Chương 1 TONG QUAN TÀI LIEU 1.1 Giới thiệu về cây lan gam 1.1 Phân loại thực vật Lan gam là một loài thực vat có hoa thuộc họ Lan. Loài này được Hayata mô tả khoa học đầu tiên năm 1914. Phân loại khoa học: Ngành thực vật hạt kín: Magnoliophyta Lớp một lá mầm: Monocots Bộ Măng Tây: Asparagales Họ Lan: Orchidaceae Chi: Anoectochilus Danh pháp khoa học: Anoectochilus formosanus Hayata.2 Nguồn gốc Lan gam (Anoectochilus formosanus Hayata.) hay còn gọi là lan Kim Tuyến, lan Cui Dia, Thạch Tam, lá gam, Kim Cương. Lan gam có nguồn gốc là loài thực vật hoang dã phát xuất từ Đài Loan, Nhật Bản và Hồng Kông (Kumar và Gale, 2020), chúng thường mọc ở những khu vực có âm độ cao hay dọc theo các thung lũng của rừng lá rộng thường xanh, trên vùng đất có nhiều mùn lá rụng, trên đá có phủ rêu (Amritpal và Sanjiv, 2009).
Việt Nam có 16 loài thuộc chi Anoectochilus (Nguyễn Tiến Bân, 2005; Nguyễn Trọng Quyền và ctv, 2020), Anoectochilus formosanus Hayata. là một loài mới, được Nguyễn Trọng Quyền phát hiện và bé sung vào hệ thực vật Việt Nam năm 2022.3 Phân bố Loài Anoectochilus formosanus Hayata. phân bố chủ yêu ở Thai Lan, Myanma, Malaysia, Trung Quốc, Indonesia, Lào. Ở nước ta, chúng phân bố ở các tỉnh Cao Bằng, Lạng Sơn, Lào Cai, Vĩnh Phúc, Hòa Bình, Đắk Lắk, Lâm Đồng và ở chùa Hương (Hà Nội) (Đỗ Huy Bích và ctv, 2018).4 Đặc điểm thực vật học Năm 2018 Đỗ Huy Bich đã mô tả cây lan gam như sau: Rễ: rễ đơn, có nhiều lông hút, mọc ra từ các đốt thân, các rễ ở phần gốc ăn sâu vào đất; các rễ mọc ở những đốt thân có một phần cắm xuống đất, phần còn lại nhô ra khỏi mặt đất.
Thân: cây thân thảo ký sinh, thân mềm mọng nước, hình dạng giống con tằm, phan trên mọc đứng hoi có lông, cao từ 15 — 25 cm, phần dưới mọc bò bén rễ ở các mau, thân cây có màu đỏ tía hay nâu giúp có thể quang hợp ngay cả trong điều kiện ánh sáng yêu. Lá: lá mọc so le, hình bầu dục hoặc hình trứng, dài từ 4 — 7 cm, rộng từ 2,5 — 3 cm, sốc tròn đầu tù hơi nhọn, mặt trên màu xanh lục đôi khi màu tía, mặt đưới màu hồng tím, có 3 — 5 gân chính hình cung, cuống lá đài có bẹ ở gốc. Hoa: cụm hoa mọc ở ngọn thân, phát hoa dài từ 3 — 8 cm có lông dày đặc, lá bắc màu nâu vang, hoa màu trang, lá đài lưng dính liền với cánh hoa thành mii có 3 răng, lá đài bên rời nhau, cánh môi màu vàng hình chữ T, trụ dài bang bao phan, bau có lông. Quả: qua nang, mùa quả vào thang 3 — 4.
Những cành trưởng thành (trên 1 năm tuôi) thường có quả hăng năm và tiép tục tôn tại đên gan 1 năm sau mới tan lu. Lan gam là loài thực vật ưa 4m, ưa bóng, thường mọc rải rác hoặc thành các đám nhỏ lẫn trong lớp thảm mục hoặc hốc đá dưới tán rừng kín thường xanh âm. Độ cao từ 700 — 1500 m so với mực nước biển. Cây sinh trưởng mạnh trong mùa mưa ẩm, chịu được thời tiết sương mù dài ngày.
