CHƯƠNG I – TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1. Vi khuẩn lactic Con người từ lâu đã biết chế biến các loại thức ăn chua (sữa chua, pho mát, muối dưa, muối cà.), thức ăn ủ chua cho gia súc để tăng thời gian bảo quản cũng như tăng hương vị cho sản phẩm. Cho đến những năm 80 của thế kỷ 18, vi khuẩn lactic mới được giới khoa học phát hiện và tập trung nghiên cứu. Năm 1780, nhà hóa học Thụy Điển Carl Wihelm Scheele lần đầu tiên tách được lactic acid từ sữa bò lên men chua gọi là “axit sữa”, nhưng mãi đến năm 1857, Louis Pasteur mới chứng minh được việc làm chua sữa là kết quả hoạt động của một nhóm vi khuẩn đặc biệt là vi khuẩn lactic.
Năm 1878, Joseph Lister phân lập thành công vi khuẩn lactic đầu tiên và đặt tên là Bacterium lactis (nay gọi là Streptococcus lactis). Đến nay, các nhà khoa học đã phân lập và nghiên cứu nhiều loại vi khuẩn lactic từ nhiều nguồn hữu cơ khác nhau trong tự nhiên: trong phân, rác, xác động vật, trong các sản phẩm muối chua, thậm chí trong niêm mạc đường tiêu hóa, âm đạo người và động vật. Ngoài ra, một số loài vi khuẩn lactic sống kí sinh trên cơ thể thực vật, hút các chất tiết từ mô cây [28,50,54]. Đặc trưng của vi khuẩn lactic 1.
Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic (lactic acid bacteria, LAB) là tên gọi chung của những vi khuẩn sinh lactic acid như là sản phẩm chính trong quá trình chuyển hóa carbohydrate. Do đặc tính chung này, các vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ Lactobacteriaceace mặc dù chúng không đồng nhất về mặt hình thái (bao gồm cả các vi khuẩn dạng que ngắn, que dài, lẫn các vi khuẩn hình cầu). Vi khuẩn lactic được đặc trưng bởi khả năng sinh lactic acid từ các loại đường khác nhau, cụ thể là Firmicutes và Firmicutes. Trong ngành Firmicutes, LAB thuộc bộ Lactobacillales và bao gồm các chi sau: Aerococcus, Alloiococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Symbiobacterium, Tetragenococcus, Vagococcus và Weissella.
Sinh vật thuộc các chi này đều có hàm lượng guanine-cytosine thấp (31- 49%). LAB trong ngành Actinobacteria chỉ bao gồm các loài Bifidobacterium [41]. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Vi khuẩn lactic có tế bào dạng hình cầu hoặc hình que, thành tế bào Gram dương, không di động, không sinh nội bào tử. Tuy nhiên, hiện nay người ta tìm thấy một số chủng trong họ vi khuẩn lactic có khả năng sinh nội bào tử.
Chúng thiếu khả năng tổng hợp cytochrome và porphyrin (các thành phần của chuỗi hô hấp) và do đó không thể tạo ra ATP do gradient proton. LAB chỉ có thể thu được ATP bằng cách lên men, thường là lên men đường. Vi khuẩn lactic không khử nitrate (NO3−), có phản ứng catalase âm tính, và kị khí tùy ý trừ một vài loài kị khí bắt buộc sống trong hệ tiêu hóa của con người. Bên cạnh lactic acid, các sản phẩm phụ khác bao gồm acetate, ethanol, CO2, formate và succinate cũng được tìm thấy [24].
Vi khuẩn lactic là những vi khuẩn đa khuyết dưỡng. Chúng dễ dàng chuyển hóa năng lượng các dạng đường đơn: glucose, fructose, maltose, galactose, mannose nhưng không có khả năng chuyển hóa các loại carbohydrate phức tạp như: tinh bột, hay dextrose. Bên cạnh đó, nguồn nitơ được sử dụng hiệu quả nhất là từ cao nấm men. Vitamin đóng vai trò là các coenzyme trong quá trình trao đổi chất của tế bào.
Vitamin cần cho vi khuẩn lactic chia thành 3 nhóm: vitamin thiết yếu, vitamin kích thích và vitamin không cần thiết. Vi khuẩn lactic cũng cần muối vô cơ như kali, phốt pho, lưu huỳnh, đặc biệt mangan giúp ngăn ngừa quá trình tự phân chia và ổn định cấu trúc tế bào. Vi khuẩn lactic đạt tăng trưởng tối ưu ở pH 5,5-5,8 và nhiệt độ là 15oC -50oC. Ở nhiệt độ 80oC, vi khuẩn lactic dễ bị tiêu diệt [58].
