Luận án tiến sĩ sinh học sàng lọc các thảo dược có khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase để giảm sự tạo thành acid uric

Luận án tiến sĩ y tế nghiên cứu sinh học sàng lọc các thảo dược có khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase để giảm sự tạo thành, phân tích chuyên sâu, xây dựng mô hình lý thuyết,

• Tác giả: Từ Văn Quyền
• Người hướng dẫn: PGS. Đái Thị Xuân Trang
• Trường học: Đại học Cần Thơ
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
• Đề tài: Sàng lọc các thảo dược có khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase để giảm sự tạo thành acid uric
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Cần Thơ

Tóm tắt

I. Giới thiệu

Luận án tiến sĩ sinh học tập trung vào việc sàng lọc thảo dược có khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase nhằm giảm acid uric. Nghiên cứu này xuất phát từ thực tế rằng tăng acid uric không chỉ gây bệnh gout mà còn liên quan đến các bệnh tim mạch, sỏi thận và đái tháo đường. Enzyme xanthine oxidase đóng vai trò chính trong quá trình chuyển hóa purine thành acid uric, do đó, việc tìm kiếm các thảo dược có khả năng ức chế enzyme này là cần thiết. Mục tiêu của luận án bao gồm phân lập enzyme, đánh giá khả năng ức chế của các thảo dược, và xác định tác động của chúng lên nồng độ acid uric trong máu.

1.1. Lý do chọn đề tài

Tăng acid uric là nguyên nhân chính gây bệnh gout và các bệnh liên quan. Enzyme xanthine oxidase là yếu tố then chốt trong quá trình này. Việc tìm kiếm các thảo dược có khả năng ức chế enzyme này mà không gây tác dụng phụ là vấn đề cấp thiết. Nghiên cứu này hướng đến việc phát triển các giải pháp tự nhiên để kiểm soát acid uric.

II. Phương pháp nghiên cứu

Luận án sử dụng các phương pháp khoa học để phân lập enzyme xanthine oxidase từ sữa bò và đánh giá khả năng ức chế của các thảo dược. Quy trình bao gồm kết tủa enzyme bằng ammonium sulfate, đo quang phổ để xác định hoạt tính enzyme, và sắc ký cột để phân lập các hợp chất có hoạt tính ức chế. Ngoài ra, nghiên cứu còn đánh giá tác động của các thảo dược lên nồng độ acid uric trong máu chuột thực nghiệm.

2.1. Phân lập enzyme xanthine oxidase

Enzyme được phân lập từ sữa bò bằng phương pháp kết tủa với ammonium sulfate. Hoạt tính enzyme được xác định thông qua đo quang phổ ở bước sóng 290 nm. Kết quả cho thấy enzyme phân lập có hoạt tính cao và ổn định trong điều kiện tối ưu.

2.2. Sàng lọc thảo dược

Tám loại thảo dược được sàng lọc để đánh giá khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase. Cao chiết ethanol từ các thảo dược được sử dụng để xác định nồng độ ức chế 50% (IC50). Kết quả cho thấy một số thảo dược như cỏ xước có hiệu quả ức chế cao.

III. Kết quả và thảo luận

Kết quả nghiên cứu cho thấy cỏ xước có khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase mạnh nhất với IC50 là 17,5 µg/mL. Ba hợp chất được phân lập từ cỏ xước là quercetin, quercitrin và hesperetin cũng thể hiện hoạt tính ức chế đáng kể. Cao chiết từ cỏ xước làm giảm đáng kể nồng độ acid uric trong máu chuột thực nghiệm, đồng thời giảm hoạt tính enzyme trong gan.

3.1. Hiệu quả của cỏ xước

Cao chiết ethanol từ cỏ xước không chỉ ức chế enzyme xanthine oxidase mà còn làm giảm nồng độ acid uric trong máu chuột bệnh. Điều này cho thấy tiềm năng ứng dụng của cỏ xước trong điều trị tăng acid uric.

3.2. Phân lập hợp chất

Ba hợp chất quercetin, quercitrin và hesperetin được phân lập từ cỏ xước có hoạt tính ức chế enzyme mạnh. Quercitrin ức chế enzyme theo kiểu hỗn hợp, mở ra hướng nghiên cứu mới về cơ chế ức chế enzyme.

IV. Kết luận và đề xuất

Luận án đã chứng minh hiệu quả của cỏ xước trong việc ức chế enzyme xanthine oxidase và giảm acid uric trong máu. Các hợp chất phân lập từ cỏ xước cũng có tiềm năng ứng dụng trong y học. Nghiên cứu đề xuất hướng phát triển các sản phẩm từ cỏ xước để phòng và điều trị tăng acid uric.

4.1. Ý nghĩa thực tiễn

Nghiên cứu này cung cấp cơ sở khoa học cho việc sử dụng cỏ xước trong điều trị các bệnh liên quan đến tăng acid uric. Đây là bước tiến quan trọng trong việc phát triển các liệu pháp tự nhiên thay thế cho các loại thuốc hóa học.