Chúng thường mọc các chồi mới từ phan thân gia mọc sát mặt đất. Cây có thể tái sinh tự nhiên bằng hạt và được trồng bằng các đoạn thân.5 Thanh phần hóa học của cây lan gam Thành phan hoạt chat sinh học quan trọng nhất của hoa lan gam bao gồm: gasrodn (4-(-D-glucopyranosyloxy) benzyl alcohol), gastrodigenisn (P- hydroxybenzyl alcohol) và kinsenoside (3- (R)-3—B—D glucopyranosyloxy butanolide) (Yeo-Joong Yoon va ctv, 2007), những thành phan kể trên cũng có thé thu được khi chiết xuất toàn bộ thân cây (Tseng và ctv, 2006).6 Giá trị và ứng dụng Trong dược điển Trung Hoa, lan gam là cây thuốc quý và được sử dụng dé điều trị ung thư, tăng huyết áp, đái tháo đường và viêm thận (Liang và ctv, 1990). Tác dụng dược lý đa dạng của lan gam đã được chứng minh bao gồm chống viêm và hoạt tính bảo vệ tế bao (Lin va ctv, 1993), hoạt tính chống oxy hóa (Lin và ctv, 2000), kha năng chống khối u và kích thích miễn dịch (Tseng và ctv, 2006). Lan gam có vi nhạt, hơi chát, tinh mat; có tac dụng tư âm nhuận phê, ky ty, an than, mát phối, mat máu, sinh tân dịch, tiêu viêm, lọc máu.
Lan gấắm còn được dùng dé chữa lao phổi, ho ra máu, suy kinh suy nhược, chán ăn (Nguyễn Thị Thu Hương, 2018). Năm 2020 Hoang Xuân Trung cũng đã chứng minh lan gam có tính kháng khuẩn, dùng chữa các bệnh viêm phế quản, viêm gan mạn tính; các triệu chứng như ho khạc ra máu, thần kinh suy nhược, mất ngủ, kém ăn; tri lao phối, tiêu hóa kém, chán ăn, phổi kết hạch. Ngoài ra còn chữa tăng huyết áp, suy thận, di tinh, đau lưng, phong thấp, tiêu đờm, giải độc, giải nhiệt và cho biết bộ phận sử dụng làm thuốc uống là toàn bộ cây tươi hay cây khô. Liều lượng trung bình cho khuyến cáo 20 g cây tươi hoặc 5 g cây khô/ngày là.
Sử dụng đắp ngoài, toàn bộ cây tươi rửa sạch, giã nát đắp vào nơi vết thương sưng đau. Ngoài ra, lan gam có thé làm rau ăn và chữa được nhiều bệnh (tim mạch, các bệnh sưng viêm, có hoạt chất chống oxy hóa bảo vệ gan, trị đau nhức khớp, lao phối và tăng cường sức khỏe) (Lin va ctv, 1993). Các thành phần có hoạt sinh học quan trọng nhất chiết xuất từ lan gam đã được công bó gồm gastrodin, gastrodigenin và kinsenoside (Tseng va ctv, 2006).2 Nuôi cấy mô và tế bào 1.1 Khái niệm Nuôi cay mô và tế bảo thực vật là phương pháp nuôi cay in vitro đối với mô hoặc tế bào đã tách rời trong môi trường thích hợp dé tế bao trở lại trang thái chưa phân hóa có khả năng phân chia tế bào và biệt hoá thành mô, cơ quan và phát triển thành cây con mới. Tất cả mọi tế bào của một cơ thê thực vật đều có tính toàn năng, nghĩa là chứa bộ gene giống nhau, do đó tat cả các tế bào của một cơ thể đều có khả năng tổng hợp những loại protein — enzyme giống nhau và nếu tế bào được nuôi dưỡng trong môi trường thích hợp đều có thé phát triển thành cây nguyên vẹn đặc trưng cho loài và ra hoa, kết quả bình thường (Nguyễn Quang Thạch, 2009).2 Cơ sở của nuôi cấy mô và tế bào thực vật 1.1 Một số khái niệm về nuôi cấy mô và tế bào thực vật Năm 1902 Haberlandt là người đầu tiên cho rằng bat kỳ tế bào của một cơ thé sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng đề phát triển thành một cá thê hoàn chỉnh, đó là tính toàn năng của tế bào.
