CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1. TỔNG QUAN VỀ ENZYME Enzyme là chất xúc tác sinh học được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực của đời sống, đặc biệt đóng vai trò quan trọng đối với các quy trình chế biến thực phẩm. Enzyme xúc tác cho hầu hết các phản ứng xảy ra trong cơ thể sống, đảm bảo cho quá trình chuyển hóa các chất trong cơ thể sống tiến hành với tốc độ nhẹ nhàng, cân đối theo những chiều hướng xác định [2], [14].
Enzyme có trong tất cả các cơ thể động vật, thực vật và vi sinh vật. Nó có thể được tiết ra ngoài dịch tế bào, tồn tại trong các dịch của cơ thể, dịch môi trường (gọi là enzyme ngoại bào) hoặc giữ lại bên trong tế bào (enzyme nội bào). Hiện nay trong các nguồn nguyên liệu trên, vi sinh vật là nguồn sản xuất enzyme ở quy mô lớn cho công nghiệp. Tuy nhiên, khi ứng dụng trong ngành công nghệ thực phẩm, nguồn nguyên liệu này cần phải lưu ý một số vi sinh vật có khả năng sinh độc tố ảnh hưởng đến sức khỏe con người.
Chính vì thế, trong một số ngành sản xuất thực phẩm, nguồn enzyme chính được khai thác từ động vật và thực vật [10], [16]. Để tách một enzyme có kết quả tốt cần phải tiến hành thí nghiệm để lựa chọn loại nguyên liệu giàu enzyme và dễ dàng tinh chế enzyme. Cho đến nay, đã biết được nhiều loại cấu trúc hóa học của nhiều loại enzyme quan trọng. Đáng chú ý là trong nhóm ngoại của đa số enzyme hai cấu tử có chứa vitamin: piruvatdecacbonxylase chứa B1 (thiamin), aminotransferase chứa B6 (piridoxan),.
Ngoài ra, một số hợp chất khác như glutation dạng khử, nucleotid và các dẫn xuất, estephosphat của một số monosacharid cùng tham gia vào thành phần coenzyme của enzyme [3], [17]. Enzyme là chất xúc tác sinh học, nó có đầy đủ các tính chất của một chất xúc tác. Tuy nhiên, enzyme có cường lực xúc tác mạnh hơn nhiều so với các chất xúc tác thông thường. Bên cạnh đó, tính chất đặc trưng của enzyme vẫn là tính đặc hiệu.
Đó là một trong những khác biệt giữa enzyme và các chất xúc tác khác [3]. Người ta phân biệt hai kiểu đặc hiệu chính là đặc hiệu cơ chất và đặc hiệu kiểu phản ứng: - Đặc hiệu kiểu phản ứng: thể hiện ở chỗ, mỗi enzyme chỉ xúc tác cho một trong các phản ứng chuyển hóa nhất định. Ví dụ: phản ứng oxy hóa khử, phản ứng chuyển vị, phản ứng thủy phân. - Đặc hiệu cơ chất: cơ chất là chất có phản ứng kết hợp vào trung tâm hoạt động của enzyme và bị chuyển hóa dưới tác dụng của enzyme.
Mức độ đặc hiệu của các enzyme không giống nhau. Có những enzyme có tính đặc hiệu tuyệt đối, nghĩa là enzyme chỉ tác dụng lên một cơ chất nhất định và hầu như không có tác dụng với cơ chất nào khác. Nhưng cũng có những enzyme có tác dụng lên một kiểu liên kết hóa PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.com to remove the waterma 4 học trong phân tử cơ chất mà không phụ thuộc vào cấu tạo của các thành phần tham gia tạo thành mối liên kết đó, chúng thể hiện tính đặc hiệu tương đối. Có enzyme chỉ tác dụng với một trong hai dạng đồng phân quang học của các chất, nó thể hiện đặc hiệu quang học.
