Tổng quan luận án

Ung thư dạ dày là một trong những bệnh lý ác tính phổ biến và là nguyên nhân gây tử vong do ung thư đứng hàng thứ tư trên phạm vi toàn cầu. Tại Việt Nam, tỷ lệ mắc mới chuẩn hóa theo tuổi ở cả hai giới được ghi nhận ở mức cao, đạt khoảng 16,3/100.000 dân. Mặc dù các phương pháp chẩn đoán và can thiệp y khoa đã có nhiều cải tiến, tiên lượng điều trị ung thư dạ dày nhìn chung vẫn còn thấp với tỷ lệ sống thêm sau 5 năm chỉ đạt khoảng 28%. Các phác đồ hóa trị liệu truyền thống sử dụng hóa chất tổng hợp thường đi kèm độc tính cao đối với các mô lành, dẫn đến suy giảm thể trạng của người bệnh. Do đó, xu hướng nghiên cứu khai thác các hoạt chất có nguồn gốc tự nhiên nhằm hỗ trợ điều trị, gia tăng tính an toàn và hiệu quả trị liệu đang nhận được sự quan tâm lớn.

Curcumin là polyphenol chính chiết xuất từ thân rễ cây Nghệ vàng (Curcuma longa L., họ Zingiberaceae), bao gồm phức hợp curcuminoid với ba thành phần chính: curcumin I (khoảng 77%), curcumin II (demethoxycurcumin, khoảng 17%) và curcumin III (bisdemethoxycurcumin, khoảng 3%). Hoạt chất đã được chứng minh có nhiều tác dụng sinh học như kháng viêm, chống oxy hóa, kháng khuẩn (Helicobacter pylori), và đặc biệt là khả năng ức chế sự phát triển của nhiều dòng tế bào ung thư, trong đó có ung thư dạ dày. Tuy nhiên, việc phát triển các chế phẩm thuốc chứa curcumin dùng qua đường uống gặp phải nhiều rào cản sinh dược học lớn:

  • Độ tan trong nước rất thấp (khoảng 0,6 µg/mL ở điều kiện thường) và tốc độ hòa tan kém.
  • Kém bền vững trong môi trường kiềm (pH của ruột non), bị thoái hóa nhanh chóng trong thời gian dưới 30 phút.
  • Chuyển hóa bước đầu qua gan diễn ra mạnh mẽ (chủ yếu theo con đường liên hợp glucuronid hóa), làm giảm sút nghiêm trọng sinh khả dụng toàn thân.

Nhằm giải quyết các hạn chế trên, việc ứng dụng kỹ thuật tạo hệ phân tán rắn (HPTR) giúp tăng độ tan và tốc độ giải phóng của curcumin, kết hợp với dạng bào chế viên nén nổi trong dạ dày (có tỷ trọng nhỏ hơn 1,004 g/cm³) là một hướng tiếp cận có cơ sở khoa học. Dạng thuốc nổi giúp giữ dược chất lưu lại trong môi trường acid dịch vị trong thời gian kéo dài, giải phóng tại chỗ, tránh bị phân hủy bởi pH kiềm ở ruột non, từ đó nâng cao hiệu quả tác dụng tại niêm mạc dạ dày. Luận án tiến sĩ dược học của nghiên cứu sinh Huỳnh Thị Mỹ Duyên, thực hiện năm 2017 tại Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh dưới sự hướng dẫn khoa học của GS. TS. Vĩnh Định, mang tên: "Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng kháng ung thư của viên nén nổi chứa curcumin" (Chuyên ngành: Công nghệ dược phẩm và bào chế thuốc, Mã số: 62720402).

Luận án xác định 4 mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

  1. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng curcumin trong hệ phân tán rắn bằng phương pháp quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-Vis) và trong viên nén nổi bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
  2. Nghiên cứu bào chế hệ phân tán rắn (HPTR) chứa curcumin có độ hòa tan cao bằng các phương pháp và chất mang khác nhau.
  3. Nghiên cứu bào chế viên nén nổi chứa HPTR curcumin 100 mg.
  4. Đánh giá tác dụng kháng ung thư dạ dày của thành phần công thức viên nén nổi chứa HPTR curcumin 100 mg trên dòng tế bào ung thư ở người (in vitro) và trên chuột nhắt trắng (in vivo).

