin của chủng UL487 duy trì tới 98.93% hoạt tính sau khi xử lý ở 100°C trong suốt 60 phút. Do đó, peptide này hoàn toàn thích hợp để bổ sung vào các quy trình thanh trùng nhiệt độ cao trong thời gian ngắn (HTST) của ngành công nghiệp chế biến đồ hộp và đồ uống.

Tại sao bacteriocin UL487 có thể kháng được cả vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm? Cơ chế kháng khuẩn của bacteriocin UL487 dựa trên sự phối hợp của cặp peptide lưỡng tính PlnE và PlnF. Phức hợp này tích điện dương, dễ dàng liên kết với lipid mang điện tích âm trên màng tế bào của cả vi khuẩn Gram dương (S. aureus, B. cereus) lẫn Gram âm (A. baumannii, V. parahaemolyticus), tạo lỗ rỗng làm mất cân bằng ion nội bào.

Vì sao nhiệt độ nuôi cấy 30°C cho hoạt tính bacteriocin cao nhất trong khi 37°C không sinh tổng hợp? Ở 30°C, hệ thống điều hòa biểu hiện gen plnABCD được kích hoạt tối ưu nhờ sự tích lũy của peptide cảm ứng PlnA. Ở 37°C, tế bào vi khuẩn chịu áp lực nhiệt làm ức chế con đường truyền tín hiệu của histidine protein kinase, dẫn đến việc ngưng trệ quá trình phiên mã các operon tổng hợp bacteriocin.

Vai trò cốt lõi của gen plnA được xác định trong nghiên cứu là gì? Gen plnA mã hóa chuỗi tiền peptide 48 amino acid, sau khi cắt đoạn dẫn sẽ tạo thành peptide hoàn chỉnh 26 amino acid. Peptide này giữ chức năng kép: vừa là pheromone kích hoạt chuỗi phiên mã của toàn bộ hệ gen pln, vừa đóng vai trò như một peptide kháng khuẩn thứ cấp.

Hệ thống sắc ký AKTA qua cột HiTrap SP FF mang lại lợi ích gì so với phương pháp kết tủa muối? Cột trao đổi cation HiTrap SP FF khai thác điện tích dương đặc trưng của bacteriocin, cho phép phân tách chọn lọc cao với thể tích mẫu 8 ml và tốc độ dòng 1 ml/phút. Phương pháp này loại bỏ hiệu quả các protein tạp mà không làm mất hoạt tính sinh học như khi kết tủa bằng muối amoni sunfat.

Kết luận

• Chủng Lactobacillus plantarum UL487 từ chao Huế là nguồn gen bản địa quý giá với khả năng sinh tổng hợp bacteriocin đạt hoạt độ kháng khuẩn lên tới 3200 AU/ml.
• Điều kiện nuôi cấy tối ưu được xác định chuẩn xác tại 30°C trong thời gian 24 giờ trên môi trường MRS lỏng.
• Bacteriocin thể hiện độ bền sinh hóa vượt trội: giữ 98.93% hoạt tính ở 100°C/60 phút và hoạt động ổn định trên dải pH rộng từ 4.0 đến 9.0.
• Phổ kháng khuẩn rộng, ức chế mạnh 5/10 chủng gây bệnh nguy hiểm gồm S. aureus, B. cereus, A. baumannii, S. enterica và V. parahaemolyticus.
• Tinh sạch thành công qua hệ thống AKTA/HPLC và xác định chính xác trình tự hai cụm gen chức năng plnA (450 bp) và plnEF (430 bp).

Đóng góp quan trọng nhất của luận văn là đã hoàn thiện quy trình phân tích từ đặc tính sinh hóa đến cấu trúc di truyền của bacteriocin từ nguồn vi khuẩn lactic bản địa Việt Nam. Kế hoạch tiếp theo trong vòng 12 - 24 tháng tới là mở rộng quy mô thử nghiệm thực tế trên nền thực phẩm và phát triển công nghệ biểu hiện gen tái tổ hợp. Các nhà khoa học, chuyên gia công nghệ thực phẩm và doanh nghiệp quan tâm có thể khai thác trực tiếp dữ liệu luận văn để thúc đẩy các dự án bảo quản sinh học an toàn cho sức khỏe cộng đồng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG I – TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1. Vi khuẩn lactic Con người từ lâu đã biết chế biến các loại thức ăn chua (sữa chua, pho mát, muối dưa, muối cà.), thức ăn ủ chua cho gia súc để tăng thời gian bảo quản cũng như tăng hương vị cho sản phẩm. Cho đến những năm 80 của thế kỷ 18, vi khuẩn lactic mới được giới khoa học phát hiện và tập trung nghiên cứu. Năm 1780, nhà hóa học Thụy Điển Carl Wihelm Scheele lần đầu tiên tách được lactic acid từ sữa bò lên men chua gọi là “axit sữa”, nhưng mãi đến năm 1857, Louis Pasteur mới chứng minh được việc làm chua sữa là kết quả hoạt động của một nhóm vi khuẩn đặc biệt là vi khuẩn lactic.