Lactobacillus là chi lớn nhất bao gồm khoảng 175 loài phân lập từ các nguồn khác đã được công bố. Phần lớn các loài (gần một phần ba trong số những nguồn được mô tả) đã được phân lập từ đường ruột người và động vật. Rau và các sản phẩm lên men từ rau củ quả (bao gồm dưa chua và kim chi, bột chua, v.) là nguồn phân lập Lactobacillus phong phú. Trong ấn bản thứ 2 cuốn Cẩm nang về hệ thống Vi khuẩn của Bergey (Kandler và Weiss 1986), nhiều loài Lactobacillus đã được liệt kê, và danh pháp được tổ chức lại thành ba nhóm: nhóm I (chủng lên men đồng hình bắt buộc), nhóm II (chủng lên men dị hình không bắt buộc), nhóm III (chủng lên men dị hình bắt buộc).
Dựa trên trình tự 16S rDNA, các nhóm chính là: (1) nhóm Lb. delbrueckii bao gồm chủ yếu là các loài lên men đồng hình; (2) nhóm Lb. 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com pediococcus, bao gồm các loài lên men đồng hình cũng như lên men dị hình bắt buộc và không bắt buộc; (3) nhóm Leuconostoc bao gồm một số loài lên men dị hình bắt buộc và sau đó được chia thành ba chi: Leuconostoc, Oenococcus và Weissella (Collins et al. Lactobacillus được ứng dụng nhiều trong công nghiệp chế biến và bảo quản sữa, pho mát, thịt, các chế phẩm probiotic [36].
Đặc điểm của vi khuẩn Lactobacillus plantarum Lactobacillus plantarum được đặt tên lần đầu tiên là Streptobacterium plantarum bởi nhà khoa học Orla-Jennsen vào năm 1919 và được thay tên là L. plantarum (1936) bởi Pederson. Ông là người đã mô tả loài này bằng các đặc trưng sinh hóa và hình thái. Các chủng thuộc nhóm này có hình dạng khuẩn lạc tròn, màu trắng sữa, tế bào có dạng hình que thường kết đôi hoặc hình chuỗi, bắt màu Gram dương, không sinh bào tử, sinh trưởng tốt trong điều kiện vi hiếu khí [37].
Tính đặc trưng duy nhất của Lactbacillus plantarum là khả năng dị hóa arginine, và sinh ra nitric oxide. Lactobacillus plantarum không có khả năng phân giải amino acid, ngoại trừ tyrosine và arginine. Chúng có đến 6 con đường chuyển hóa arginine khác nhau và đều sinh ra nitric oxide. Việc sinh ra nitric oxide giúp ngăn chặn các vi sinh vật gây bệnh như Candida abicans, Escherichia coli, Shigella, Helicobacter pylory, các amip và kí sinh trùng.
Lactobacillus plantarum ngăn chặn sự bám dính của E. coli tiết ra. Chúng quan trọng trong việc bảo vệ các chất chống vi sinh vật và chống lại một cách hiệu ủa các vi sinh vật gây bệnh nội bào và ngoại bào. Lactobacillus plantarum có khả năng giúp tiêu hóa các chất xơ có trong lúa mì,lúa mạch den và trong men bia.
Do đó, chúng cải thiện tốt những vấn đề tiêu hóa như đầy hơi, chướng bụng [45]. Ngoài ra còn có một số loài của chi Lactobacillus khác hư Lactobacillus paracasei, Lactobacillus sporogenes, Lactobacillus brevis, Lactobacillus lactis, đều có ích cho đường tiêu hóa [38]. Đặc trưng di truyền của vi khuẩn lactic 1. Bộ gen vi khuẩn lactic Bộ gen của Lactococcus lactis subsp.
lactis IL1403 được công bố vào năm 2001. Đây là đại diện đầu tiên được giải trình tự của bộ gen LAB. Kể từ đó hơn 75 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com bộ gen quan trọng của LAB trong lĩnh vực công nghiệp đã được giải trình tự, trong khi hơn 80 dự án giải trình tự bộ gen đang được tiến hành [33]. Bộ gen của LAB có hàm lượng GC thấp và phạm vi kích thước từ 1,3 đến 3,3 Mb.