Đặc tính này được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật, mô và cơ quan thực vật hay nuôi cấy tế bào trần trên các môi trường nhân tao in vitro. Trong điều kiện thích hợp (môi trường có bé sung chất điều hòa sinh trưởng thích hợp), những tế bao này sẽ được kích thích dé phân hóa, phát sinh hình thái, tái sinh phôi hoặc phát sinh cơ quan và sau cùng là thành cơ quan hoàn chỉnh. Sự phân hóa tế bao (Differentiation) là sự biến đổi của các tế bào phôi sinh thành các tê bào của các mô chuyên hóa đảm nhận các chức năng khác nhau (George, 1993). Sự phản phân hóa tế bào (Dedifferentiation) các tế bào khi đã được phân hóa thành các mô riêng biệt với các chức năng khác nhau, nhưng trong điều kiện nhất định chúng vẫn có thé quay trở về trang thái phôi sinh dé phân chia tế bào.
Trong nuôi cấy mô, quá trình này dẫn đến sự hình thành mô sẹo (George, 1993). Sự tái phân hóa tế bào (Redifferentiation) là các tế bào ở trạng thái phôi sinh (bao gồm các tế bào mô sẹo) sau khi đã trải qua quá trình phản phân hóa, nhưng vẫn có khả năng phân chia và phân hóa hình thành các loại tế bào chuyên biệt (George, 1993). Phát sinh cơ quan (Organogenesis) là thuật ngữ dùng dé mô tả quá trình phát triên các chồi, rễ bat định, hoa từ các khối tế bào mô sẹo. Quá trình này xảy ra sau thời điểm mà mẫu vật được đặt vào môi trường nuôi cấy và sự bắt đầu cảm ứng tạo mô sẹo (George, 1993).2 Ưu và nhược điểm của phương pháp nhân giống in vitro Theo Nguyễn Văn Ay (2019) phương pháp nhân giống in vitro có ưu và nhược điêm như sau: 1.1 Ưu điểm Giúp nhân nhanh các giống cây trồng với quy mô công nghiệp, đạt được hệ số nhân cao mà vẫn giữ được đặt tính giống với cây bố mẹ.
Chọn lọc được các đối tượng thực vật có tính trạng tốt nhằm phục sản xuất dược phẩm. Tạo ra cây con hoản chỉnh từ những tế bào hoặc mô thực vật đã được chuyền đổi gen từ đó tạo ra các loài tốt hơn. Kỹ thuật nuôi cấy in vitro do có sự cung cấp dinh dưỡng day đủ, cho phép cây trưởng thành một cách nhanh chóng và tránh được một số sâu bệnh gây hại. Thông qua nuôi cay, có thé tiễn hành cung cấp cây giống quanh năm nhờ vào không bị ảnh hưởng bởi điều kiện thời tiết.
Tạo điều kiện nuôi cấy phôi của một số loài cây khó phát triển và sinh trưởng trong điều kiện tự nhiên góp phần bảo tồn các giống cây quý hiếm có nguy cơ tiệt chủng hiện nay.2 Nhược điểm Chi phí đầu tư ban đầu và vận hành trang thiết bị tốn kém, giá thành cây con còn khá cao. Cần chuyên viên kỹ thuật có tay nghề và kinh nghiệm chuyên môn nên tốn chi phí đào tạo. Ngoài ra, trong giai đoạn in vitro sự xâm nhiễm do sinh vật vẫn có thé xảy ra và tồn tại trong mô cay gây tôn hại khi tế bao bắt đầu phân chia. Cây nuôi cấy mô chưa hoàn thiện về mặt cấu trúc nên trong giai đoạn thuần đưỡng (in vitro) kha năng sống sót còn giới hạn.3 Các bước trong nhân giống vô tính in vitro 1.1 Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ Trước khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cần thận các cây mẹ (cây cho nguồn mẫu nuôi cấy).
Các cây này cần sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virus và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh. Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi trường thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu sẽ làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng kha năng sống và sinh trưởng của mau cấy in vitro (Mai Xuân Lương, 2005).2 Tạo vật liệu khởi đầu Giai đoạn khử trùng mẫu dé đưa vào nuôi cấy in vitro. Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cau: ty lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt.