CHƯƠNG 1 TỎNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược về cây hoa tím Ba Tư 1.1 Nguồn gốc của hoa tím Ba Tư Hoa tím Ba Tư (Exacum affine Balf. Ex Regel) là một loài thực vật thuộc họ Long Đởm (Gentianaceae), chi Exacum. Đây là loài đặc hữu của quần dao Socotra của Yemen (Miller và Morris, 2004). Môi trường sống tự nhiên của chúng là vùng nhiều đá.
Day là một cây thân thảo nhỏ mọc hai năm một lần cao 20 — 30 cm với lá màu lục đậm và có hình trứng. Hoa nhỏ màu tím với nhị màu vàng và có hương thơm. Hoa được trồng rộng rãi như một loại cây trồng trong nhà ở châu Âu dưới nhiều tên khác nhau bao gồm tim Ba Tu, tim A rap, tím Đức nhưng thường được biết đến với tên thương mại là hoa tím Ba Tư.2 Phân bố của hoa tím Ba Tư Loài này phân bố rộng rãi, điển hình là ở các bãi cỏ dưới nước hoặc trong các khe và hốc đá lấy nước, trên cả đá granit và đá vôi. Nó hiện diện ở độ cao từ mực nước biển đến 1.050 m với 40 loài đã biết của chi Exacum (Cronquist A., 1988) phân bố trên một phạm vi rộng từ khu vực trung tâm của Châu Phi, bao gồm cả Madagascar, đến bán đảo A Rap, Đông An Độ, dãy Himalaya và Sri Lanka, Malaysia, phần phía đông của New Zealand (Riseman va Craig, 1995), Châu Au, Nhat Ban, Hoa Ky (Serek va Trolle, 2000).
Các thành phần của Exacum affine là axit p-coumaric, affinoside va glucozit (Kuvajima và ctv, 1996). Ngoài công dung làm cảnh, một số nghiên cứu cũng đã chứng minh cây hoa tím Ba Tư còn là nguồn chuyên hóa thứ cấp đặc biệt trong sản xuất acid phenolic và dau bay hơi (Skrzypczak-Pietraszek và ctv, 2014, 2015) và cũng là nguồn tiềm năng phát triển thuốc kháng vi rút (Mothana và ctv, 2006). Chủ yếu, tím Ba Tư được bán cho người tiêu dùng dưới dạng cây trồng trong chậu thông qua những người bán hoa và nhà kính. Đan Mạch sản xuất khoảng 65% nguồn cung của thé giới, trong khi Hà Lan bé sung thêm 20%.
Ra hoa in vitro là một hiện tượng độc quyền trong công nghệ nuôi cấy mô thực vật. Sự có nhân tạo này cho thay quá trình chuyên đổi từ tăng trưởng sinh dưỡng sang sinh sản có thể xảy ra trong điều kiện vô trùng và hoàn thành vòng đời của thực vật. Nhiều cây trồng có thé tạo ra những bông hoa in vitro hap dẫn. Do đó, điều này đã dẫn đến việc du nhập các loại cây nở hoa trong các bình nuôi cấy kín, chẳng hạn như cây tím Ba Tư, hiện đang được bán trên nhiều nền tảng ở Thái Lan.
Nhà ở ở nhiều khu đô thị đã được chuyên thành chung cư, thường sử dụng chậu cây để trang trí. Hoa tím Ba Tư được nuôi trồng trong in vitro có thé dùng dé trang trí văn phòng và thay thế những chậu cây trang trí nhà cửa mà không cân tưới nước, bón phân. Ở Việt Nam hoa tím Ba Tư trồng chậu chưa phô biến chỉ giới hạn ở các thí nghiệm nghiên cứu in vitro.2 Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.1 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật Nhân giống vô tính là hình thức nhân giống thông qua các cơ quan dinh dưỡng (thân, lá, vỏ, củ.) bao gồm các phương pháp giâm cành, chiết cành, mắt ghép vả nuôi cấy in vitro. Trong đó nuôi cấy in vitro được coi là phương pháp hữu hiệu nhất.