Năm 1878, Joseph Lister phân lập thành công vi khuẩn lactic đầu tiên và đặt tên là Bacterium lactis (nay gọi là Streptococcus lactis). Đến nay, các nhà khoa học đã phân lập và nghiên cứu nhiều loại vi khuẩn lactic từ nhiều nguồn hữu cơ khác nhau trong tự nhiên: trong phân, rác, xác động vật, trong các sản phẩm muối chua, thậm chí trong niêm mạc đường tiêu hóa, âm đạo người và động vật. Ngoài ra, một số loài vi khuẩn lactic sống kí sinh trên cơ thể thực vật, hút các chất tiết từ mô cây [28,50,54]. Đặc trưng của vi khuẩn lactic 1.

Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic (lactic acid bacteria, LAB) là tên gọi chung của những vi khuẩn sinh lactic acid như là sản phẩm chính trong quá trình chuyển hóa carbohydrate. Do đặc tính chung này, các vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ Lactobacteriaceace mặc dù chúng không đồng nhất về mặt hình thái (bao gồm cả các vi khuẩn dạng que ngắn, que dài, lẫn các vi khuẩn hình cầu). Vi khuẩn lactic được đặc trưng bởi khả năng sinh lactic acid từ các loại đường khác nhau, cụ thể là Firmicutes và Firmicutes. Trong ngành Firmicutes, LAB thuộc bộ Lactobacillales và bao gồm các chi sau: Aerococcus, Alloiococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Symbiobacterium, Tetragenococcus, Vagococcus và Weissella.

Sinh vật thuộc các chi này đều có hàm lượng guanine-cytosine thấp (31- 49%). LAB trong ngành Actinobacteria chỉ bao gồm các loài Bifidobacterium [41]. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Vi khuẩn lactic có tế bào dạng hình cầu hoặc hình que, thành tế bào Gram dương, không di động, không sinh nội bào tử. Tuy nhiên, hiện nay người ta tìm thấy một số chủng trong họ vi khuẩn lactic có khả năng sinh nội bào tử.

Chúng thiếu khả năng tổng hợp cytochrome và porphyrin (các thành phần của chuỗi hô hấp) và do đó không thể tạo ra ATP do gradient proton. LAB chỉ có thể thu được ATP bằng cách lên men, thường là lên men đường. Vi khuẩn lactic không khử nitrate (NO3−), có phản ứng catalase âm tính, và kị khí tùy ý trừ một vài loài kị khí bắt buộc sống trong hệ tiêu hóa của con người. Bên cạnh lactic acid, các sản phẩm phụ khác bao gồm acetate, ethanol, CO2, formate và succinate cũng được tìm thấy [24].

Vi khuẩn lactic là những vi khuẩn đa khuyết dưỡng. Chúng dễ dàng chuyển hóa năng lượng các dạng đường đơn: glucose, fructose, maltose, galactose, mannose nhưng không có khả năng chuyển hóa các loại carbohydrate phức tạp như: tinh bột, hay dextrose. Bên cạnh đó, nguồn nitơ được sử dụng hiệu quả nhất là từ cao nấm men. Vitamin đóng vai trò là các coenzyme trong quá trình trao đổi chất của tế bào.

Vitamin cần cho vi khuẩn lactic chia thành 3 nhóm: vitamin thiết yếu, vitamin kích thích và vitamin không cần thiết. Vi khuẩn lactic cũng cần muối vô cơ như kali, phốt pho, lưu huỳnh, đặc biệt mangan giúp ngăn ngừa quá trình tự phân chia và ổn định cấu trúc tế bào. Vi khuẩn lactic đạt tăng trưởng tối ưu ở pH 5,5-5,8 và nhiệt độ là 15oC -50oC. Ở nhiệt độ 80oC, vi khuẩn lactic dễ bị tiêu diệt [58].