Ngoài ra, enzyme còn có khả năng phân biệt được hai gốc đối xứng trong phân tử giống nhau hoàn toàn về mặt hóa học [10], [14]. Để thu nhận enzyme nội bào, người ta phải phá vỡ tế bào bằng nhiều phương pháp vật lí, cơ học, hóa học. Có ba khó khăn khi tách enzyme khỏi tế bào cần hết sức lưu ý [10]: - Enzyme có trong tế bào sinh vật với lượng không lớn so với các thành phần khác. Do đó, việc tách để thu nhận thành phần nhỏ này là điều rất khó.
- Enzyme là chất hữu cơ không bền, chúng rất dễ bị biến tính khi tác động của các yếu tố bên ngoài. - Enzyme là protein. Protein enzyme luôn luôn đi cùng những loại protein không phải enzyme nhưng lại có tính chất lý hóa rất giống protein enzyme. Do đó, việc tách protein – enzyme ra khỏi các loại protein không phải lúc nào cũng đạt được kết quả tốt và không phải không gặp được những khó khăn nhất định.
Sau khi phá vỡ tế bào, người ta thường sử dụng nước, dung dịch đệm, dung dịch muối trung tính để tách enzyme ra khỏi sinh khối đã xử lí theo những phương pháp trên. Dịch chiết thu được, người ta gọi là chế phẩm enzyme thô vì trong chế phẩm này, ngoài enzyme ra còn có nước, protein không phải enzyme và các thành phần của tế bào. Như vậy, việc làm sạch enzyme chính là việc loại protein không phải là enzyme (đôi khi loại bỏ cả các protein – enzyme không mong muốn), nước, các thành phần khác của tế bào ra khỏi enzyme. Công việc này hoàn toàn không dễ dàng.
Do đó việc làm sạch enzyme đòi hỏi người làm nghiên cứu về enzyme, ngoài sự hiểu biết về enzyme ra còn phải nắm vững rất nhiều thao tác kỹ thuật khác nhau để tránh gây mất hoạt tính hoạt động của enzyme [4]. Để loại bỏ những thành phần không phải là enzyme ta đang cần, người ta thực hiện những phương pháp như: gây biến tính chọn lọc dựa trên sự tác động của nhiệt độ, pH, phương pháp kết tủa phân đoạn bằng muối hoặc dung môi hữu cơ, phương pháp hấp thụ chọn lọc khi cho chúng vào cột chất hấp thụ, phương pháp sắc ký dựa trên cơ sở của phản ứng trao đổi ion giữa protien tan trong nước và tác nhân trao đổi ion. Để xác định khả năng xúc tác của enzyme thông qua việc xác định hoạt độ hoạt động của enzyme, người ta cũng không thể định lượng enzyme trực tiếp mà phải xác định gián tiếp thông qua hoạt độ hoạt động của chúng hoặc thông qua khả năng làm giảm cơ chất sau một thời gian phản ứng. PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.com to remove the waterma 5 1.
TỔNG QUAN PROTEASE 1. Giới thiệu về protease Protease là nhóm enzyme xúc tác cho quá trình thủy phân liên kết peptid (CO – NH) trong phân tử protein hoặc trong các cơ cấu tương tự. Quá trình thủy phân liên kết peptid được biểu diễn qua chuỗi phản ứng sau: Protein ―> Pepton ―> Polypeptid ―> Acid amin Đây là quá trình thủy phân tương đối phức tạp, có sự tham gia của nhiều protease khác nhau [12], [14]. Trong các protease, protease của hệ tiêu hóa được phát hiện sớm nhất.
Từ lâu người ta đã tách được protease từ dạ dày và từ dịch tụy tạng của động vật. Bên cạnh đó, một số nghiên cứu về protease thực vật cũng được nghiên cứu. Năm 1874, người ta đã công bố nhận được protease từ hạt của một cây họ đậu, nhiều tác giả thấy rằng, dịch chiết từ cây đại mạch, bông lau, đu đủ có khả năng phân giải protein [17]. Ở Việt Nam đã có nhiều nhà khoa học nghiên cứu, thăm dò, phát hiện và khảo sát tính chất về enzyme này nhưng cho đến nay vẫn chưa có một cơ sở nào sản xuất chế phẩm enzyme nói chung và protease nói riêng.