Từ các bộ gen hoàn chỉnh được công bố khả năng sinh tổng hợp và trao đổi chất cũng như sự khác biệt tiến hóa của LAB đã được mô tả rõ hơn. Số lượng gen mã hóa protein được dự đoán trong LAB khác nhau từ khoảng 1,700 đến khoảng 2,800 gen. Nhiều LAB chứa một số plasmid, một số trong đó rất cần thiết cho sự tăng trưởng trong các môi trường cụ thể và có các gen sử dụng trong quá trình trao đổi chất, vận chuyển màng và sản xuất bacteriocin. Các gen được mã hóa từ plasmid trong LAB dao động từ 0% đến 4,8% tổng lượng gen [34].
Một số đặc điểm trình tự bộ gen của LAB được trình bày trong Bảng 1. Đặc trưng trình tự bộ gen LAB [33]. Kích Prophage Pseudo Loài thước bộ Plasmid Protein gene gen Lactobacillus acidophilus 0 1.9Mb 0 0 1864 NCFM Lactobacillus brevis ATCC 1 2.3Mb 2 49 2221 367 Lactobacillus casei ATCC 2 2.9Mb 1 82 2776 334 Lactobacillus delbrueckii 0 subsp.9Mb 0 533 1562 11842 Lactobacillus delbrueckii 0 subsp.9Mb 0 192 1725 BAA-365 Lactobacillus gasseri 1 1.9Mb 0 48 1763 ATCC 33323 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Lactobacillus johnsonii 2 1.9Mb 0 0 1821 NCC 533 Lactobacillus plantarum 2 3.3 3 42 3009 WCFS1 Lactobacillus reuteri F275 2.0Mb 0 39 1900 Lactobacillus sakei subsp.9Mb 0 0 1879 sakei 23k Lactobacillus salivarius 2 1. salivarius UCC118 Lactococcus lactis subsp.5Mb 0 82 2434 cremoris MG1363 Lactococcus lactis subsp.4Mb 5 144 2509 cremoris SK11 Lactococcus lactis subsp.3Mb 0 1 2321 lactis IL1403 Leuconostoc mesenteroides 1 subsp.0Mb 1 19 2009 ATCC8293 Oenococcus oeni PSU-1 1.8Mb 0 122 1701 0 Pediococcus pentosaceus 2 1.8Mb 0 20 1757 ATCC 25745 Streptococcusthermophilus 1 1.8Mb 0 0 1915 CNRZ1066 Streptococcusthermophilus 1 1.8Mb 2 206 1710 LMD-9 Streptococcus thermophilus 0 1.8Mb 0 0 1889 LMG 18311 Vi khuẩn lactic lên men carbohydrate để lấy năng lượng, sử dụng các nguồn carbon nội sinh làm chất nhận điện tử cuối cùng thay oxy thông qua quá trình 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com đường phân.
Các enzyme của quá trình đường phân là tương đồng giữa các thành viên trong nhóm vi khuẩn lactic. Những phân tích gần đây của bộ gen LAB chỉ ra rằng 13-17% tổng số gen mã hóa protein vận chuyển. Trong đó sự phân bố các gen liên quan tới vận chuyển và chuyển hóa các carbohydrate chiếm ưu thế trong bộ gen. Hệ thống phosphotransferase (PTS) phụ thuộc phosphoenolpyruvate (PEP) là cơ chế hấp thụ carbohydrate chiếm ưu thế trong chi Lactobacillus.
Bộ gen của những loài trong chi này mã hóa trung bình 20-30 kênh vận chuyển PTS, thêm vào một vài kênh vận chuyển cassette liên kết ATP (ABC) và permease. Đặc trưng này giúp vi khuẩn lactic chuyển hóa carbohydrate khác nhau từ môi trường [31,34]. Trong phần lớn các loài vi khuẩn lactic, amino acid được sử dụng trong một số chức năng sinh lý như kiểm soát pH nội bào hay khả năng chống lại áp lực từ môi trường. Con đường sinh tổng hợp amino acid ở hầu hết các loài LAB chưa hoàn chỉnh ở các mức độ khác nhau, ngoại trừ L.
Lactobacillus bù đắp những thiếu sót này bằng việc mã hóa số lượng lớn peptidase, amino acid permease và nhiều chất vận chuyển oligopeptide có thể hỗ trợ xử lý và thu hồi amino acid hiệu quả từ môi trường giàu dinh dưỡng [32]. Trong quá trình lên men, vi khuẩn lactic cũng sản sinh một số một số hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn như lactic acid, hydrogen peroxide, diacetyl, reuterin, bacteriocin.