Biểu hiện gen mã hóa kháng thể kháng CD20 và thử nghiệm phát hiện trong huyết thanh bệnh nhân ung thư lympho không Hodgkin

• Tác giả: Phạm Thu Thùy
• Người hướng dẫn: PTS. Trần Minh Đạo
• Trường học: Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Biểu Hiện Gen Mã Hóa Kháng Thể Kháng Cd20 Và Thử Nghiệm Để Phát Hiện Cd20 Trong Huyết Thanh Của Bệnh Nhân Ung Thư Lympho Không Hodgkin
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Hà Nội

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Đại cƣơng ung thƣ máu
• 1.2. Tình hình ung thƣ máu trên thế giới và Việt Nam
• 1.3. Các phƣơng pháp chẩn đoán và điều trị ung thƣ máu
• 1.4. Bệnh ung thƣ lympho không Hodgkin (Non-Hodgkin lymphoma)
• 1.5. KHÁNG NGUYÊN CD20
• 1.5.1. Cấu trúc gen và protein CD20
• 1.5.2. Chức năng của CD20 trong cơ thể
• 1.5.3. Kháng nguyên CD20 – mục tiêu phân tử trong điều trị ung thƣ và ung thƣ máu
• 1.5.4. Tình hình nghiên cứu kháng nguyên CD20 tái tổ hợp
• 1.6. KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG (mAb), KHÁNG THỂ SCFV VÀ KHÁNG THỂ PHAGE-SCFV
• 1.6.1. Kháng thể
• 1.6.2. Kháng thể đơn dòng (mAb)
• 1.6.3. Kháng thể đơn chuỗi (kháng thể scFv)
• 1.6.4. Kháng thể phage-scFv
• 1.6.5. Ứng dụng mAb trong chẩn đoán bệnh ung thƣ máu
• 1.6.6. Tình hình nghiên cứu và sản xuất mAb đặc hiệu kháng nguyên CD trên thế giới
• 1.7. KHÁNG THỂ ĐẶC HIỆU KHÁNG NGUYÊN CD20
• 1.7.1. Cơ chế hoạt động của kháng thể đặc hiệu CD20
• 1.7.2. Một số mAb đặc hiệu CD20 đang đƣợc sử dụng trong điều trị
• 1.7.3. Tình hình nghiên cứu mAb đặc hiệu CD20 hiện nay
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Hóa chất và trang thiết bị
• 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.2.1. Các phƣơng pháp thao tác với DNA VÀ RNA
• 2.2.2. Tách chiết RNA từ máu của bệnh nhân và tủy gà đã gây miễn dịch
• 2.2.3. RT-PCR nhân bản gen mã hóa kháng nguyên CD20 và kháng thể scFv đặc hiệu CD20
• 2.2.4. Gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pCR2. Biến nạp plasmid vào tế bào E. Tách DNA plasmid từ vi khuẩn E. Tạo vector tái tổ hợp chứa đoạn gen CD20
• 2.2.5. Tách dòng gen antiCD20Fa mã hóa kháng thể scFv-CH2
• 2.2.6. Điện di gel agarose
• 2.2.7. Thu đoạn DNA từ gel agarose
• 2.2.8. Tinh sạch DNA và cắt, gắn DNA
• 2.2.9. Phƣơng pháp nhân gen bằng PCR
• 2.2.10. Xác định trình tự nucleotide
• 2.2.11. Các phƣơng pháp thao tác với protein tái tổ hợp
• 2.2.12. Biểu hiện gen trong tế bào E. Tinh sạch protein tái tổ hợp
• 2.2.13. Điện di protein
• 2.2.14. Kĩ thuật Western blot và Dot blot
• 2.2.15. Gây miễn dịch gà bằng kháng nguyên CD20
• 2.2.16. Kĩ thuật phage display
• 2.2.17. Tạo kháng thể phage-scFv từ thƣ viện Griffin. Sàng lọc kháng thể phage-scFv đặc hiệu kháng nguyên đích
• 2.2.18. Xác định khả năng liên kết của kháng thể scFv-CH2 với CD20
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. TẠO KHÁNG NGUYÊN CD20 TÁI TỔ HỢP
• 3.1.1. Tách chiết RNA tổng số từ máu bệnh nhân ung thƣ lympho không Hodgkin
• 3.1.2. Nhân bản các gen mã hoá CD20
• 3.1.3. Tách dòng gen mã hoá CD20
• 3.1.4. Xác định trình tự gen mã hóa CD20
• 3.1.5. Thiết kế vector biểu hiện kháng nguyên CD20
• 3.1.6. Biểu hiện, tinh sạch và xác định hoạt tính của CD20
• 3.2. KẾT QUẢ GÂY MIỄN DỊCH GÀ BẰNG CD20 TẠO RA
• 3.3. THU NHẬN GEN MÃ HÓA scFv KHÁNG CD20 TỪ GÀ
• 3.3.1. Tạo gen tái tổ hợp mã hóa cho scFv từ gà gây miễn dịch
• 3.3.2. Tạo phage biểu lộ scFv và sàng lọc các scFv có khả năng gắn đặc hiệu với kháng nguyên đích
• 3.4. TẠO KHÁNG THỂ scFv KHÁNG CD20
• 3.4.1. Tách dòng gen antiCD20 mã hóa scFv
• 3.4.2. Thiết kế vector biểu hiện pET22b(+)/antiCD20
• 3.4.3. Tối ƣu một số điều kiện biểu hiện scFv
• 3.4.4. Tinh sạch kháng thể scFv đặc hiệu CD20
• 3.4.5. Khả năng liên kết của scFv với kháng thể cộng hợp
• 3.4.6. Độ ổn định của scFv tinh sạch
• 3.5. TẠO KHÁNG THỂ scFv-CH2 KHÁNG CD20
• 3.5.1. Tách dòng gen antiCD20Fa mã hóa scFv-CH2
• 3.5.2. Sàng lọc hệ vector biểu hiện scFv-CH2
• 3.5.3. Nhân dòng các vector biểu hiện scFv-CH2
• 3.5.4. Biểu hiện kháng thể scFv-CH2 trong hệ vector
• 3.5.5. Chọn vector biểu hiện scFv-CH2
• 3.5.6. Tối ƣu một số điều kiện biểu hiện scFv-CH2
• 3.5.7. Tinh sạch kháng thể scFv-CH2
• 3.5.8. Độ ổn định của scFv-CH2 tinh sạch
• 3.5.9. Khả năng liên kết của scFv-CH2 với CD20
• 3.6. THỬ NGHIỆM scFv-CH2 PHÁT HIỆN CD20 TRONG HUYẾT THANH BỆNH NHÂN NHL
• 3.6.1. Phát hiện CD20 trong huyết thanh bệnh nhân bằng Western blot
• 3.6.2. Phát hiện CD20 trong huyết thanh bệnh nhân bằng ELISA
• 3.6.3. Lựa chọn độ pha loãng huyết thanh
• 3.6.4. Thử nghiệm scFv-CH2 phát hiện CD20 trong huyết thanh bệnh nhân bằng ELISA
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