Lactobacillus là chi lớn nhất bao gồm khoảng 175 loài phân lập từ các nguồn khác đã được công bố. Phần lớn các loài (gần một phần ba trong số những nguồn được mô tả) đã được phân lập từ đường ruột người và động vật. Rau và các sản phẩm lên men từ rau củ quả (bao gồm dưa chua và kim chi, bột chua, v.) là nguồn phân lập Lactobacillus phong phú. Trong ấn bản thứ 2 cuốn Cẩm nang về hệ thống Vi khuẩn của Bergey (Kandler và Weiss 1986), nhiều loài Lactobacillus đã được liệt kê, và danh pháp được tổ chức lại thành ba nhóm: nhóm I (chủng lên men đồng hình bắt buộc), nhóm II (chủng lên men dị hình không bắt buộc), nhóm III (chủng lên men dị hình bắt buộc).

Dựa trên trình tự 16S rDNA, các nhóm chính là: (1) nhóm Lb. delbrueckii bao gồm chủ yếu là các loài lên men đồng hình; (2) nhóm Lb. 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] pediococcus, bao gồm các loài lên men đồng hình cũng như lên men dị hình bắt buộc và không bắt buộc; (3) nhóm Leuconostoc bao gồm một số loài lên men dị hình bắt buộc và sau đó được chia thành ba chi: Leuconostoc, Oenococcus và Weissella (Collins et al. Lactobacillus được ứng dụng nhiều trong công nghiệp chế biến và bảo quản sữa, pho mát, thịt, các chế phẩm probiotic [36].

Đặc điểm của vi khuẩn Lactobacillus plantarum Lactobacillus plantarum được đặt tên lần đầu tiên là Streptobacterium plantarum bởi nhà khoa học Orla-Jennsen vào năm 1919 và được thay tên là L. plantarum (1936) bởi Pederson. Ông là người đã mô tả loài này bằng các đặc trưng sinh hóa và hình thái. Các chủng thuộc nhóm này có hình dạng khuẩn lạc tròn, màu trắng sữa, tế bào có dạng hình que thường kết đôi hoặc hình chuỗi, bắt màu Gram dương, không sinh bào tử, sinh trưởng tốt trong điều kiện vi hiếu khí [37].

Tính đặc trưng duy nhất của Lactbacillus plantarum là khả năng dị hóa arginine, và sinh ra nitric oxide. Lactobacillus plantarum không có khả năng phân giải amino acid, ngoại trừ tyrosine và arginine. Chúng có đến 6 con đường chuyển hóa arginine khác nhau và đều sinh ra nitric oxide. Việc sinh ra nitric oxide giúp ngăn chặn các vi sinh vật gây bệnh như Candida abicans, Escherichia coli, Shigella, Helicobacter pylory, các amip và kí sinh trùng.

Lactobacillus plantarum ngăn chặn sự bám dính của E. coli tiết ra. Chúng quan trọng trong việc bảo vệ các chất chống vi sinh vật và chống lại một cách hiệu ủa các vi sinh vật gây bệnh nội bào và ngoại bào. Lactobacillus plantarum có khả năng giúp tiêu hóa các chất xơ có trong lúa mì,lúa mạch den và trong men bia.

Do đó, chúng cải thiện tốt những vấn đề tiêu hóa như đầy hơi, chướng bụng [45]. Ngoài ra còn có một số loài của chi Lactobacillus khác hư Lactobacillus paracasei, Lactobacillus sporogenes, Lactobacillus brevis, Lactobacillus lactis, đều có ích cho đường tiêu hóa [38]. Đặc trưng di truyền của vi khuẩn lactic 1. Bộ gen vi khuẩn lactic Bộ gen của Lactococcus lactis subsp.

lactis IL1403 được công bố vào năm 2001. Đây là đại diện đầu tiên được giải trình tự của bộ gen LAB. Kể từ đó hơn 75 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] bộ gen quan trọng của LAB trong lĩnh vực công nghiệp đã được giải trình tự, trong khi hơn 80 dự án giải trình tự bộ gen đang được tiến hành [33]. Bộ gen của LAB có hàm lượng GC thấp và phạm vi kích thước từ 1,3 đến 3,3 Mb.