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Hoạt chất curcumin (độ tinh khiết nguyên liệu 95,5%), chất chuẩn curcumin I (độ tinh khiết 98,90%), các chất mang và tá dược polyme tạo khung nổi (PVP K30, PEG 6000, HPMC các loại: 606, K4M, K15M, 615; β-cyclodextrin, Tween 80, gôm xanthan, NaHCO3, acid citric...), dòng tế bào ung thư biểu mô dạ dày người N87, chuột nhắt trắng cái chủng Swiss albino (gây ung thư bằng 7,12-dimethylbenz(a)anthracene - DMBA), và chó thí nghiệm (đánh giá độ nổi in vivo).
  • Không gian nghiên cứu: Thực hiện tại Khoa Dược và Khoa Y - Trường Đại học Y Dược Cần Thơ; Công ty Cổ phần Dược Hậu Giang; Đại học Cần Thơ; Trung tâm Kiểm nghiệm Thuốc - Mỹ phẩm - Thực phẩm TP. Cần Thơ; Bộ môn Dược lý - Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh; Phòng Sinh học nano và ứng dụng - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
  • Thời gian hoàn thành: Năm 2017.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã tổng quan toàn diện các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế liên quan đến các lĩnh vực phân tích, bào chế và dược lý của curcumin:

1. Về phương pháp phân tích và thẩm định định lượng curcumin

  • Phương pháp quang phổ UV-Vis: Tang Bo và cộng sự (2002) định lượng phức curcumin/β-CD tại bước sóng 431 nm ($r^2 = 0,9991$); Goindi Shishu và cộng sự (2011) định lượng curcumin trong đệm pH 1,2 tại 430 nm ($r^2 = 0,9999$); Sharma Kiran và cộng sự (2012), Kadam Prasad Vijay và cộng sự (2013), Hazra Kalyan và cộng sự (2015), Holkar Vishal Vasant và cộng sự (2015) đã thẩm định quy trình định lượng curcumin trong methanol hoặc các dạng nano/kem bôi ở bước sóng 421–422 nm với hệ số tương quan tuyến tính $r^2 \ge 0,999$.
  • Phương pháp HPLC: Jadhav B-K và cộng sự (2007) sử dụng pha động ACN:0,1% TFA (50:50), bước sóng 420 nm; Ramshankar Yadav Vivek và cộng sự (2009) sử dụng cột C15 với pha động ACN:THF:2% acid acetic (50:30:20) tại 425 nm; Sonavaran C và cộng sự (2011) định lượng trong viên nén tại bước sóng 250 nm; Gugulothu Dalapathi và cộng sự (2013) định lượng trong huyết tương người; Jangle RD và Thorat BN (2013), Ang Lee Fung và cộng sự (2014), Long Yuling và cộng sự (2014) phát triển các hệ pha động chứa ACN và dung dịch đệm acid ở bước sóng 370–425 nm.

2. Về cải thiện độ tan và bào chế hệ phân tán rắn (HPTR) của curcumin

  • Yadav Vivek R. và cộng sự (2009) tạo phức cyclodextrin bằng phương pháp nghiền ướt làm tăng độ tan của curcumin lên 190–220 lần đối với methyl-β-CD và HP-β-CD; Tomren MA và cộng sự (2007) và Marcolino Vanessa Aparecida và cộng sự (2011) chứng minh tỷ lệ mol 1:2 giữa curcumin và β-CD cho độ ổn định cao nhờ liên kết hydro và lực Van der Waals.
  • Paradkar Anant và cộng sự (2004) dùng kỹ thuật phun sấy tạo HPTR curcumin:PVP (tỷ lệ 1:1 đến 1:10), chứng minh sự chuyển dịch cấu trúc sang dạng vô định hình giúp hòa tan hoàn toàn sau 30 phút. Dong-Hui Xu và cộng sự (2006) dùng phương pháp dung môi với PVP tỷ lệ 1:8 giúp tăng độ tan lên ít nhất 880 lần và cải thiện sinh khả dụng in vivo. Sattha Kaewnopparat và cộng sự (2009), Kumavat Suresh D và cộng sự (2013, 2014) khảo sát các hệ PVP K30, PVP K90, PEG 4000 cho thấy PVP phân tử lượng thấp và tỷ lệ tá dược cao làm tăng tính thấm ướt tốt hơn.
  • Joshi Vedamurthy và cộng sự (2010), Modasiya MK và Patel VM (2012) áp dụng phương pháp đun chảy với PEG 6000 (1:8) nâng cao độ tan từ 1000 đến 3800 lần. Waghmare Pranali và Kadu Pramod (2014) sử dụng HPMC K4M và K15M bằng phương pháp dung môi giúp độ tan tăng gấp 7–10 lần trong môi trường acid 0,1 N.

3. Về dạng thuốc nổi trong dạ dày chứa curcumin

  • Gupta Neeta và Aggarwal Nidhi (2008) bào chế viên nén nổi sủi bọt khí chứa phức curcumin-β-CD bằng phương pháp xát hạt ướt với HPMC K15, dicalci phosphat, Na2CO3, giải phóng 98% sau 24 giờ.
  • Goindi Shishu và cộng sự (2011) điều chế hạt nổi natri alginat kết hợp HPMC K15M và CaCO3 duy trì nổi 24 giờ.
  • Upmanyu Neeraj và cộng sự (2011), Kumar Kapil và AK Rai (2012), Ridhima D và cộng sự (2012) bào chế vi cầu nổi chứa curcumin bằng phương pháp bốc hơi dung môi sử dụng HPMC, Ethylcellulose, Eudragit S100/L100 đạt tỷ lệ nổi từ 50% đến 90%.
  • Rani Sobhita (2014) kết hợp Psyllium và HPMC K15M tạo viên nén nổi theo cơ chế Higuchi. Treesinchai Sakonjan và cộng sự (2015) thiết kế viên nhân bao màng tạo khí với Eudragit RL 30D duy trì nổi trên 480 phút.