Nhân giống vô tinh in vitro được tiến hành trên nguyên tắc cắt nuôi đoạn thân có mang chéi 4 ở nách lá, đoạn rễ hay mảnh củ, cánh hoa, có kích thước nhỏ phù hợp với điều kiện vô trùng của ống nghiệm. Phương pháp nhân giống in vitro được bổ sung cho các kỹ thuật nhân giống vô tính cổ điển như giâm, chiết, ghép tach dòng một kĩ thuật tiến bộ với những ưu điểm như: Tốc độ nhân giống cao. Chủ động sản xuat, không phụ thuộc vào điều kiện thời tiết, mùa vụ. Có khả năng công nghiệp hóa cao do nuôi cấy trong điều kiện ổn định về môi trường dinh dưỡng, nhiệt độ, ánh sáng, do đó có thể công nghiệp hóa hoàn toàn từ khâu nhân cây giống với số lượng lớn đến khi ươm trồng trong nhà lưới.
Kỹ thuật nuôi cấy mô dùng cho cả hai mục đích nhân giống và cải thiện di truyền (ví dụ: giống cây trồng), sản xuất sinh khối các sản phẩm hóa sinh, bệnh học thực vật, duy trì và bảo quản các nguồn gen quý.2 Nhân giống vô tinh in vitro — ưu nhược điểm của phương pháp Theo Ngô Xuân Bình và ctv (2000). "Nhân giống vô tinh in vitro là phương pháp sản xuất hàng loạt cây con từ các bộ phận của cây (các cơ quan, mô, tế bảo) bằng cách nuôi cấy chúng trong ống nghiệm ở điều kiện vô trùng tuyệt đối có môi trường nuôi cấy thích hợp và được kiểm soát".2 Ưu điểm của nuôi cấy mô in vitro Nuôi cay mô in vitro có khả năng tái sinh cây con từ các vùng mô và cơ quan khác nhau của cây như long thân, phiến lá, cuống lá, hoa, chỗồi phat hoa, hạt phan. Được nuôi cay trong điều kiện vô trùng, cây khỏe mạnh, sạch virus thông qua xử lí nhiệt hay nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Có thể sản xuất quanh năm và chủ động kiểm soát được các yếu tố ngoại cảnh như nhiệt độ, ánh sáng, độ am.
Hệ số nhân giống cao. Nhân được số lượng cây lớn trong một diện tích nhỏ. Dé dàng tạo giống cây trồng mới bằng phương pháp chuyền gen.2 Nhược điểm của nuôi cấy mô in vitro Quá trình nuôi cấy mô in vitro phức tap và cần khoảng thời gian dài trước khi cây có thê thích ứng trồng ngoài vườn ươm. Dễ xuất hiện các biến đị soma trong quá trình nuôi cay đặc biệt tai sinh qua mô seo.
Chi phi dau tư cho dụng cụ, thiết bị và phòng thí nghiệm nuôi cấy mô rat cao.3 Sơ lược lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật Nuôi cấy mô tế bào thực vật đư trải qua một lịch sử phát triển lâu dài và được đánh dấu bằng những sự kiện chính sau: Năm 1902, Harberlandt lần đầu tiên đưa ra các lý thuyết và Schneider và Butschli (người mô tả chính xác quá trình phân chia tế bào) vào thực nghiệm nuôi cấy mô cây 1 lá mầm nhưng không thành công. Năm 1929 - 1933 lần lượt Bchumuker, Scheitter, Pfcifer và Lance thành công trong việc nuôi cay một đoạn đầu mút rễ hoàn chỉnh. Năm 1934, Kogl lần đầu tiên xác định được vai trò của IAA, một hooc môn thực vật đầu tiên thuộc nhóm Auxin có khả năng kích thích sự phát triển tăng trưởng và phân chia tế bào thực vật. Năm 1939, Gautheret, Nobecourt và White đã đồng thời nuôi cấy mô sẹo thành công trong thời gian dài từ mô tượng tầng, Nobetcourt nuôi cấy củ Cà rốt và nhận được sự phân bào tạo ra khối tế bào phân chia.