Từ các bộ gen hoàn chỉnh được công bố khả năng sinh tổng hợp và trao đổi chất cũng như sự khác biệt tiến hóa của LAB đã được mô tả rõ hơn. Số lượng gen mã hóa protein được dự đoán trong LAB khác nhau từ khoảng 1,700 đến khoảng 2,800 gen. Nhiều LAB chứa một số plasmid, một số trong đó rất cần thiết cho sự tăng trưởng trong các môi trường cụ thể và có các gen sử dụng trong quá trình trao đổi chất, vận chuyển màng và sản xuất bacteriocin. Các gen được mã hóa từ plasmid trong LAB dao động từ 0% đến 4,8% tổng lượng gen [34].

Một số đặc điểm trình tự bộ gen của LAB được trình bày trong Bảng 1. Đặc trưng trình tự bộ gen LAB [33]. Kích Prophage Pseudo Loài thước bộ Plasmid Protein gene gen Lactobacillus acidophilus 0 1.9Mb 0 0 1864 NCFM Lactobacillus brevis ATCC 1 2.3Mb 2 49 2221 367 Lactobacillus casei ATCC 2 2.9Mb 1 82 2776 334 Lactobacillus delbrueckii 0 subsp.9Mb 0 533 1562 11842 Lactobacillus delbrueckii 0 subsp.9Mb 0 192 1725 BAA-365 Lactobacillus gasseri 1 1.9Mb 0 48 1763 ATCC 33323 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Lactobacillus johnsonii 2 1.9Mb 0 0 1821 NCC 533 Lactobacillus plantarum 2 3.3 3 42 3009 WCFS1 Lactobacillus reuteri F275 2.0Mb 0 39 1900 Lactobacillus sakei subsp.9Mb 0 0 1879 sakei 23k Lactobacillus salivarius 2 1. salivarius UCC118 Lactococcus lactis subsp.5Mb 0 82 2434 cremoris MG1363 Lactococcus lactis subsp.4Mb 5 144 2509 cremoris SK11 Lactococcus lactis subsp.3Mb 0 1 2321 lactis IL1403 Leuconostoc mesenteroides 1 subsp.0Mb 1 19 2009 ATCC8293 Oenococcus oeni PSU-1 1.8Mb 0 122 1701 0 Pediococcus pentosaceus 2 1.8Mb 0 20 1757 ATCC 25745 Streptococcusthermophilus 1 1.8Mb 0 0 1915 CNRZ1066 Streptococcusthermophilus 1 1.8Mb 2 206 1710 LMD-9 Streptococcus thermophilus 0 1.8Mb 0 0 1889 LMG 18311 Vi khuẩn lactic lên men carbohydrate để lấy năng lượng, sử dụng các nguồn carbon nội sinh làm chất nhận điện tử cuối cùng thay oxy thông qua quá trình 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] đường phân.

Các enzyme của quá trình đường phân là tương đồng giữa các thành viên trong nhóm vi khuẩn lactic. Những phân tích gần đây của bộ gen LAB chỉ ra rằng 13-17% tổng số gen mã hóa protein vận chuyển. Trong đó sự phân bố các gen liên quan tới vận chuyển và chuyển hóa các carbohydrate chiếm ưu thế trong bộ gen. Hệ thống phosphotransferase (PTS) phụ thuộc phosphoenolpyruvate (PEP) là cơ chế hấp thụ carbohydrate chiếm ưu thế trong chi Lactobacillus.

Bộ gen của những loài trong chi này mã hóa trung bình 20-30 kênh vận chuyển PTS, thêm vào một vài kênh vận chuyển cassette liên kết ATP (ABC) và permease. Đặc trưng này giúp vi khuẩn lactic chuyển hóa carbohydrate khác nhau từ môi trường [31,34]. Trong phần lớn các loài vi khuẩn lactic, amino acid được sử dụng trong một số chức năng sinh lý như kiểm soát pH nội bào hay khả năng chống lại áp lực từ môi trường. Con đường sinh tổng hợp amino acid ở hầu hết các loài LAB chưa hoàn chỉnh ở các mức độ khác nhau, ngoại trừ L.

Lactobacillus bù đắp những thiếu sót này bằng việc mã hóa số lượng lớn peptidase, amino acid permease và nhiều chất vận chuyển oligopeptide có thể hỗ trợ xử lý và thu hồi amino acid hiệu quả từ môi trường giàu dinh dưỡng [32]. Trong quá trình lên men, vi khuẩn lactic cũng sản sinh một số một số hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn như lactic acid, hydrogen peroxide, diacetyl, reuterin, bacteriocin.