4. Về tác dụng kháng ung thư của curcumin

  • Thử nghiệm in vitro: Zhao Jing và cộng sự (2007) trên dòng HeLa; Wang Dorothy và cộng sự (2008) trên tế bào ung thư vòm họng CAL27 và UM-SCC1; Tian Fang và cộng sự (2012) trên dòng BGC-823 phối hợp phác đồ FOLFOX ($IC_{50}$ của curcumin là 10 µM); Lu Wei-Dong và cộng sự (2013) trên dòng kháng thuốc HCT8/VCR; Liu Xiaohong và cộng sự (2014) trên dòng ung thư dạ dày SGC-7901; Li Xingyi và cộng sự (2014) trên nhiều dòng tế bào với $IC_{50}$ dao động 10–20 µg/mL.
  • Thử nghiệm in vivo: Azuine Magnus A và Bhide SV (1992), Huang Mou-Tuan và cộng sự (1994), Singh Shivendra V và cộng sự (1998) dùng chất sinh ung thư Benzo(a)pyrene (B(a)P) trên chuột cái A/J và Swiss; Gupta Neeta và Aggarwal Nidhi (2008) chứng minh viên nén nổi phức curcumin-β-CD làm giảm 50% tỷ lệ xuất hiện khối u; Sintara Kawiya và cộng sự (2012) dùng mô hình MNU và NaCl bão hòa trên chuột cống Wistar; Da Wei và cộng sự (2015) chứng minh curcumin làm giảm mật độ mạch bạch huyết và thể tích khối u cấy SGC-7901 trên chuột Balb/C.

Khoảng trống nghiên cứu luận án giải quyết: Tại thời điểm nghiên cứu, thị trường dược phẩm Việt Nam chưa có dạng thuốc nổi lưu dạ dày chứa curcumin và thiếu các nghiên cứu hệ thống kết hợp giữa tối ưu hóa công thức bào chế HPTR curcumin độ tan cao, tạo viên nén nổi giải phóng kéo dài, và kiểm chứng tác dụng kháng ung thư dạ dày đồng thời trên cả mô hình tế bào người N87 (in vitro) lẫn mô hình động vật gây ung thư bằng DMBA (in vivo).

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

1. Cơ sở lý thuyết và khung khái niệm

  • Lý thuyết về hệ phân tán rắn: Chuyển đổi trạng thái kết tinh của curcumin sang dạng vô định hình hoặc phân tán phân tử trong chất mang thân nước (polyme/chất diện hoạt), giảm kích thước tiểu phân và gia tăng tối đa diện tích tiếp xúc với môi trường hòa tan.
  • Nguyên lý hệ thống phân phối thuốc nổi (Hydrodynamically Balanced Systems): Sử dụng tá dược tạo khí ($NaHCO_3$, acid citric) phản ứng với dịch vị sinh khí $CO_2$. Khí sinh ra được giữ lại trong mạng lưới gel trương nở của các polyme thân nước (dẫn xuất HPMC, gôm xanthan), làm cho tỷ trọng toàn phần của viên giảm xuống dưới tỷ trọng của dịch vị ($\approx 1,004\text{ g/cm}^3$), giúp viên nổi và lưu lại ở phần trên của dạ dày trong suốt quá trình giải phóng dược chất.
  • Cơ chế gây ung thư dạ dày của DMBA (7,12-dimethylbenz(a)anthracene): Hydrocarbon thơm đa vòng này được chuyển hóa bởi enzym CYP1B1 và epoxid hydrolase thành chất trung gian hoạt động DMBA-3,4-dihydrodiol-1,2-epoxid (DMBA-DE), liên kết cộng hóa trị với ADN, kích hoạt các tiền gen sinh ung (proto-oncogene) thành gen sinh ung (oncogene), dẫn đến hình thành khối u niêm mạc dạ dày.
  • Phương pháp MTT thử độc tính tế bào: Dựa trên hoạt tính enzym succinat dehydrogenase (SDH) của ty thể trong tế bào sống khử muối tetrazolium MTT màu vàng thành tinh thể formazan màu tím tan trong dung môi hữu cơ, đo độ hấp thu quang phổ tại bước sóng 570 nm.

2. Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

A. Phương pháp phân tích và kiểm nghiệm

  • Định lượng bằng quang phổ tử ngoại - khả kiến (UV-Vis): Thực hiện trên máy Hitachi U-2800. Đo độ hấp thu tại bước sóng cực đại $\lambda_{\max} = 428\text{ nm}$ trong môi trường đệm pH 1,2.
  • Định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): Thực hiện trên hệ thống Hitachi L-2000 (đầu dò DAD) và Dionex UltiMate 3000. Cột phân tích Phenomenex Gemini RP C18 ($250 \times 4,6\text{ mm}, 5\text{ }\mu\text{m}$), nhiệt độ cột 50 °C, thể tích tiêm $10\text{ }\mu\text{L}$, tốc độ dòng $1,0\text{ mL/phút}$, bước sóng phát hiện 428 nm. Diện tích định lượng được tính theo tổng diện tích của 3 pic: curcumin I, II và III.
Điều kiện khảo sát Hệ dung môi pha động Tỷ lệ thể tích
Điều kiện 1 Acetonitril - acid formic 0,2% 90 : 10
Điều kiện 2 Acetonitril - acid formic 0,2% 70 : 30
Điều kiện 3 Acetonitril - acid formic 0,2% 50 : 50
Điều kiện 4 Acetonitril - acid formic 0,2% 40 : 60
Điều kiện 5 Acetonitril - acid phosphoric (pH 3,0) 70 : 30
Điều kiện 6 Acetonitril - acid phosphoric (pH 3,0) 50 : 50
Điều kiện 7 Acetonitril - acid phosphoric (pH 3,0) 45 : 55
  • Thẩm định quy trình phân tích: Theo hướng dẫn ICH Q2(R1), đánh giá tính tương thích hệ thống ($RSD \le 2,0%$), tính đặc hiệu (khảo sát mẫu trắng, mẫu phân hủy cưỡng bức bởi nhiệt độ 80 °C, $NaOH\text{ 1N}$, $H_2O_2\text{ 30%}$, đệm pH 8, ánh sáng), tính tuyến tính ($r^2 \ge 0,9980$), độ đúng (tỷ lệ phục hồi trong khoảng 97%–103%), độ chính xác (độ lặp lại và độ chính xác trung gian có $RSD \le 2,0%$).

B. Phương pháp bào chế và đánh giá đặc tính lý hóa

  • Bào chế HPTR: So sánh các phương pháp nghiền ướt, đun chảy và bốc hơi dung môi với các hệ chất mang: $\beta\text{-CD}$, PEG 6000, PVP K30, HPMC 606 và Tween 80 ở các tỷ lệ phối hợp khác nhau.
  • Đặc tính hóa lý HPTR: Quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR), phân tích nhiệt vi sai (DSC), và kính hiển vi điện tử quét (SEM). Thử nghiệm độ hòa tan trong thiết bị ERWEKA DT-800 với môi trường đệm pH 1,2.
  • Bào chế viên nén nổi: Phương pháp xát hạt ướt và dập viên trên máy Rimek Mini Press-I. Khảo sát ảnh hưởng của tá dược dính, tỷ lệ dung môi xát hạt, tá dược tạo khí ($NaHCO_3$, acid citric), tá dược tạo khung trương nở (gôm xanthan, HPMC K4M, HPMC K15M, HPMC 615), lực nén/độ cứng của viên.
  • Tối ưu hóa công thức: Ứng dụng phần mềm Design-Expert theo mô hình bề mặt đáp ứng để xác định công thức tối ưu, tiến hành sản xuất kiểm chứng 3 lô quy mô 2.000 viên/lô.
  • Đánh giá độ nổi in vivo: Thử nghiệm chụp phim X-quang dạ dày trên chó sau khi uống viên thuốc để kiểm chứng thời gian lưu và trạng thái nổi trong môi trường sinh học thực tế.
  • Nghiên cứu độ ổn định: Theo hướng dẫn của WHO, ASEAN và Bộ Y tế: thử nghiệm lão hóa cấp tốc (40 °C ± 2 °C, $75% \pm 5%\text{ RH}$ trong 6 tháng) và thử nghiệm dài hạn (30 °C ± 2 °C, $75% \pm 5%\text{ RH}$ trong 24 tháng).

C. Phương pháp thử tác dụng sinh học

  • Thử nghiệm in vitro: Đánh giá độc tính tế bào trên dòng ung thư biểu mô dạ dày người N87 bằng phương pháp MTT. Đo mật độ quang OD tại 570 nm sau 48 giờ xử lý mẫu, tính phần trăm ức chế tế bào và xác định giá trị $IC_{50}$ thông qua phương trình hồi quy.
  • Thử nghiệm in vivo: Chuột nhắt trắng cái chủng Swiss albino được gây ung thư dạ dày thực nghiệm bằng DMBA. Đánh giá hiệu quả phòng ngừa và điều trị thông qua theo dõi tỷ lệ sống sót, sự thay đổi khối lượng cơ thể, chỉ số mỡ, tỷ lệ xuất hiện khối u ngoài da và khối u dạ dày, kết hợp phân tích tổn thương mô bệnh học đại thể và vi thể (nhuộm HE) từ tuần thứ 5 đến tuần thứ 24; đối chứng với thuốc hóa trị chuẩn 5-Fluorouracil (5-FU).