Năm 1941, Overbeek và cộng sự đư sử dụng nước dừa trong nuôi cay phôi non ở cây cà rốt Patura. Năm 1955, Miller và cộng sự phát minh ra cấu trúc và sinh tổng hợp Kinetin là 1 cytokinin đóng vai trò quan trọng trong phân bào và phân hóa chéi ở mô nuôi cấy. Năm 1957, Skoog va Miller tạo ra được chéi từ mảnh mô thân cây thuốc lá đồng thời khám phá vai trò của ty lệ nồng độ các chất Auxin/ Cytokinin, nồng độ auxin/ nồng độ cytokinin < 1 có xu hướng tạo ra chồi. Ngược lại khi nồng độ auxin/ nồng độ cytokinin >1 mô có xu hướng tạo rễ.
Tỷ lệ nồng độ auxin va cytokinin thích hợp sẽ kích thích phân hóa cả chồi và rễ, tạo cây hoàn chỉnh. Năm 1958, Keinert và Sterward tạo được phôi và cây hoàn chỉnh từ tế bào tượng tang tách từ cây ca rốt được nuôi cấy một dạng huyền phù. 6 Năm 1960, Morel đư thực hiện bước ngoặt cách mạng trong sử dụng kỹ thuật nuôi cay đỉnh sinh trưởng trong nhân nhanh các loại địa lan cymbidim. Năm 1960, Cooking lần đầu tiên sử dụng enzim phân giải thành tế bào và đư tạo ra số lượng lớn tế bảo trần ở những cây trồng khác nhau.
Năm 1966, Guha và cộng sự thành công trong nuôi cấy thé đơn bội ở cà độc dược từ bao phan. Năm 1967- 1968, lần lượt Nichkoi Nakato va cộng sự tạo được cây đơn bội từ bao phan thuốc lá. Năm 1971, Takeb tái sinh thành công cây thuốc lá từ tế bào trần. Năm 1972, Carlson và cộng sự lần đầu tiên thực hiện lai tế bào soma giữa các loài, tạo được cây từ dung hợp tế bao trần của 2 loài thuốc lá Nicotiana glauca và N.
Năm 1977, Chers lai thành công tế bào soma cây cà chua và cây khoai tây. Từ năm 1977 đến nay, công nghệ tế bào thực vật đư có những bước tiễn vượt bậc với việc áp dụng các công nghệ cao trong chọn tạo giống cây trồng như: đột biến tế bao soma, cứu phôi lai xa, dung hợp tế bao trần, tạo dòng kháng thé, nuôi cấy bao phan, hạt phan trên nhiều đối tượng cây trồng. Chúng ta đang bước vào giai đoạn thứ tư của nuôi cấy mô tế bào, đây là giai đoạn nuôi cay mô tế bào được ứng dụng mạnh mẽ vào thực tiễn chọn giống, nhân giống, sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học và nghiên cứu lý luận di truyền ở thực vật bậc cao.4 Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.1 Tính toàn năng (Totipotence) của té bào Năm 1902, Nhà Sinh lý thực vật học người Đức Haberlandt, đã tiến hành nuôi cấy các tế bào thực vật để chứng minh tế bào là toàn năng. Haberlandt cho rang mỗi tế bào của bat kỳ sinh vật nào cũng đều có khả năng tiềm tang dé phát triển thành một cơ thé hoàn chỉnh.
Mỗi tế bao của cơ thé da bào đều phát sinh từ hợp bào thông qua quá trình phân bào nguyên nhiễm. Điều đó có nghĩa là mỗi tế bào của một sinh vật sẽ chứa toàn bộ thông tin di truyền cần thiết của một cơ thé hoàn chỉnh. Khi gặp điều kiện thuận lợi nhất định, những tế bào đó có thể sẽ phát triển thành một cơ thé hoàn chỉnh. Miller và Skoog (1953) đã thành công khi thực nghiệm tái sinh cây con từ tế bảo lá, chứng minh được tính toàn năng của tế bào.
Thành công trên đã tạo ra công nghệ mới: công nghệ sinh học ứng dụng trong nhân giống vô tính, tạo giống cây trồng và dòng chống chịu.2 Sự phân hoá và phản phân hoá tế bào Theo Nguyễn Quang Thạch và ctv, 2003 cơ thể thực vật trưởng thành là một chỉnh thê thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, trong đó có nhiều loại tế bào thực hiện các chức năng khác nhau.