I. Tổng quan về nghiên cứu biểu hiện gen kháng thể CD20

Nghiên cứu biểu hiện gen kháng thể CD20 đóng vai trò quan trọng trong việc phát hiện và điều trị ung thư lympho không Hodgkin. CD20 là một kháng nguyên bề mặt chủ yếu trên tế bào B, có liên quan mật thiết đến sự phát triển của bệnh. Việc hiểu rõ về biểu hiện gen này giúp cải thiện các phương pháp chẩn đoán và điều trị.

1.1. Khái niệm về ung thư lympho không Hodgkin

Ung thư lympho không Hodgkin (NHL) là một loại ung thư máu phổ biến, chiếm tỷ lệ cao trong các bệnh ung thư. Bệnh này thường phát sinh từ tế bào lympho B và có thể gây ra nhiều biến chứng nghiêm trọng nếu không được phát hiện kịp thời.

1.2. Vai trò của kháng thể CD20 trong điều trị

Kháng thể CD20 được sử dụng trong liệu pháp điều trị ung thư lympho không Hodgkin. Chúng giúp tiêu diệt tế bào ung thư bằng cách gắn kết với kháng nguyên CD20 trên bề mặt tế bào B, từ đó kích thích phản ứng miễn dịch.

II. Thách thức trong việc phát hiện CD20 trong huyết thanh bệnh nhân

Việc phát hiện CD20 trong huyết thanh bệnh nhân ung thư lympho không Hodgkin gặp nhiều thách thức. Các phương pháp hiện tại có thể không đủ nhạy để phát hiện nồng độ thấp của kháng nguyên này trong huyết thanh.

2.1. Các phương pháp phát hiện CD20 hiện tại

Các phương pháp như Western blot và ELISA thường được sử dụng để phát hiện CD20. Tuy nhiên, độ nhạy và độ đặc hiệu của các phương pháp này cần được cải thiện để đảm bảo phát hiện chính xác.

2.2. Những hạn chế trong chẩn đoán

Hạn chế trong việc phát hiện CD20 bao gồm sự biến đổi của kháng nguyên và sự hiện diện của các yếu tố gây nhiễu trong huyết thanh. Điều này có thể dẫn đến kết quả dương tính giả hoặc âm tính giả.

III. Phương pháp nghiên cứu biểu hiện gen kháng thể CD20

Nghiên cứu biểu hiện gen kháng thể CD20 được thực hiện thông qua nhiều phương pháp khác nhau, bao gồm tách chiết RNA, RT-PCR và tạo kháng thể đơn chuỗi. Những phương pháp này giúp tạo ra kháng thể có khả năng nhận biết và gắn kết với CD20.

3.1. Tách chiết RNA từ mẫu bệnh phẩm

Quá trình tách chiết RNA từ mẫu huyết thanh bệnh nhân là bước quan trọng để xác định biểu hiện gen. RNA được tách chiết sẽ được sử dụng trong các phản ứng RT-PCR để nhân bản gen CD20.

3.2. Kỹ thuật RT PCR trong nghiên cứu

RT-PCR là một kỹ thuật mạnh mẽ cho phép nhân bản gen mã hóa kháng thể CD20. Kỹ thuật này giúp xác định nồng độ và mức độ biểu hiện của gen trong các mẫu huyết thanh.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy kháng thể scFv-CH2 có khả năng phát hiện CD20 trong huyết thanh bệnh nhân ung thư lympho không Hodgkin. Điều này mở ra hướng đi mới trong việc chẩn đoán và điều trị bệnh.

4.1. Hiệu quả của kháng thể scFv CH2

Kháng thể scFv-CH2 đã cho thấy khả năng liên kết đặc hiệu với CD20, giúp phát hiện chính xác kháng nguyên trong huyết thanh. Kết quả này có thể cải thiện đáng kể độ nhạy của các phương pháp chẩn đoán hiện tại.

4.2. Ứng dụng trong chẩn đoán ung thư

Kháng thể scFv-CH2 có thể được sử dụng trong các xét nghiệm chẩn đoán ung thư lympho không Hodgkin, giúp phát hiện sớm và điều trị kịp thời cho bệnh nhân.

V. Kết luận và triển vọng tương lai

Nghiên cứu biểu hiện gen kháng thể CD20 mở ra nhiều cơ hội mới trong việc phát hiện và điều trị ung thư lympho không Hodgkin. Việc phát triển các kháng thể mới có thể giúp cải thiện hiệu quả điều trị và giảm thiểu tác dụng phụ.

5.1. Tương lai của nghiên cứu kháng thể CD20

Nghiên cứu trong tương lai có thể tập trung vào việc phát triển các kháng thể mới với độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn, từ đó nâng cao hiệu quả chẩn đoán và điều trị.

5.2. Định hướng nghiên cứu tiếp theo

Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình sản xuất kháng thể và đánh giá hiệu quả lâm sàng của chúng trong điều trị ung thư lympho không Hodgkin.