Nghiên Cứu Chỉ Tiêu Định Tính và Định Lượng Cao Đặc Xấu Hổ Tại Trường Đại Học Dược Hà Nội

Nghiên cứu chỉ tiêu định tính và định lượng cao đặc Xấu Hổ (Mimosa pudica L.) là một lĩnh vực quan trọng trong… 86 trang · Trường Đại Học Dược Hà Nội · 2024.

• Tác giả: Phùng Thị Lý
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Quỳnh Chi
• Trường học: Trường Đại Học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược Sĩ
• Đề tài: Xây Dựng Chỉ Tiêu Định Tính và Định Lượng Cao Đặc Xấu Hổ
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2024
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ CÂY XẤU HỔ
• 1.1. Tổng quan về cây Xấu hổ (Mimosa pudica L.)
• 1.2. Vị trí phân loại của Mimosa pudica L.
• 1.3. Đặc điểm thực vật, phân bố, sinh thái
• 1.3.1. Đặc điểm thực vật
• 1.3.2. Bộ phận dùng, thu hái, chế biến
• 1.4. Thành phần hóa học của cây Xấu hổ Mimosa pudica L.
• 1.4.1. Các hợp chất hữu cơ
• 1.4.2. Các hợp chất vô cơ
• 1.5. Sử dụng loài Mimosa pudica L trong y học cổ truyền
• 1.6. Tác dụng sinh học của cây Xấu hổ Mimosa pudica L và các hợp chất phân lập từ Xấu hổ
• 1.7. Một số quy định về chất lượng của cao thuốc
• 1.7.1. Phân loại cao chiết dược liệu
• 1.7.2. Một số hướng dẫn xây dựng chỉ tiêu định tính, định lượng cao chiết từ dược liệu và tiêu chuẩn chất lượng của cao thuốc
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Nguyên vật liệu nghiên cứu
• 2.3. Các trang thiết bị nghiên cứu
• 2.3.1. Hóa chất, dụng cụ
• 2.3.2. Trang thiết bị
• 2.4. Nội dung nghiên cứu
• 2.5. Phương pháp nghiên cứu
• 2.5.1. Xây dựng chỉ tiêu định tính cao đặc Xấu hổ
• 2.5.2. Xây dựng chỉ tiêu mô tả
• 2.5.3. Xây dựng chỉ tiêu định tính bằng phản ứng hóa học
• 2.5.4. Xây dựng chỉ tiêu định tính bằng sắc ký lớp mỏng
• 2.5.5. Xây dựng chỉ tiêu định lượng cao đặc Xấu hổ
• 2.5.5.1. Xây dựng chỉ tiêu định lượng Flavonoid toàn phần trong cao đặc Xấu hổ bằng phương pháp quang phổ hấp thụ UV-Vis
• 2.5.5.2. Xây dựng chỉ tiêu định lượng luteolin trong cao đặc Xấu hổ bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao
• 2.5.6. Phương pháp xử lí số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Kết quả xây dựng chỉ tiêu định tính cao đặc Xấu hổ
• 3.2. Kết quả chỉ tiêu mô tả
• 3.3. Kết quả chỉ tiêu định tính cao đặc Xấu hổ bằng phản ứng hóa học
• 3.4. Kết quả chỉ tiêu định tính cao đặc Xấu hổ bằng sắc kí lớp mỏng
• 3.5. Kết quả xây dựng chỉ tiêu định lượng cao đặc Xấu hổ
• 3.5.1. Kết quả chỉ tiêu định lượng flavonoid toàn phần trong cao đặc Xấu hổ bằng phương pháp quang phổ hấp thụ UV-Vis
• 3.5.2. Thẩm định tính thích hợp hệ thống
• 3.5.3. Kết quả chỉ tiêu định lượng luteolin trong cao đặc Xấu hổ bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
• 3.5.4. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng
• 3.5.5. Kết quả định lượng luteolin trong cao đặc Xấu hổ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về Nghiên cứu chỉ tiêu định tính và định lượng cao đặc Xấu Hổ

Nghiên cứu chỉ tiêu định tính và định lượng cao đặc Xấu Hổ (Mimosa pudica L.) là một lĩnh vực quan trọng trong y học cổ truyền và hiện đại. Cây Xấu Hổ được biết đến với nhiều tác dụng sinh học, bao gồm an thần, chống viêm và hỗ trợ điều trị hen phế quản. Việc xây dựng các chỉ tiêu này giúp đảm bảo chất lượng và hiệu quả của các chế phẩm từ cây Xấu Hổ. Nghiên cứu này không chỉ cung cấp thông tin về thành phần hóa học mà còn giúp xác định các tiêu chuẩn chất lượng cần thiết cho cao đặc Xấu Hổ.

1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố của cây Xấu Hổ

Cây Xấu Hổ là loại cây thân thảo, phân bố rộng rãi ở nhiều vùng nhiệt đới. Đặc điểm thực vật của cây bao gồm lá kép, hoa màu tím và quả hình ngôi sao. Cây thường mọc hoang ở ven đường và được sử dụng trong y học cổ truyền với nhiều tác dụng khác nhau.

1.2. Thành phần hóa học của cây Xấu Hổ

Nghiên cứu cho thấy cây Xấu Hổ chứa nhiều hợp chất hữu cơ như flavonoid, glycosid và alkaloid. Các hợp chất này có tác dụng sinh học đáng kể, đặc biệt là flavonoid như luteolin, có khả năng chống viêm và hỗ trợ điều trị hen phế quản.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu chỉ tiêu cao đặc Xấu Hổ

Mặc dù cây Xấu Hổ có nhiều ứng dụng trong y học, việc xây dựng chỉ tiêu định tính và định lượng cho cao đặc Xấu Hổ vẫn gặp nhiều thách thức. Các vấn đề như sự biến đổi chất lượng do điều kiện môi trường, phương pháp chiết xuất không đồng nhất và thiếu tiêu chuẩn hóa trong quy trình sản xuất là những yếu tố cần được giải quyết. Điều này đòi hỏi sự nghiên cứu kỹ lưỡng và áp dụng các phương pháp hiện đại để đảm bảo chất lượng sản phẩm.