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Tổng quan tài liệu

Chương này tổng thuật chi tiết 5 nội dung chính:

  1. Nguồn gốc, cấu trúc hóa học, tính chất lý hóa (nhiệt độ nóng chảy 183 °C, bước sóng hấp thu cực đại 430 nm trong methanol, hệ số phân bố dầu-nước $\log P = 3,2$), chuyển hóa và hoạt tính dược lý phong phú của curcumin trong việc can thiệp vào các giai đoạn phát triển của khối u.
  2. Cơ sở lý thuyết về thẩm định quy trình phân tích theo ICH Q2(R1) và thử độ ổn định thuốc theo hướng dẫn của WHO, ASEAN, Bộ Y tế; tổng thuật các phương pháp phân tích UV-Vis, HPLC và độ bền của curcumin dưới các tác nhân phân hủy.
  3. Nguyên lý các kỹ thuật bào chế HPTR (phương pháp dung môi, đun chảy, nghiền ướt, đùn nóng chảy, chất lỏng siêu tới hạn) và các phương pháp đánh giá cấu trúc (IR, DSC, SEM) nhằm nâng cao độ tan của các hoạt chất kém tan.
  4. Tổng quan về các hệ thống phân phối thuốc nổi trong dạ dày (hệ sủi bọt khí và không sủi bọt khí), các nhóm tá dược tạo khung, tá dược sinh khí, kỹ thuật bào chế và các tiêu chí kiểm soát chất lượng (tiềm thời, thời gian nổi, duy trì hình dạng, X-quang in vivo).
  5. Bệnh sinh ung thư dạ dày (yếu tố môi trường, vi khuẩn H. pylori, biến đổi gen), phân loại mô bệnh học theo WHO 2010, cơ chế gây độc tế bào, phương pháp thử MTT trên dòng tế bào N87 và mô hình gây ung thư thực nghiệm trên động vật bằng DMBA.

Chương 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Trình bày đầy đủ tiêu chuẩn và nguồn gốc của tất cả các nguyên liệu, dung môi đạt tiêu chuẩn phân tích HPLC, tá dược đạt chuẩn Dược điển Mỹ (USP 36), Dược điển Anh (BP 2013), Dược điển Việt Nam (DĐVN IV). Mô tả chi tiết hệ thống trang thiết bị hiện đại (HPLC Dionex, HPLC Hitachi L2000, máy đo độ hòa tan Erweka DT-800, máy dập viên Rimek, tủ vi khí hậu Contherm...).

Xây dựng các quy trình thực nghiệm chi tiết cho từng bước:

  • Quy trình chuẩn bị mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu trắng và điều kiện thẩm định định lượng UV-Vis và HPLC.
  • Quy trình điều chế các công thức HPTR curcumin với các hệ chất mang ($\beta\text{-CD}$, PVP K30, PEG 6000, HPMC 606, Tween 80).
  • Quy trình thăm dò công thức viên placebo, viên chứa hoạt chất, khảo sát tá dược dính, tỷ lệ cồn, tỷ lệ chất sinh khí ($NaHCO_3 : \text{acid citric}$), tỷ lệ polyme trương nở tạo khung gel.
  • Quy trình tối ưu hóa công thức bằng phần mềm Design-Expert.
  • Thiết kế thí nghiệm đánh giá tế bào N87 (in vitro) và thiết kế các lô thí nghiệm chuột nhắt trắng Swiss albino gây ung thư bởi DMBA theo dõi trong 24 tuần (in vivo).

Chương 3. Kết quả nghiên cứu

1. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng curcumin

  • Phương pháp UV-Vis: Xác định bước sóng định lượng tối ưu tại 428 nm trong môi trường đệm pH 1,2. Phương pháp đạt tính đặc hiệu cao, không bị ảnh hưởng bởi tá dược ($A_0/A \times 100 \le 2%$). Khoảng tuyến tính đạt từ 1–10 µg/mL với phương trình hồi quy tuyến tính có hệ số tương quan $r^2 \ge 0,998$. Độ đúng có tỷ lệ phục hồi đạt trong khoảng 97%–103%, độ chính xác có $RSD \le 2,0%$.
  • Phương pháp HPLC: Khảo sát 7 điều kiện pha động, xác định điều kiện tối ưu số 6: Acetonitril - dung dịch acid phosphoric pH 3,0 (tỷ lệ 50 : 50 v/v), nhiệt độ cột 50 °C, bước sóng 428 nm. Sắc ký đồ cho thấy tách biệt hoàn toàn 3 pic curcuminoid (curcumin I, II, III), pic cân đối ($0,8 \le A_s \le 1,5$), thời gian lưu thích hợp, tách rõ ràng curcumin khỏi các pic sản phẩm phân hủy khi thử nghiệm trong môi trường kiềm, acid, chất oxy hóa, nhiệt độ và ánh sáng. Tính tương thích hệ thống, tính tuyến tính, độ lặp lại và độ chính xác trung gian đều đạt yêu cầu $RSD < 2,0%$.

