BỘ CÔNG THƯƠNG VIỆN CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI CẤP BỘ BẢO TỒN VÀ LƯU GIỮ NGUỒN GEN VI SINH VẬT CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM Chủ nhiệm đề tài: VŨ NGUYÊN THÀNH 7310 23/4/2009 HÀ NỘI - 2009 BỘ CÔNG THƯƠNG VIỆN CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM ----------------- NHIỆM VỤ KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ THƯỜNG XUYÊN BẢO TỒN VÀ LƯU GIỮ NGUỒN GEN VI SINH VẬT CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM Chủ nhiệm: PGS. Vũ Nguyên Thành Cộng tác viên ThS. Nguyễn Thuý Hường TS. Nguyễn La Anh ThS.
Nguyễn thị Hương Giang ThS. Đinh thị Mỹ Hằng ThS. Nguyễn Thanh Thủy ThS. Đặng Thu Hương ThS.
Dương Anh Tuấn ThS. Khuất Thị Thủy ThS. Lê Thùy Mai CN. Phạm thị Hoà KS.
Đào Anh Hải KS. Nguyễn Minh Thu Hà nội, 12/2008 MỤC LỤC KÝ HIỆU VÀ VIẾT TẮT. Cơ sở pháp lý/xuất xứ của đề tài. Tính cấp thiết và mục tiêu nghiên cứu của đề tài.
Đối tượng/phạm vi và nội dung nghiên cứu. Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước. Phương pháp tiến hành nghiên cứu. Bảo quản vi sinh vật trong nitơ lỏng.
Môi trường nuôi cấy và bảo quản giống. Phân tích hoạt tính cellulaza theo định lượng đường khử Somogyi – Nelson. Phân lập các chủng sinh cellulase. Điện di SDS-PAGE và Zymogram.
Đánh giá đa dạng sinh học trong bánh men Việt Nam bằng kỹ thuật DGGE. Phân tích trình tự DNA. Đánh giá khả năng lên men ở nhiệt độ cao của nấm men. Kết quả thực nghiệm và thảo luận.
Điều tra khảo sát thu thập nguồn gen. Tiếp nhận toàn bộ bảo tồn gen từ Viện Rượu Bia Nước giải khát. Thu thập 10 chủng nấm men có khả năng chịu áp suất thẩm thấu cao. Tiếp nhận các chủng nấm mốc.
Phân lập tuyển chọn các chủng nấm mốc có khả năng sinh enzyme cellulase. Thu thập 10 chủng vi khuẩn Bacillus từ mẫu thức ăn gia súc. Bảo tồn và lưu giữ nguồn gen. Bảo quản và kiểm tra mức độ sống sót của các chủng nấm men.
Bảo quản và kiểm tra mức độ sống sót của các chủng nấm mốc. Bảo quản các chủng vi khuẩn. Đánh giá nguồn gen. Khảo sát khả năng chịu muối của 15 chủng nấm men mới thu thập.
Đánh giá 12 chủng nấm men có trong bộ sưu tập giống của Viện CNTP. Đánh giá khả năng lên men ở nhiệt độ cao của một số chủng nấm men. Đánh giá khả năng sinh cellulase của các chủng nấm mốc. Đánh giá một số chủng vi khuẩn Bacillus.
Đánh giá đa dạng vi sinh vật trong bánh men rượu bằng phương pháp DGGE. Xây dựng cơ sở dữ liệu- Data Bank. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO.
68 2 KÝ HIỆU VÀ VIẾT TẮT 2D – Two dimensional (hai chiều) ATCC – American Type Culture Collection (Bảo tàng giống chuẩn Hoa kỳ) CBS – Centraalbureau voor Schimmelcultures (Bảo tàng giống Vi sinh vật Hà Lan) CMC - Carboxymethyl cellulose CNTP – Sưu tập giống vi sinh vật Viện Công nghiệp Thực phẩm DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Sưu tập giống vi sinh vật và mô CHLB Đức) FIRI – Food Industries Research Institute (Viện Công nghiệp Thực phẩm) h – hour (giờ) JCM – Japan Collection of Microorganisms (Bảo tàng giống Vi sinh vật Nhật Bản) JICA - Japan International Cooperation Agency MALDI-TOF – Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time of Flight (kỹ thuật khối phổ peptid dựa trên sự ion hóa bằng tia laser) NMR - Nuclear Magnetic Resonance (cộng hưởng từ hạt nhân) NRRL - Northern Regional Research Laboratory (hiện là National Center For Agricultural Utilization Research) (Bảo tàng giống Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ) OD – Optical Density (mật độ quang) PAGE - Polyacrylamide Gel Electrophoresis (điện di polyacrylamide) DGGE - Denaturing gradient gel electrophoresis rDNA - Ribosomal DNA rRNA - Ribosomal RNA PCR – Polymerase Chain Reaction (phản ứng trùng hợp chuỗi) PDA – Potato Dextrose Agar RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism (đánh giá đa hình DNA theo phương pháp cắt hạn chế) SDS- Sodium Dodecyl Sulfate SEM – Scanning Electron Microscope (kính hiển vi điện tử quét) T – Type strain (chủng chuẩn) U – Unit (đơn vị) 3 1. Cơ sở pháp lý/xuất xứ của đề tài Đề tài được thực hiện theo hợp đồng nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ với mã số: 06.QG/HĐ-KHCN giữa Bộ Công Thương và Viện Công nghiệp Thực phẩm ký ngày 20/02/2008 (bản photo hợp đồng trong phần phụ lục). Tính cấp thiết và mục tiêu nghiên cứu của đề tài Trong công nghệ sinh học, ứng dụng vi sinh vật chiếm tỷ trọng lớn nhất. Các ứng dụng của vi sinh vật bao gồm: sản xuất enzyme, thực phẩm chức năng, thực phẩm lên men, vaccine tái tổ hợp, dược phẩm, mỹ phẩm, thuốc trừ sâu, hóa chất, công nghệ khai khoáng, bảo vệ môi trường.
Ứng dụng rộng rãi của vi sinh vật xuất phát từ tính đa dạng vốn có của vi sinh vật. Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới và có một hệ vi sinh vật vô cùng phong phú. Nền văn hóa và kỹ nghệ lên men lâu đời đã góp phần sàng lọc những vi sinh vật tiềm năng cho công nghệ sinh học. Hiện tại Viện Công nghiệp Thực phẩm đang bảo tồn và lưu giữ một nguồn gen quan trọng cho công nghiệp thực phẩm với trên 1000 chủng vi sinh vật có các ứng dụng khác nhau từ lên men rượu, bia, cồn, bánh mỳ, sản xuất axit lactic, axetic, chuyển hóa chất thơm, lipid, sinh kháng sinh, enzyme cho tới các ứng dụng trong bảo vệ môi trường, thức ăn gia súc, diệt trừ sâu bệnh.
Đây là thành quả lao động của nhiều thế hệ các nhà khoa học công tác tại Viện cũng như đóng góp của các nhà khoa học trong và ngoài nước thông qua hợp tác khoa học công nghệ trong nhiều thập kỷ qua. Mục tiêu của đề tài là duy trì và phát triển nguồn gen vi sinh vật hiện có nhằm tạo cơ sở hạ tầng phục vụ phát triển công nghệ sinh học của đất nước. Đối tượng/phạm vi và nội dung nghiên cứu Đề tài “Bảo tồn và lưu giữ nguồn gen vi sinh vật công nghiệp thực phẩm” là một trong những nỗ lực của Chính phủ Việt nam nhằm tạo nền tảng và phát triển ngành công nghệ Sinh học của Việt nam với những nội dung chính sau đây: - Điều tra khảo sát thu thập nguồn gen vi sinh vật công nghiệp thực phẩm - Bảo tồn và lưu giữ - Đánh giá nguồn gen - Xây dựng cơ sở dữ liệu. Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 2.
Ngoài nước Thành công trong công nghệ sinh học phụ thuộc nhiều vào sự đa dạng nguồn gen. Chính vì lẽ đó các quốc gia cũng như các công ty lớn đang tập trung nhiều công sức, tiền của vào việc thu thập và nắm giữ nguồn gen. Hiện nay trên thế giới có trên 600 sưu tập gen vi sinh vật. Điều đó có nghĩa là nhiều nước có không phải chỉ một sưu tập mà là có nhiều sưu tập (hoặc độc lập với nhau, hoặc liên kết với nhau một cách chặt chẽ).