2.1. Thách thức trong việc xác định chỉ tiêu định tính

Việc xác định chỉ tiêu định tính cho cao đặc Xấu Hổ gặp khó khăn do sự đa dạng về thành phần hóa học. Các phương pháp như sắc ký lớp mỏng (TLC) và phản ứng hóa học cần được tối ưu hóa để đảm bảo độ chính xác và độ nhạy cao.

2.2. Vấn đề trong định lượng các hợp chất hoạt tính

Định lượng các hợp chất hoạt tính như flavonoid trong cao đặc Xấu Hổ cần sử dụng các phương pháp hiện đại như sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Tuy nhiên, việc chuẩn bị mẫu và điều kiện phân tích có thể ảnh hưởng đến kết quả, đòi hỏi quy trình chuẩn hóa nghiêm ngặt.

III. Phương pháp nghiên cứu chỉ tiêu định tính cao đặc Xấu Hổ

Phương pháp nghiên cứu chỉ tiêu định tính cho cao đặc Xấu Hổ bao gồm nhiều kỹ thuật khác nhau. Các phương pháp này không chỉ giúp xác định sự hiện diện của các hợp chất mà còn đánh giá chất lượng của sản phẩm. Việc áp dụng các phương pháp hiện đại như sắc ký và phản ứng hóa học sẽ giúp nâng cao độ tin cậy của kết quả nghiên cứu.

3.1. Phương pháp sắc ký lớp mỏng TLC

Sắc ký lớp mỏng (TLC) là một trong những phương pháp phổ biến để xác định các hợp chất trong cao đặc Xấu Hổ. Phương pháp này cho phép phân tích nhanh chóng và hiệu quả, giúp nhận diện các thành phần chính trong mẫu.

3.2. Phương pháp phản ứng hóa học

Phản ứng hóa học được sử dụng để xác định sự hiện diện của các hợp chất hoạt tính trong cao đặc Xấu Hổ. Các phản ứng tạo màu hoặc kết tủa sẽ giúp nhận diện nhanh chóng và chính xác các thành phần cần thiết.

IV. Phương pháp định lượng cao đặc Xấu Hổ

Để đảm bảo chất lượng cao đặc Xấu Hổ, việc định lượng các hợp chất hoạt tính như flavonoid là rất quan trọng. Các phương pháp hiện đại như quang phổ hấp thụ UV-Vis và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) được áp dụng để xác định hàm lượng chính xác của các hợp chất này. Điều này không chỉ giúp kiểm soát chất lượng mà còn đảm bảo hiệu quả điều trị của sản phẩm.

4.1. Định lượng flavonoid toàn phần

Phương pháp quang phổ hấp thụ UV-Vis được sử dụng để định lượng flavonoid toàn phần trong cao đặc Xấu Hổ. Phương pháp này cho phép xác định hàm lượng flavonoid một cách nhanh chóng và chính xác.

4.2. Định lượng luteolin bằng HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp chính để định lượng luteolin trong cao đặc Xấu Hổ. Phương pháp này giúp phân tích chính xác hàm lượng luteolin, từ đó đánh giá chất lượng sản phẩm.

V. Ứng dụng thực tiễn và kết quả nghiên cứu chỉ tiêu cao đặc Xấu Hổ

Kết quả nghiên cứu chỉ tiêu định tính và định lượng cao đặc Xấu Hổ đã cho thấy nhiều ứng dụng thực tiễn trong y học. Các chỉ tiêu này không chỉ giúp đảm bảo chất lượng sản phẩm mà còn hỗ trợ trong việc phát triển các chế phẩm từ cây Xấu Hổ. Nghiên cứu cũng đã chỉ ra rằng cao đặc Xấu Hổ có thể được sử dụng hiệu quả trong điều trị hen phế quản và các bệnh lý khác.

5.1. Ứng dụng trong y học cổ truyền

Cao đặc Xấu Hổ được sử dụng trong nhiều bài thuốc cổ truyền với tác dụng an thần và chống viêm. Nghiên cứu đã chứng minh hiệu quả của cao đặc trong việc hỗ trợ điều trị các bệnh lý như hen phế quản và viêm gan.

5.2. Kết quả nghiên cứu và triển vọng

Kết quả nghiên cứu cho thấy cao đặc Xấu Hổ có hàm lượng flavonoid cao, mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe. Triển vọng trong việc phát triển các chế phẩm từ cây Xấu Hổ là rất lớn, đặc biệt trong lĩnh vực dược phẩm.

VI. Kết luận và tương lai của nghiên cứu chỉ tiêu cao đặc Xấu Hổ

Nghiên cứu chỉ tiêu định tính và định lượng cao đặc Xấu Hổ đã mở ra nhiều hướng đi mới trong việc phát triển các sản phẩm từ cây Xấu Hổ. Việc xây dựng các tiêu chuẩn chất lượng là cần thiết để đảm bảo hiệu quả và an toàn cho người sử dụng. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị cho y học cổ truyền và hiện đại.

6.1. Tầm quan trọng của việc xây dựng tiêu chuẩn

Việc xây dựng tiêu chuẩn cho cao đặc Xấu Hổ là rất quan trọng để đảm bảo chất lượng và hiệu quả của sản phẩm. Các tiêu chuẩn này sẽ giúp kiểm soát chất lượng và nâng cao độ tin cậy trong sử dụng.