Hầu hết các chế phẩm enzyme dùng trong nghiên cứu và ứng dụng vào sản xuất đều phải nhập ngoại. Chính vì vậy việc nghiên cứu tìm ra quy trình thu nhận các chế phẩm enzyme và ứng dụng là vấn đề cần thiết và mang ý nghĩa thực tiễn [15]. Phân loại protease Theo phân loại quốc tế, protease được chia làm hai phân nhóm (exo – peptidase, endopeptidase) [10], [12]. Exopeptidase Là nhóm enzyme xúc tác thủy phân các mối liên kết peptid ở đầu mạch, gồm có 3 loại: + Amynopeptidase: xúc tác sự thủy phân liên kết peptid nằm kề nhóm amin tự do trong chuỗi polypeptid H2N – CH – CO – NH – CH – CO –.
– NH – CH – COOH R1 R2 R3 + Cacboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptid mà có nhóm cacboxyl (-COOH) nằm gần kề trong chuỗi polypeptid. PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.com to remove the waterma 6 H2N–CH –CO –NH –CH –CO –.–NH – CH – CO – NH – CH – COOH R1 R2 R3 R4 + Dipeptid hydrolase: xúc tác thủy phân các liên kết dipeptid. Endopeptidase (proteinase) Là nhóm enzyme xúc tác cho quá trình thủy phân các liên kết peptid bên trong phân tử protein. Endopeptidase được phân loại dựa vào cơ chế xúc tác của chúng.
Trong thực vật, endopeptidase được chia làm 4 loại: serin-proteinase, cystienproteinase, aspartic- proteinase và metallo-proteinase. + Serin – proteinase (Ser-EP) là những enzyme trung tính, có nhóm –OH, có một phân tử Ser hoạt động tại vị trí xúc tác, vị trí này có tác dụng tương hỗ với cơ chất protein. Các Ser – EP được tìm thấy có liên quan tới quá trình sinh lý như sự lão hóa, sự chết của tế bào, sự tạo gỗ, sự nảy mầm. + Cystein – proteinase (Cys – EP): là những enzyme có nhóm –SH trong trung tâm hoạt động; là một nhóm proteinases thực vật được nghiên cứu nhiều nhất.
Cơ chế xúc tác của enzyme có liên quan đến nhóm cystein tham gia nhiều quá trình sinh học như quá trình lão hóa sự tạo gỗ, sự cố định protein trong quá trình nảy mầm. Cys – EP được biết đến nhiều nhất là protein giống caspase, các peptid giống papain, bromelain, ficin và ngoài ra chứa các protein loại cathepsin. +Aspartic – proteinase gồm các liên kết peptid có các nhóm bên của aminoacid kỵ nước và hoạt động ở pH acid (pH < 7). Mặc dù, các enzyme này đã được tìm thấy ở nhiều loại thực vật, nấm mốc.
Tuy nhiên sự quan tâm đến nhóm này là rất ít, chủ yếu gồm các protein cardosin và cathepsin. Cardosin được chiết từ hoa Cynara cardunculus khô và được sử dụng trong sản xuất phomat từ sữa cừu của Bồ Đào Nha và Tây Ban Nha. Cathepsin được tìm thấy trong các hạt chưa nảy mầm, trong suốt thời gian nảy mầm và trong các mô sống của đại mạch bao gồm cả chồi và rễ. + Metallo – proteinase: chủ yếu được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các loại vi sinh vật bậc cao.
Hầu hết loại enzyme này chứa Zn, lượng rất ít chứa Co và Mn. Một metallo – proteinase tồn tại trong lá đậu nành, có nhiều nhất trong các giai đoạn sau của quá trình phát triển của lá. PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.com to remove the waterma 7 1. Nguồn thu nhận protease Protease là một enzyme rất cần thiết cho quá trình sinh lý trong cơ thể sống và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau.
Chính vì vậy, chúng phân bố khá phổ biến ở vi sinh vật, động vật và thực vật.