Không một nước nào muốn phát triển công nghệ sinh học mà không có ít ra một sưu tập gen vi sinh vật. Sưu tập giống chuẩn của Mỹ (ATCC) là sưu tập gen lớn nhất thế giới. ATCC hiện có trên 50.000 chủng vi sinh vật các loại, kể cả virus, thực khuẩn thể, các dòng tế bào động thực vật, các plasmid, đoạn DNA, các gen quí. Các sưu tập trên thế giới hoạt động theo những hướng sau: Sưu tập, tuyển chọn các gen quý đã biết cũng như những gen mới chưa được nghiên cứu Từ sản xuất và môi trường thiên nhiên.
Đối với nguồn gen Vi sinh vật, mối quan tâm hàng đầu là những gen có tiềm năng ứng dụng trong công nghệ sinh học. Một vài ví dụ có thể liệt kê là: gene mã hoá enzym chịu nhiệt (trên 90°C) từ vi sinh vật sống trong suối nước nóng, các enzym hoạt động tốt ở nhiệt độ thấp từ các vi sinh vật Châu Nam cực, các gen sinh kháng sinh mới, các gen điều khiển quá trình sinh tổng hợp chất mầu Astaxanthin từ Xanthophyllomyces dendrorhous làm tăng chất lượng màu của cá hồi, enzym thuỷ phân lignin cho công nghiệp giấy, hệ cytochrom P-450 trong chuyển hoá thuốc và các hợp chất thơm.Những gen này một khi được ứng dụng sẽ tạo đột phá mới trong công nghệ. Một trong những hướng phát triển của vài năm gần đây là việc sưu tập và thiết lập các ngân hàng gen tổng thể từ môi trường. Theo đó, toàn bộ DNA từ môi trường thiên nhiên (đất, nước, chất hữu cơ…) sẽ được phân lập và biến nạp vào các vector lưu trữ.
Từ thư viện này các dòng gen quan tâm có thể được tách dòng và thể hiện. Điều đáng lưu ý là trong những năm gần đây các nước phát triển đặc biệt quan tâm tới nguồn gen với những tiềm năng hầu như chưa được khai phá của những quốc gia đang phát triển tại khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới. Các mạng lưới như Asian Culture Collection Network hay BioNET-INTERNATIONAL là ví dụ của những cố gắng nhằm tận dụng khai phá nguồn gen này. Đây cũng là cơ hội cho các quốc gia như Việt nam tham gia, tiếp cận với công nghệ cao trong lĩnh vực vi sinh.
Nghiên cứu đặc tính sinh học, và đánh giá nguồn gen Việc lưu giữ nguồn gen sẽ trở nên vô nghĩa nếu không được nghiên cứu và đánh giá. Những gen vi sinh vật được chọn lọc sẽ trở thành vật liệu tạo ra những gen mới với ứng dụng mới hoặc hoàn hảo hơn. Công việc đánh giá ban đầu bao gồm việc phân loại định tên Vi sinh vật thông qua các đặc điểm hình thái, sinh lý. Tại sưu tập giống Nhật bản 5 (JCM), Hà lan (CBS), Mỹ (ATCC) việc định tên một chủng giống với ví dụ nấm men cần thực hiện trên dưới 60 test sinh lý, sinh hoá.
Ngoài ra còn cần phải phân tích các đặc điểm thành phần % G+C và A+T, loại CoQ, thành phần thành tế bào. Hiện nay các sưu tập kể trên còn ứng dụng phương pháp đọc trình tự các gen 18S rRNA, 26SrRNA, ITS cho việc phân loại và định tên. Tiếp theo sau là việc đánh giá các đặc tính sinh học của gen quan tâm. Tại sưu tập giống DSMZ của Đức với những gen mã hoá protein hay enzym ngoài việc đánh giá hoạt lực, những protein, enzym này sẽ được tinh sạch bằng 2D SDS-PAGE sau đó phân tích bằng MALDI-TOF để đối chiếu với ngân hàng dữ liệu và định tên protein.
Trong trường hợp quan tâm hơn, các đoạn trình tự axít amin có thể được giải trình tự, dựa trên kết quả đó gen có thể được tách dòng, đọc trình tự. Protein có thể được thể hiện, tinh sạch và nghiên cứu cấu trúc bằng NMR hay X-ray.