6.2. Hướng nghiên cứu trong tương lai

Hướng nghiên cứu trong tương lai cần tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình chiết xuất và phát triển các chế phẩm mới từ cây Xấu Hổ. Điều này sẽ giúp nâng cao giá trị dược liệu và mở rộng ứng dụng trong y học.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Cây Xấu hổ (Mimosa pudica L.), thuộc họ Đậu (Fabaceae), phân họ Trinh nữ (Mimosoideae), là loài thực vật thân thảo phân bố phổ biến tại nhiều vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, trong đó có Việt Nam. Trong y học cổ truyền, Xấu hổ thường được sử dụng làm thuốc an thần, làm dịu cơn đau, hạ nhiệt, tiêu viêm, lợi tiểu và trị chứng mất ngủ, suy nhược thần kinh. Các nghiên cứu dược lý hiện đại ghi nhận dịch chiết Xấu hổ có khả năng ức chế co thắt phế quản do histamin gây ra (hiệu lực tương đương diphenhydramin và aminophyllin), ức chế phù phổi và giảm sự xâm nhập của tế bào lympho, bạch cầu ái toan trong mô hình gây viêm phổi thực nghiệm. Nhóm hoạt chất chính chịu trách nhiệm cho các tác dụng sinh học này là flavonoid, tiêu biểu như luteolin, isoorientin và apigenin, vốn đã được chứng minh có khả năng làm giảm giải phóng các cytokin tiền viêm (IL-4, IL-5, IL-13), điều hòa phản ứng miễn dịch và hỗ trợ điều trị hen phế quản.

Để ứng dụng nguồn dược liệu này vào sản xuất các chế phẩm điều trị hiện đại, quy trình chiết xuất tối ưu hóa flavonoid đã được nghiên cứu nhằm tạo ra cao đặc Xấu hổ làm bán thành phẩm. Tuy nhiên, nhằm bảo đảm tính an toàn, hiệu quả và độ ổn định giữa các lô sản xuất, việc chuẩn hóa tiêu chuẩn chất lượng cao chiết là điều kiện bắt buộc. Xuất phát từ nhu cầu đó, khóa luận tốt nghiệp dược sĩ của tác giả Phùng Thị Lý thực hiện đề tài "Xây dựng chỉ tiêu định tính và định lượng cao đặc Xấu hổ" tại Bộ môn Dược liệu, Trường Đại học Dược Hà Nội (năm 2024).

Đề tài đặt ra 2 mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

1. Xây dựng một số chỉ tiêu định tính cao đặc Xấu hổ: Cảm quan, định tính bằng phản ứng hóa học, định tính bằng sắc ký lớp mỏng (TLC).
2. Xây dựng một số chỉ tiêu định lượng cao đặc Xấu hổ: Định lượng flavonoid toàn phần bằng quang phổ hấp thụ UV-Vis, định lượng luteolin trong cao đặc Xấu hổ bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

Đối tượng nghiên cứu là 10 mẫu dược liệu Xấu hổ (Mimosa pudica L.), ký hiệu từ MP1 đến MP10, được thu hái vào tháng 7/2023 dọc tuyến đê thuộc huyện Thanh Trì, thành phố Hà Nội (tiêu bản lưu tại Trường Đại học Dược Hà Nội dưới mã số HNIP/18722/23). Ngoài ra, nghiên cứu sử dụng mẫu Xấu hổ thân xanh (Mimosa diplotricha C. Wright ex Sa.) làm đối tượng so sánh nhằm thẩm tra tính đặc hiệu và khả năng phân biệt dược liệu nhầm lẫn. Phạm vi thực nghiệm được triển khai từ năm 2023 đến 2024 tại phòng thí nghiệm Bộ môn Dược liệu.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và tiêu chuẩn quy chuẩn của đề tài dựa trên các quy định về kiểm soát chất lượng cao thuốc trong Dược điển Việt Nam V (DĐVN V), Dược điển Châu Âu phiên bản 11.0 (Ph. Eur. 11.0), Dược điển Mỹ, Dược điển Trung Quốc cùng hướng dẫn thẩm định phương pháp phân tích của Hiệp hội các nhà hóa học phân tích chính thức (AOAC). Về mặt phân loại, cao đặc Xấu hổ được định vị là dạng cao chiết trung gian cần kiểm soát độ ẩm (không quá 20%), đồng thời áp dụng phương pháp chuẩn hóa chất lượng thông qua chất đánh dấu phân tích (analytical marker) và chất đánh dấu hoạt tính (activity marker).

Quy trình điều chế mẫu cao thử nghiệm được chuẩn hóa từ nghiên cứu tối ưu hóa chiết xuất trước đó: Cân 50,0 g bột dược liệu (qua rây 1400), chiết hồi lưu 2 lần với ethanol 90% theo tỷ lệ dung môi : dược liệu là 7,5 : 1 (375 ml/lần), thời gian chiết 1 giờ/lần. Dịch chiết sau lọc hút qua phễu Buchner được cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm bằng máy cô quay chân không ở 50–60°C, tiếp tục cô cách thủy ở 80°C và sấy chân không ở 60°C đến khi đạt thể chất cao đặc quy định. Mỗi mẫu dược liệu từ MP1 đến MP10 được chiết độc lập 3 lần để thu các mẻ cao đặc đối chứng.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm bao gồm:

• Phương pháp cảm quan: Đánh giá thể chất, màu sắc và độ đồng nhất của khối cao đặc.
• Phương pháp hóa học: Thực hiện các phản ứng định tính nhóm flavonoid (phản ứng với dung dịch NaOH 10%, phản ứng với dung dịch FeCl3 5%, phản ứng Cyanidin với bột Mg kim loại và HCl đặc) và nhóm phytosterol (phản ứng Lieberman-Burchard với anhydrid acetic và acid sulfuric đặc). Đồng thời thực hiện phản ứng đóng/mở vòng lacton của nhóm coumarin nhằm phân biệt với loài Mimosa diplotricha.
• Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC): Thực hiện trên bản mỏng silicagel GF254 (Merck), hoạt hóa ở 105°C trong 1 giờ. Hệ pha động khai triển gồm ethyl acetat – acid acetic – acid formic – nước (tỷ lệ thể tích 10 : 0,3 : 0,3 : 0,1). Thuốc thử hiện màu là hỗn hợp diphenylboryloxyethylamine và polyethylene glycol-4000 (NP/PEG), phát hiện dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm và 366 nm trên hệ thống CAMAG TLC Visualiser. Chất chuẩn đối chiếu gồm luteolin và luteolin-6-C-glycosid (isoorientin).
• Phương pháp quang phổ UV-Vis định lượng flavonoid toàn phần: Dựa trên phản ứng tạo phức màu giữa flavonoid và dung dịch nhôm clorid (AlCl3 2%), đo độ hấp thụ quang tại bước sóng cực đại 421 nm, tính hàm lượng quy về luteolin chuẩn.
• Phương pháp HPLC-DAD định lượng luteolin: Xử lý mẫu thử qua hệ thống chiết pha rắn (SPE C18, 500 mg/6 ml, Agilent) nhằm loại tạp chất trước khi tiêm sắc ký. Thiết bị phân tích là hệ thống HPLC Shimadzu (Nhật Bản) gồm bơm LC-20AD, đầu dò DAD SPD-M20A, cột pha đảo Shim-pack GIST C18 (250 mm × 4,6 mm; 5 µm). Pha động gồm acetonitril (kênh A) và dung dịch acid formic 0,1% (kênh B), chạy theo chương trình gradient nồng độ trong 70 phút; tốc độ dòng 0,5 ml/phút; thể tích tiêm 20 µl; bước sóng phát hiện 347 nm.
• Xử lý số liệu thống kê: Dữ liệu phân tích được xử lý bằng phần mềm SPSS phiên bản 16.0. Các biến số định lượng được kiểm định phân bố chuẩn bằng phép thử Shapiro-Wilk (với mức ý nghĩa p > 0,05). Giới hạn kiểm soát chất lượng đề xuất được tính toán trên cơ sở khoảng tin cậy 99,7% (tương ứng $\bar{X} \pm 3SD$).

---

Nội dung chính theo từng chương

Tổng quan về cây Xấu hổ (Mimosa pudica L.) và một số quy định về chất lượng của cao thuốc

Chương này trình bày hệ thống phân loại thực vật của A. Takhtajan xếp Mimosa pudica L. vào giới Plantae, ngành Magnoliophyta, họ Fabaceae, phân họ Mimosoideae. Đặc điểm hình thái đặc trưng gồm thân có gai móc, lá kép lông chim 2 lần cụp lại khi va chạm, cuống phụ xếp hình chân vịt mang 15–20 đôi lá chét, cụm hoa hình đầu màu tím hồng, quả giáp có lông cứng ở mép tụ thành hình sao. Nghiên cứu tổng hợp các dữ liệu hóa thực vật đã xác định Xấu hổ chứa sterol ($\beta$-sitosterol, $\alpha$-spinasterol, stigmastanol), alkaloid mimosin, acid hữu cơ, selen vô cơ và đặc biệt là nhóm flavonoid phong phú gồm các dạng aglycon (quercetin, luteolin, fisetin, apigenin) cùng các dạng C-glycosid và O-glycosid (isoorientin, orientin, vitexin, isovitexin, echinaticin).

Về tác dụng sinh học, tổng quan luận giải cơ chế kháng viêm phế quản và chống hen của các flavonoid chính: luteolin ức chế sự giải phóng các cytokin Th2 (IL-4, IL-5, IL-13), giảm biểu hiện IL-36$\gamma$ qua con đường MAPK, ức chế quá trình tự thực bào qua phức hợp Beclin1-PI3KC3; apigenin ức chế tế bào Th17 và phản ứng Th2; isoorientin điều hòa con đường tín hiệu Nrf2/HO-1 và NF-$\kappa$B. Về tiêu chuẩn chất lượng, chương tổng quan phân tích quy chuẩn DĐVN V và Ph. Eur. 11.0 về các chỉ tiêu cao thuốc (thể chất, độ tan, độ ẩm, hàm lượng cồn tồn dư, giới hạn kim loại nặng, dư lượng thuốc bảo vệ thực vật, giới hạn nhiễm khuẩn), nhấn mạnh vai trò của việc lựa chọn chất đánh dấu đặc trưng trong kiểm nghiệm dược liệu.

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết nguồn gốc 10 mẫu dược liệu Mimosa pudica L. thu thập tại đê Thanh Trì (Hà Nội), quy trình xử lý nguyên liệu (cắt đoạn 5 cm, loại tạp, sấy 8 giờ ở 60°C, nghiền qua rây 1400) và quy trình điều chế cao đặc bằng cồn 90%. Bảng số liệu khối lượng cao thu được từ 50,0 g dược liệu khô của 10 mẫu dao động trong khoảng từ 5,8415 g đến 8,3477 g.

Chương này xác lập danh mục hóa chất, dung môi phân tích đạt chuẩn sắc ký và hệ thống trang thiết bị chuyên dụng (hệ thống CAMAG HPTLC, hệ thống HPLC Shimadzu, bộ chiết pha rắn SPE). Đồng thời, chương 2 thiết kế chi tiết các bước tiến hành thực nghiệm định tính (cảm quan, phản ứng hóa học, sắc ký lớp mỏng) và định lượng (UV-Vis và HPLC-DAD). Nội dung thẩm định phương pháp định lượng HPLC được xây dựng nghiêm ngặt theo khuyến cáo của AOAC bao gồm: tính đặc hiệu, tính thích hợp hệ thống, khoảng tuyến tính, độ lặp lại và độ đúng (tỷ lệ thu hồi qua phương pháp thêm chuẩn ở 3 mức nồng độ 40%, 50%, 60%).

Thực nghiệm, kết quả và bàn luận

Chương này công bố toàn bộ dữ liệu thực nghiệm thu được từ 10 mẫu cao đặc Xấu hổ và luận giải khoa học về các chỉ tiêu kiểm nghiệm:

1. Kết quả chỉ tiêu định tính:

• Cảm quan: Cao đặc Xấu hổ có thể chất mềm quánh, đồng nhất, màu từ nâu đến nâu sẫm, độ ẩm dưới 20%.
• Phản ứng hóa học: 10/10 mẫu cao đều cho phản ứng dương tính rõ rệt với nhóm flavonoid (tạo kết tủa vàng với NaOH 10%, tan và tăng màu khi thêm nước; tạo tủa xanh đen với FeCl3 5%; chuyển từ màu vàng sang đỏ trong phản ứng Cyanidin) và nhóm sterol (phản ứng Lieberman-Burchard tạo vòng tiếp xúc màu tím đỏ, lớp dưới màu hồng, lớp trên màu xanh lá). Phản ứng đóng mở vòng lacton của nhóm coumarin cho kết quả âm tính trên cả 10 mẫu M. pudica, trong khi dương tính trên mẫu M. diplotricha, tạo cơ sở sơ bộ phân biệt hai loài.
• Sắc ký lớp mỏng: Bản mỏng sau khi phun thuốc thử NP/PEG và quan sát dưới UV 366 nm cho thấy sắc ký đồ của 10 mẫu cao đặc M. pudica đồng nhất về cấu trúc vết. Sắc ký đồ thể hiện vết màu vàng có giá trị $R_f = 0,61$ trùng khớp với chất chuẩn luteolin và vết huỳnh quang vàng có $R_f = 0,14$ trùng khớp với luteolin-6-C-glycosid (isoorientin). Ngoài ra, mẫu thử còn xuất hiện các vết huỳnh quang vàng tại $R_f = 0,20$ và $R_f = 0,43$, cùng các vùng huỳnh quang đỏ tại $R_f = 0,70$ và $R_f = 0,85$. Mẫu Xấu hổ thân xanh (M. diplotricha) hoàn toàn không xuất hiện vết huỳnh quang vàng tại vị trí $R_f = 0,14$, chứng minh tính đặc hiệu phân biệt của dấu vân tay sắc ký.

2. Kết quả chỉ tiêu định lượng flavonoid toàn phần (UV-Vis):

• Thẩm định tính thích hợp hệ thống cho độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của độ hấp thụ qua 7 lần đo lặp lại là 0,8278% (đạt yêu cầu < 2,0%).
• Phương trình đường chuẩn thiết lập tại bước sóng 421 nm: $y = 0,0612x + 0,0345$ với hệ số tương quan $R^2 = 0,9959$.
• Hàm lượng flavonoid toàn phần của 10 mẫu cao đặc dao động từ 2,5355% đến 4,3087%. Giá trị trung bình toàn bộ 10 mẫu đạt $3,3150 \pm 0,531%$. Độ lệch chuẩn tương đối giữa 3 lần chiết của mỗi mẫu đều đạt RSD < 2,0%.

3. Kết quả thẩm định phương pháp và định lượng luteolin (HPLC-DAD):

• Tính đặc hiệu: Peak luteolin của mẫu thử xuất hiện ở thời gian lưu tương ứng với mẫu chuẩn (~42,64–42,94 phút), tách rời hoàn toàn khỏi các pic tạp chất lân cận; phổ UV của pic luteolin trong mẫu thử trùng khít với phổ của chất chuẩn; hệ số tinh khiết pic xấp xỉ 1,0. Mẫu trắng không có đáp ứng pic tại thời gian lưu này.
• Tính thích hợp hệ thống: Tiêm 6 lần mẫu chuẩn cho RSD thời gian lưu là 0,090% và RSD diện tích peak là 0,239% (đều nhỏ hơn ngưỡng 2,0%).
• Độ tuyến tính: Khoảng nồng độ 1,0–7,5 µg/ml biểu thị mối tương quan tuyến tính chặt chẽ với diện tích peak qua phương trình hồi quy $y = 124395x + 2793,3$ ($R^2 = 0,9993$).
• Độ lặp lại: Phân tích 6 mẫu thử độc lập từ cùng một lô cao cho giá trị hàm lượng trung bình là 0,0626%, với RSD = 2,2085% (đáp ứng tiêu chuẩn AOAC cho nồng độ vết < 5,3%).
• Độ đúng: Tỷ lệ thu hồi qua thực nghiệm thêm chuẩn ở 3 mức nồng độ đạt từ 96,13% đến 103,69%, trung bình từng mức nồng độ lần lượt là 97,17% (RSD = 1,60%), 98,48% (RSD = 1,28%) và 100,73% (RSD = 2,55%), nằm trong giới hạn cho phép 90–107%.