2. Bào chế và đánh giá hệ phân tán rắn (HPTR) curcumin

  • Khảo sát các hệ chất mang: $\beta\text{-CD}$ kết hợp Tween 80; $\beta\text{-CD}$ kết hợp PVP K30; PEG 6000/PVP K30; PEG 6000/HPMC 606; PVP K30 kết hợp Tween 80 qua các phương pháp nghiền ướt, đun chảy và dung môi.
  • Kết quả thử độ hòa tan trong đệm pH 1,2 cho thấy công thức HPTR curcumin : PVP K30 : Tween 80 bào chế bằng phương pháp nghiền ướt (ký hiệu công thức N_F3) có độ giải phóng hoạt chất vượt trội so với curcumin nguyên liệu.
  • Phân tích hóa lý:
    • Phổ FT-IR và DSC chứng minh sự tương tác liên kết giữa curcumin với PVP K30 và Tween 80, đỉnh nội nhiệt đặc trưng của tinh thể curcumin biến mất trên nhiệt đồ DSC, khẳng định hoạt chất đã chuyển sang trạng thái vô định hình.
    • Ảnh chụp SEM cho thấy không còn các tinh thể curcumin dạng góc cạnh ban đầu mà chuyển thành cấu trúc vi hạt phân tán đồng nhất trong khung tá dược.
    • Thử nghiệm độ lặp lại và độ ổn định của quá trình hòa tan chứng minh HPTR duy trì tốc độ và mức độ giải phóng cao sau các khoảng thời gian bảo quản.

3. Nghiên cứu bào chế viên nén nổi chứa HPTR curcumin 100 mg

  • Khảo sát các thông số công nghệ: xác định nồng độ tá dược dính PVP K30 và tỷ lệ dung môi xát hạt phù hợp; xác định tỷ lệ cặp tá dược sinh khí $NaHCO_3 : \text{acid citric}$ đạt khả năng tạo bọt khí nhanh; lựa chọn hệ polyme trương nở tạo gel gồm HPMC K4M kết hợp HPMC 615 và gôm xanthan để kiểm soát tốc độ giải phóng và duy trì độ bền khung nổi; xác định dải lực nén tạo độ cứng viên tối ưu.
  • Tối ưu hóa bằng Design-Expert: Thiết lập phương trình hồi quy biểu diễn mối quan hệ giữa các biến đầu vào và các biến đáp ứng (tiềm thời nổi, thời gian nổi, tỷ lệ giải phóng curcumin sau 1 giờ, 4 giờ, 8 giờ, 12 giờ).
  • Kết quả thực nghiệm 3 lô kiểm chứng quy mô 2.000 viên/lô hoàn toàn phù hợp với các giá trị dự đoán lý thuyết của mô hình. Viên có tiềm thời nổi ngắn (< 5 phút), thời gian nổi duy trì liên tục trên 12–16 giờ, hoạt chất giải phóng kéo dài theo mô hình động học định sẵn.
  • Thử nghiệm in vivo trên chó: Phim chụp X-quang dạ dày chứng minh viên nén nổi duy trì trạng thái nổi và lưu lại trong dạ dày chó trong suốt thời gian khảo sát.
  • Đánh giá độ ổn định: 3 lô sản xuất thử nghiệm đạt các chỉ tiêu chất lượng (độ cứng, độ mài mòn, độ đồng đều khối lượng, hàm lượng hoạt chất, độ nổi và độ hòa tan) sau 6 tháng ở điều kiện lão hóa cấp tốc ($40\text{ }^\circ\text{C} / 75%\text{ RH}$) và sau 24 tháng ở điều kiện dài hạn ($30\text{ }^\circ\text{C} / 75%\text{ RH}$).

4. Đánh giá tác dụng kháng ung thư dạ dày (in vitro và in vivo)

  • Thử nghiệm in vitro trên tế bào ung thư dạ dày người N87:
    • Dịch chiết từ viên nén nổi chứa HPTR curcumin 100 mg và curcumin chuẩn thể hiện khả năng ức chế mạnh sự tăng sinh của tế bào N87 theo cơ chế phụ thuộc nồng độ sau 48 giờ nuôi cấy.
    • Xác định phương trình hồi quy và giá trị $IC_{50}$ của các mẫu thử: mẫu viên nén nổi HPTR curcumin có hoạt tính ức chế mạnh tế bào N87, làm biến đổi hình thái tế bào, co cụm và thoái hóa rõ rệt quan sát dưới kính hiển vi quang học.
  • Thử nghiệm in vivo trên chuột nhắt trắng gây ung thư bằng DMBA:
    • Theo dõi liên tục trong 24 tuần: Lô chuột đối chứng uống DMBA không điều trị xuất hiện khối u ngoài da và khối u dạ dày với tỷ lệ cao, suy giảm khối lượng và chỉ số mỡ, có chuột chết trong tiến trình thử nghiệm.
    • Lô chuột được điều trị bằng viên nén nổi chứa HPTR curcumin 100 mg có sự cải thiện rõ rệt: giảm tỷ lệ hình thành khối u, giảm kích thước và số lượng u đại thể ở dạ dày, ức chế tiến triển các biến đổi loạn sản/ung thư biểu mô trên hình ảnh vi thể mô bệnh học, tỷ lệ chuột sống sót cao hơn tương đương với nhóm điều trị bằng hóa chất chuẩn 5-FU nhưng không gây độc tính làm sụt giảm thể trọng nghiêm trọng như 5-FU.

Kết quả và những đóng góp mới

1. Đóng góp về mặt phương pháp phân tích và công nghệ bào chế

  • Đã xây dựng và thẩm định thành công hai quy trình định lượng curcumin: phương pháp quang phổ UV-Vis nhanh chóng, tiện lợi cho việc kiểm tra độ hòa tan của hệ phân tán rắn; phương pháp HPLC có độ chọn lọc và độ đặc hiệu cao, tách định lượng đồng thời các phân đoạn curcuminoid ngay cả trong điều kiện có mặt sản phẩm phân hủy, áp dụng kiểm nghiệm viên nén nổi.
  • Thiết lập thành công công thức và quy trình bào chế hệ phân tán rắn curcumin với hệ chất mang PVP K30 và Tween 80 bằng phương pháp nghiền ướt, giúp chuyển đổi dạng kết tinh của curcumin sang dạng vô định hình, cải thiện độ tan trong môi trường acid dịch vị lên nhiều lần so với nguyên liệu ban đầu.
  • Ứng dụng thành công mô hình toán học tối ưu hóa công thức viên nén nổi giải phóng kéo dài chứa HPTR curcumin 100 mg; sản xuất ổn định ở quy mô pilot 2.000 viên/lô. Chế phẩm có tiềm thời nổi ngắn, thời gian nổi kéo dài trên 12 giờ, giải phóng hoạt chất ổn định và đạt hạn dùng 24 tháng ở điều kiện bảo quản thực tế.

2. Đóng góp về mặt dược lý thực nghiệm

  • Cung cấp các bằng chứng khoa học chứng minh chế phẩm viên nén nổi HPTR curcumin 100 mg có hoạt tính độc tế bào cao trên dòng tế bào ung thư biểu mô dạ dày người N87 (in vitro).
  • Chứng minh trên mô hình động vật (in vivo) rằng viên nén nổi HPTR curcumin có tác dụng ức chế rõ rệt sự hình thành và phát triển khối u dạ dày gây bởi DMBA trên chuột nhắt trắng Swiss albino, giảm thiểu tổn thương vi thể niêm mạc dạ dày và nâng cao tỷ lệ sống của động vật thí nghiệm mà không gây độc tính toàn thân.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

1. Hạn chế của đề tài

  • Các thử nghiệm sinh học in vivo đánh giá khả năng kháng ung thư dạ dày được thực hiện trên mô hình chuột gặm nhấm gây ung thư bằng hóa chất DMBA; đặc tính sinh học và đáp ứng miễn dịch có những điểm khác biệt nhất định so với quá trình phát sinh bệnh học tự nhiên ở người.
  • Nghiên cứu độ nổi in vivo mới dừng lại ở việc quan sát hình ảnh X-quang trên động vật thực nghiệm lớn (chó), chưa tiến hành thử nghiệm lâm sàng trực tiếp trên người tình nguyện khỏe mạnh hoặc bệnh nhân ung thư dạ dày.

2. Hướng nghiên cứu tiếp theo

  • Triển khai các nghiên cứu dược động học, sinh khả dụng và phân bố thuốc tại mô dạ dày người trên lâm sàng.
  • Khảo sát hiệu quả điều trị kết hợp giữa viên nén nổi HPTR curcumin với các thuốc hóa trị liệu ung thư dạ dày chuẩn (như 5-FU, cisplatin, oxaliplatin) để đánh giá khả năng hiệp đồng tác dụng và giảm độc tính của hóa chất.
  • Nâng cấp quy trình sản xuất viên nén nổi lên quy mô công nghiệp tại nhà máy sản xuất đạt tiêu chuẩn GMP-WHO.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu chuyên khảo có giá trị ứng dụng cao đối với:

  • Nghiên cứu sinh, học viên cao học, giảng viên chuyên ngành Công nghệ Dược phẩm và Bào chế thuốc: Tham khảo phương pháp xây dựng hệ phân tán rắn cải thiện độ tan của hoạt chất kém tan nhóm II/IV (theo hệ thống phân loại sinh dược học BCS); kỹ thuật thiết kế và tối ưu hóa hệ thuốc nổi lưu dạ dày bằng phần mềm chuyên dụng (Design-Expert).
  • Cán bộ nghiên cứu và kiểm nghiệm dược phẩm: Tham khảo quy trình phân tích và thẩm định định lượng curcumin theo tiêu chuẩn ICH Q2(R1) bằng UV-Vis và HPLC-DAD; phương pháp đánh giá độ ổn định thuốc theo chuẩn ASEAN/WHO.
  • Nhà khoa học trong lĩnh vực Dược lý - Độc chất và Ung thư học: Cung cấp quy trình chuẩn thử nghiệm độc tính tế bào in vitro (phương pháp MTT trên dòng N87) và quy trình thiết lập mô hình gây ung thư thực nghiệm in vivo bằng DMBA trên chuột nhắt trắng.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao cần bào chế curcumin dưới dạng hệ phân tán rắn và viên nén nổi trong dạ dày?

Curcumin có độ tan trong nước rất kém (0,6 µg/mL) và bị phân hủy nhanh chóng trong môi trường kiềm ở ruột non (< 30 phút). Bào chế dưới dạng hệ phân tán rắn giúp chuyển hoạt chất sang trạng thái vô định hình, tăng tối đa độ hòa tan. Khi kết hợp vào dạng viên nén nổi, viên sẽ lưu lại ở dạ dày trong thời gian dài, giải phóng liên tục hoạt chất trong môi trường acid dịch vị, giúp curcumin tác dụng trực tiếp tại niêm mạc dạ dày và tránh bị phân hủy ở ruột.

2. Quy trình HPLC định lượng curcumin trong viên nén nổi được thiết lập với điều kiện nào?

Quy trình HPLC sử dụng cột Phenomenex Gemini RP C18 ($250 \times 4,6\text{ mm}, 5\text{ }\mu\text{m}$), pha động Acetonitril : dung dịch acid phosphoric pH 3,0 (tỷ lệ 50 : 50 v/v), nhiệt độ cột 50 °C, bước sóng phát hiện 428 nm, tốc độ dòng 1,0 mL/phút, thể tích tiêm 10 µL. Quy trình tách rõ 3 phân đoạn curcumin I, II, III và tách biệt hoàn toàn với các sản phẩm phân hủy.

3. Hệ chất mang nào cho kết quả cải thiện độ tan curcumin tốt nhất trong luận án?

Hệ chất mang phối hợp giữa Polyvinylpyrrolidon (PVP K30) và Tween 80 điều chế bằng phương pháp nghiền ướt (công thức N_F3) cho độ hòa tan curcumin trong môi trường acid pH 1,2 cao nhất và ổn định nhất, chuyển đổi hoàn toàn cấu trúc tinh thể của curcumin sang dạng vô định hình.

4. Độc tính tế bào in vitro của chế phẩm được đánh giá trên dòng tế bào nào và bằng phương pháp gì?

Độc tính tế bào được đánh giá trên dòng tế bào ung thư biểu mô dạ dày người N87 (Hoa Kỳ) bằng phương pháp MTT, đo mật độ quang ở bước sóng 570 nm sau 48 giờ tiếp xúc với mẫu thử để xác định tỷ lệ ức chế tăng sinh và giá trị $IC_{50}$.

5. Mô hình thử nghiệm in vivo đánh giá tác dụng kháng ung thư dạ dày được thiết kế như thế nào?

Thực hiện trên chuột nhắt trắng cái chủng Swiss albino bị gây ung thư bằng hóa chất 7,12-dimethylbenz(a)anthracene (DMBA). Quá trình theo dõi kéo dài từ tuần thứ 5 đến tuần thứ 24, đánh giá tỷ lệ tử vong, sự phát triển khối u ngoài da, các biến đổi đại thể và vi thể mô bệnh học tại dạ dày, so sánh hiệu quả giữa nhóm dùng viên nén nổi HPTR curcumin với nhóm chứng và nhóm dùng hóa chất 5-Fluorouracil (5-FU).

Kết luận

Luận án của nghiên cứu sinh Huỳnh Thị Mỹ Duyên đã giải quyết trọn vẹn vấn đề nâng cao độ tan và độ ổn định sinh học của curcumin thông qua việc phát triển thành công viên nén nổi lưu dạ dày chứa hệ phân tán rắn curcumin 100 mg. Đề tài đã chuẩn hóa các quy trình phân tích định lượng (UV-Vis, HPLC), tối ưu hóa công thức bào chế đạt độ ổn định 24 tháng, và kiểm chứng cơ chế nổi in vivo trên động vật lớn. Đồng thời, các kết quả thực nghiệm in vitro trên tế bào N87 và in vivo trên mô hình chuột gây ung thư bằng DMBA đã chứng minh hiệu quả ức chế phát triển ung thư dạ dày rõ rệt của chế phẩm, mở ra tiềm năng ứng dụng thực tiễn trong hỗ trợ điều trị ung thư dạ dày.