Chỉ tiêu thẩm định HPLC	Kết quả thực nghiệm	Giới hạn theo quy định (AOAC)	Kết luận
Tính thích hợp hệ thống	RSD thời gian lưu = 0,090% RSD diện tích peak = 0,239%	RSD ≤ 2,0%	Đạt
Độ tuyến tính	Khoảng 1,0 – 7,5 µg/ml $y = 124395x + 2793,3$ ($R^2 = 0,9993$)	$R^2 \ge 0,99$	Đạt
Độ lặp lại	Hàm lượng trung bình = 0,0626% RSD = 2,2085%	RSD < 5,3%	Đạt
Độ đúng (Độ thu hồi)	Mức 1: 97,17% (RSD = 1,60%) Mức 2: 98,48% (RSD = 1,28%) Mức 3: 100,73% (RSD = 2,55%)	Thu hồi: 90 – 107% RSD < 5,3%	Đạt

Bảng tổng hợp hàm lượng định lượng trên 10 mẫu cao đặc Xấu hổ khảo sát:

Ký hiệu mẫu	Khối lượng cao trung bình (g/50g dược liệu)	Hàm ẩm trung bình (%)	Hàm lượng Flavonoid toàn phần trung bình (%)	Hàm lượng Luteolin trung bình (%)
MP1	7,1710	12,19	2,8354	0,0382
MP2	7,5348	14,80	3,2832	0,0491
MP3	7,9664	10,78	3,6471	0,0748
MP4	7,2475	11,81	2,7693	0,0845
MP5	8,3110	14,32	3,5805	0,0982
MP6	7,6478	11,26	3,7737	0,0695
MP7	5,9384	12,39	2,5355	0,0935
MP8	7,3338	11,61	3,1563	0,0910
MP9	7,5627	12,54	4,3087	0,0765
MP10	7,3197	11,57	3,4259	0,0570
Giá trị trung bình	—	—	3,3150 ± 0,531	0,0732 ± 0,0199

Phần bàn luận chỉ ra rằng hàm lượng luteolin và flavonoid toàn phần không có mối tương quan tuyến tính thuận giữa các mẫu (ví dụ mẫu MP7 có flavonoid toàn phần thấp nhất đạt 2,5355% nhưng luteolin đạt tới 0,0935%; ngược lại MP1 có luteolin thấp nhất 0,0382% nhưng flavonoid đạt 2,8354%). Do đó, bắt buộc phải đồng thời áp dụng cả hai chỉ tiêu định lượng để phản ánh chính xác chất lượng cao chiết. Dựa trên phép kiểm định phân bố chuẩn Shapiro-Wilk với độ tin cậy 99,7%, tác giả xác lập ngưỡng giới hạn dưới: hàm lượng flavonoid toàn phần không ít hơn 2,6544% và hàm lượng luteolin không ít hơn 0,0479%. Căn cứ tiêu chuẩn này, mẫu MP1 không đạt chỉ tiêu luteolin và mẫu MP7 không đạt chỉ tiêu flavonoid toàn phần.

---

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đã cung cấp đầy đủ dữ liệu thực nghiệm để dự thảo chuyên luận kiểm nghiệm chất lượng cao đặc Xấu hổ (Mimosa pudica L.):

• Thiết lập tiêu chuẩn cảm quan: Thể chất mềm, đồng nhất, màu nâu đến nâu sẫm, độ ẩm không quá 20%.
• Xác lập 4 phản ứng hóa học đặc trưng nhận diện nhóm flavonoid (NaOH 10%, FeCl3 5%, Cyanidin) và nhóm sterol (Lieberman-Burchard).
• Xây dựng bản đồ sắc ký lớp mỏng "dấu vân tay" trên silicagel GF254 với hệ dung môi ethyl acetat – acid acetic – acid formic – nước (10 : 0,3 : 0,3 : 0,1), phát hiện đồng thời 2 chất đánh dấu luteolin ($R_f = 0,61$) và luteolin-6-C-glycosid ($R_f = 0,14$) dưới bước sóng tử ngoại 366 nm sau khi phun NP/PEG.
• Thẩm định hoàn chỉnh quy trình phân tích và đề xuất ngưỡng giới hạn định lượng cho cao đặc Xấu hổ: Hàm lượng flavonoid toàn phần không dưới 2,6544% (đo quang UV-Vis tại 421 nm quy về luteolin) và hàm lượng luteolin không dưới 0,0479% (phân tích HPLC-DAD tại 347 nm).

Đóng góp mới của khóa luận so với các nghiên cứu trước đây là đã chuyển tiếp từ việc kiểm soát nguyên liệu dược liệu thô sang kiểm soát dạng bào chế trung gian (cao đặc). Đề tài đã giải quyết được thách thức phân biệt giữa Mimosa pudica L. và loài dược liệu dễ nhầm lẫn Mimosa diplotricha C. Wright ex Sa. (Xấu hổ thân xanh) thông qua phản ứng hóa học phát hiện vòng lacton coumarin và vết sắc ký isoorientin ($R_f = 0,14$). Hơn nữa, việc tích hợp đồng thời định lượng tổng nhóm hoạt chất (flavonoid toàn phần) và hoạt chất đánh dấu đơn lẻ (luteolin) khắc phục được hiện tượng thiếu hụt tương quan nồng độ giữa các mẻ dược liệu, giúp loại bỏ các mẫu nguyên liệu kém chất lượng (như mẫu MP1 và MP7 trong nghiên cứu).

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận còn một số hạn chế gắn liền với phạm vi triển khai thực tế:

• Mẫu nghiên cứu mới chỉ được thu thập tại 10 điểm thuộc cùng một địa bàn địa lý (huyện Thanh Trì, thành phố Hà Nội) vào một thời điểm duy nhất (tháng 7/2023), chưa phản ánh sự biến thiên hàm lượng hoạt chất của Xấu hổ theo mùa vụ và theo các vùng sinh thái thổ nhưỡng khác nhau trên cả nước.
• Dữ liệu sử dụng phản ứng hóa học mở/đóng vòng lacton của nhóm coumarin nhằm phân biệt M. pudica và M. diplotricha mới dừng ở mức kết quả bước đầu trên số lượng mẫu hạn chế, cần thêm dữ liệu phổ và sắc ký để khẳng định tính quy luật.
• Đề tài chưa triển khai theo dõi độ ổn định của cao đặc Xấu hổ theo thời gian bảo quản trong các điều kiện nhiệt độ và độ ẩm khác nhau để xác định hạn dùng của bán thành phẩm.

---

Giá trị tham khảo

Khóa luận tốt nghiệp là tài liệu tham khảo có giá trị chuyên môn cao cho sinh viên, học viên sau đại học và nghiên cứu viên thuộc khối ngành Dược học, chuyên ngành Dược liệu, Dược học cổ truyền và Kiểm nghiệm thuốc.

Các nội dung có giá trị ứng dụng trực tiếp bao gồm:

• Quy trình chiết pha rắn (SPE) xử lý dịch chiết cao thực vật giàu polyphenol/flavonoid giúp bảo vệ cột và tối ưu hóa độ phân giải trên HPLC.
• Điều kiện sắc ký lớp mỏng CAMAG phân tích các flavonoid phân cực (sử dụng hệ dung môi bốn cấu tử ethyl acetat – acid acetic – acid formic – nước kết hợp thuốc thử NP/PEG).
• Phương pháp luận thống kê ứng dụng kiểm định Shapiro-Wilk và khoảng tin cậy 99,7% trong việc tính toán, ban hành các mức giới hạn định lượng cho tiêu chuẩn cơ sở của chế phẩm đông dược.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao nghiên cứu lựa chọn đồng thời cả flavonoid toàn phần và luteolin làm chỉ tiêu định lượng cao đặc Xấu hổ?

Dữ liệu phân tích thực nghiệm trên 10 mẫu cao đặc cho thấy hàm lượng luteolin dao động từ 0,0382% đến 0,0982%, trong khi flavonoid toàn phần dao động từ 2,5355% đến 4,3087% và giữa hai đại lượng này không có mối liên quan tuyến tính thuận. Luteolin là hoạt chất có tác dụng sinh học kháng viêm và chống co thắt phế quản rõ rệt nhưng chỉ là một thành phần đại diện. Nếu chỉ định lượng luteolin hoặc chỉ định lượng flavonoid toàn phần thì không thể phản ánh toàn diện hoạt tính và chất lượng của cao đặc (ví dụ mẫu MP7 có flavonoid toàn phần thấp nhất nhưng luteolin lại rất cao, trong khi MP1 có luteolin dưới ngưỡng nhưng flavonoid toàn phần vẫn ở mức trung bình).

2. Dấu hiệu sắc ký lớp mỏng nào cho phép phân biệt cao đặc Xấu hổ (Mimosa pudica L.) với Xấu hổ thân xanh (Mimosa diplotricha)?

Khi triển khai sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi ethyl acetat – acid acetic – acid formic – nước (10 : 0,3 : 0,3 : 0,1) và phun thuốc thử NP/PEG, quan sát dưới UV 366 nm: 10 mẫu cao Mimosa pudica L. đều xuất hiện vết huỳnh quang vàng tại $R_f = 0,14$ (tương ứng với chất chuẩn isoorientin/luteolin-6-C-glycosid). Ngược lại, mẫu cao Xấu hổ thân xanh (Mimosa diplotricha) hoàn toàn không có vết huỳnh quang vàng tại giá trị $R_f = 0,14$ này.

3. Phương pháp định lượng luteolin bằng HPLC-DAD đã đạt những thông số thẩm định nào theo tiêu chuẩn AOAC?

Phương pháp đáp ứng đầy đủ các tiêu chí thẩm định:

• Tính thích hợp hệ thống: RSD thời gian lưu đạt 0,090% và RSD diện tích peak đạt 0,239% (< 2,0%).
• Tính tuyến tính: $R^2 = 0,9993$ trong khoảng nồng độ 1,0–7,5 µg/ml.
• Độ lặp lại: RSD hàm lượng đạt 2,2085% (< 5,3%).
• Độ đúng: Tỷ lệ thu hồi đạt 97,17%–100,73% với RSD từ 1,28% đến 2,55% (< 5,3%).
• Tính đặc hiệu: Peak sắc ký của luteolin tách hoàn toàn, phổ hấp thụ UV đồng nhất với chuẩn và hệ số tinh khiết pic đạt xấp xỉ 1,0.

4. Cơ sở thống kê để đưa ra giới hạn hàm lượng flavonoid toàn phần không ít hơn 2,6544% và luteolin không ít hơn 0,0479% là gì?

Tác giả đã coi mỗi giá trị hàm lượng của 10 mẫu là một biến số độc lập và tiến hành kiểm định phân bố chuẩn bằng phép thử Shapiro-Wilk (kết quả ghi nhận mức ý nghĩa Sig. > 0,05, chứng minh dãy số liệu phân bố chuẩn). Trên cơ sở phân bố chuẩn với khoảng tin cậy 99,7% ($\bar{X} - 3SD$), giới hạn dưới được xác lập là 2,6544% đối với flavonoid toàn phần (tính trên giá trị trung bình $3,3150 \pm 0,531%$) và 0,0479% đối với luteolin (tính trên giá trị trung bình $0,0732 \pm 0,01994%$).

5. Trong 10 mẫu khảo sát, những mẫu nào bị đánh giá không đạt tiêu chuẩn đề xuất và nguyên nhân do đâu?

Khi áp dụng tiêu chuẩn đề xuất, có 2 mẫu bị đánh giá không đạt chất lượng:

• Mẫu MP1 không đạt tiêu chuẩn do hàm lượng luteolin chỉ đạt 0,0382% (thấp hơn ngưỡng quy định tối thiểu 0,0479%).
• Mẫu MP7 không đạt tiêu chuẩn do hàm lượng flavonoid toàn phần chỉ đạt 2,5355% (thấp hơn ngưỡng quy định tối thiểu 2,6544%).

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Phùng Thị Lý đã xây dựng thành công hệ thống chỉ tiêu kiểm nghiệm toàn diện cho bán thành phẩm cao đặc Xấu hổ (Mimosa pudica L.), bao gồm cảm quan, phản ứng hóa học nhận diện flavonoid và sterol, cùng bản đồ sắc ký lớp mỏng đặc hiệu. Đề tài đã chuẩn hóa và thẩm định đạt yêu cầu theo hướng dẫn AOAC đối với hai phương pháp định lượng: đo quang phổ UV-Vis xác định flavonoid toàn phần và HPLC-DAD xác định luteolin. Với các ngưỡng giới hạn được xác lập khoa học trên cơ sở thống kê (flavonoid toàn phần $\ge 2,6544%$, luteolin $\ge 0,0479%$), kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở kỹ thuật tin cậy phục vụ công tác kiểm soát chất lượng và tiêu chuẩn hóa các chế phẩm thuốc có nguồn gốc từ Xấu hổ định hướng hỗ trợ điều trị hen phế quản.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Xấu hổ (Mimosa pudica L) thuộc loại cây thân thảo, sống hàng năm. Xấu hổ phân bố ở nhiều nơi trên thế giới như Việt Nam, Ấn Độ, một số nước châu Phi, châu Mỹ. Ở Việt Nam, Xấu hổ phân bố ở nhiều vùng trên nước ta và được sử dụng trong y học cổ truyền, chủ yếu với tác dụng an thần [10]. Theo một số nghiên cứu của y học hiên đại, Xấu hổ có tác dụng chống co thắt phế quản, chống viêm, hạ huyết áp, hạ đường huyết …[22].

Một trong số các tác dụng được nhóm nghiên cứu hướng đến là tác dụng hỗ trợ trong điều trị hen phế quản. Các kết quả nghiên cứu cho thấy flavonoid là thành phần chính trong cây Xấu hổ. Flavonoid cũng là một nhóm hợp chất có nhiều tác dụng sinh học, trong đó tác dụng chống oxy hóa, chống viêm là những tác dụng đã được chứng minh có vai trò quan trọng trong dự phòng và điều trị hen phế quản. Một số hợp chất flavonoid có mặt trong Xấu hổ như luteolin, isoorientin… cho thấy có tác dụng trên một số mô hình hen phế quản thực nghiệm [30],[36].

Do đó, flavonoid được lựa chọn là nhóm chất đánh dấu trong xây dựng tiêu chuẩn dược liệu Xấu hổ. Nghiên cứu tối ưu hóa chiết xuất theo hàm lượng flavonoid cho phép điều chế cao đặc Xấu hổ có hàm lượng flavonoid cao. Đây là dạng bào chế trung gian cho các chế phẩm có thành phần dược liệu này. Để đảm bảo hiệu quả và độ an toàn của chế phẩm, cần có các tiêu chuẩn chất lượng cho cao đặc Xấu hổ.

Đây là cơ sở để đề tài “Xây dựng chỉ tiêu định tính và định lượng cao đặc Xấu hổ” được thực hiện với 2 mục tiêu sau: 1. Xây dựng một số chỉ tiêu định tính cao đặc Xấu hổ: Cảm quan, định tính bằng phản ứng hóa học, định tính bằng sắc kí lớp mỏng. Xây dựng một số chỉ tiêu định lượng cao đặc Xấu hổ: Định lượng flavonoid toàn phần, định lượng luteolin trong cao đặc Xấu hổ. Tổng quan về cây Xấu hổ (Mimosa pudica L.

Vị trí phân loại của Mimosa pudica L. Cây Xấu hổ còn có tên gọi khác là cây Mắc cỡ, cây Thẹn, cây Trinh nữ, Hàm tu thảo[4]. Theo hệ thống phân loại của A.Takhtajan[16], Mimosa pudica L. có vị trí phân loại như sau: Giới: Thực vật (Plantae) Ngành: Ngọc Lan (Magnoliophyta) Lớp: Ngọc Lan (Magnoliopsida) Phân lớp: Hoa Hồng (Rosidae) Bộ: Đậu (Fabales) Họ: Đậu (Fabaceae) Phân họ: Trinh nữ (Mimosoideae) Chi: Mimosa Loài: Mimosa pudica L.

Đặc điểm thực vật, phân bố, sinh thái 1. Đặc điểm thực vật Cây nhỏ, mọc hoang lòa xòa ở ven đường cái, thân có gai hình móc. Lá 2 lần kép lông chim, nhưng cuống phụ xếp như hình chân vịt; khẽ động vào lá cụp xuống. Cuống chung gầy, mang nhiều lông, dài 4cm, cuống phụ 2 đôi, có lông trắng cứng.

Lá chét 15- 20 đôi nhỏ, gần như không có cuống [15], [10]. Hoa màu tím đỏ, tụ thành hình đầu trái xoan. Cụm hoa mọc ở kẽ lá gồm rất nhiều hoa nhỏ xếp thành đấu tròn, màu tím hồng; đài nhỏ hình đấu; tràng 4 cánh dính nhau ở nửa dưới; nhị 4, rất mảnh, bầu 4 noãn. Quả giáp dài 2cm, rộng 3mm, tụ thành hình ngôi sao, ở phần giữa các hạt quả hẹp lại, có lông cứng ở mép.

Hạt gần như hình trái xoan, dài 2mm, rộng 1,5mm. Mùa hoa quả: tháng 6-8 [15], [10]. Phân bố Xấu hổ có nguồn gốc từ Nam Mỹ và Trung Mỹ sau đó du nhập sang vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới như Ấn Độ, Nam Châu Phi, khu vực Đông Nam Á, Hàn Quốc, Trung Quốc… Ở Việt Nam, Xấu hổ phát triển chủ yếu mọc dại ở khắp nơi, thường thấy ở ven đê…[15].