4.2. Hướng nghiên cứu tương lai

Cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về cơ chế ức chế enzyme của các hợp chất từ cỏ xước và thử nghiệm lâm sàng để đánh giá hiệu quả và độ an toàn của chúng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1 Lý do chọn đề tài Enzyme xanthine oxidase (XO) là một phức hợp metallo-flavoenzyme xúc tác hai bước cuối trong quá trình phân giải purine, cụ thể là biến đổi hypoxanthine thành xanthine và xanthine thành acid uric (Hille, 2006). Nồng độ acid uric trong máu cao là nguyên nhân dẫn đến một số bệnh. Bệnh gout (Thống phong) là biểu hiện lâm sàng của tình trạng tăng acid uric máu, với sự tạo thành các tinh thể acid uric, đặc biệt là ở các khớp (Smalley et al., 2000; Kasper et al. Bên cạnh đó, tăng acid uric trong máu thường kèm theo tăng nguy cơ mắc các bệnh như tim mạch, sỏi thận, đái tháo đường và các hội chứng chuyển hóa khác (Nakanishi et al.

Ngoài ra, hoạt động của enzyme XO cũng là nguyên nhân dẫn tới sự tạo ra nhiều gốc tự do có hại cho cơ thể (Cotelle, 2001; Van et al. Những bệnh có liên quan đến tăng acid uric trong máu đang khá phổ biến và có chiều hướng gia tăng trên thế giới (Li et al., 2017; Naz et al. Ức chế enzyme XO là mục tiêu căn bản trong việc điều trị tăng acid uric trong máu (Terkeltaub, 2003; Pacher et al. Các thảo dược, các hợp chất từ tự nhiên có hoạt tính ức chế enzyme XO ngày càng được quan tâm vì tính an toàn và hiệu quả trong việc phòng trị tăng acid uric trong máu.

Những năm gần đây, nhiều nghiên cứu trên thế giới đã được thực hiện nhằm mục đích tìm kiếm các thảo dược, các hợp chất thiên nhiên có khả năng ức chế enzyme XO (Agustin et al., 2013; Thiombiano et al., 2014; Xu et al. Ở Việt Nam cũng có một số nghiên cứu tìm kiếm những thảo dược có khả năng ức chế enzyme XO (Nguyen et al., 2004; Hoàng thị Thanh Thảo và ctv, 2013). Tuy nhiên, Việt Nam có nguồn thảo dược dồi dào (Đỗ Tất Lợi, 2014). Nhiều thảo dược có tiềm năng vẫn chưa được khảo sát về khả năng ức chế enzyme XO.

Vì vậy, đề tài “Sàng lọc các thảo dược có khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase để giảm sự tạo thành acid uric” được thực hiện nhằm xác định thêm một số thảo dược có khả năng ức chế enzyme XO.2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu 1.1 Mục tiêu nghiên cứu Đề tài được thực hiện nhằm đạt được các mục tiêu sau: - Phân lập được enzyme XO từ sữa bò và xác định được các điều kiện phù hợp cho hoạt động của enzyme XO phân lập được. - Xác định được một số thảo dược có khả năng ức chế enzyme XO. 1 - Phân lập và xác định được cấu trúc một số hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme XO từ thảo dược. - Đánh giá được tác dụng của thảo dược có hoạt tính ức chế enzyme XO lên nồng độ acid uric trong máu và hoạt tính enzyme XO gan chuột thực nghiệm.2 Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu được thực hiện với 4 nội dung chính như sau: (1) Nội dung 1: Chuẩn bị nguồn enzyme XO từ sữa bò.

(2) Nội dung 2: Khảo sát khả năng ức chế enzyme XO in vitro của 8 loại thảo dược. (3) Nội dung 3: Phân lập một số hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme XO từ thảo dược. (4) Nội dung 4: Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết lên nồng độ acid uric trong máu chuột thực nghiệm.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 1.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu của đề tài là enzyme XO; 8 loại thảo dược bao gồm: Húng chanh (Plectranthus amboinicus (Lour.), kinh giới (Elsholtzia ciliata (Thunb.), cây râu mèo (Orthosiphon stamineus Benth.), cây sương sáo (Mesona chinensis Benth.), dền gai (Amaranthus spinosus L.), nở ngày (Gomphrena globosa L.), nở ngày đất (Gomphrena celosiodes Mart.) và cỏ xước (Achyranthes aspera L.); động vật được sử dụng trong nghiên cứu là chuột nhắt trắng Mus musculus var.2 Phạm vi nghiên cứu Đề tài tập trung nghiên cứu phương pháp phân lập enzyme XO từ nguồn sữa bò ở trường Đại học Cần Thơ, xác định các điều kiện phù hợp cho hoạt động của enzyme XO như pH, nhiệt độ, nồng độ xanthine và nồng độ enzyme XO; khảo sát khả năng ức chế enzyme XO của cao ethanol 8 loại thảo dược; phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme XO từ thảo dược tiềm năng; khảo sát ảnh hưởng của cao chiết thảo dược tiềm năng lên nồng độ acid uric trong máu chuột thực nghiệm.4 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 1.1 Thời gian nghiên cứu Đề tài được thực hiện từ tháng 03 năm 2016 đến tháng 11 năm 2018 2 1.2 Địa điểm nghiên cứu Nghiên cứu được thực hiện tại phòng thí nghiệm Sinh-Hoá, Bộ môn Công nghệ Sinh học Phân tử - Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học; phòng thí nghiệm Sinh học; phòng thí nghiệm Hóa học thuộc Khoa Khoa học Tự nhiên, trường Đại học Cần Thơ.5 Những đóng góp mới của đề tài Đề tài đã có một số đóng góp mới như sau: - Phân lập được enzyme XO từ nguồn sữa bò địa phương có hoạt tính tương đương với hoạt tính của enzyme thương mại. Các điều kiện phù hợp cho hoạt động của enzyme XO đã được xác định.

- Khảo sát được khả năng ức chế enzyme XO của cao chiết 8 loại thảo dược ở đồng bằng sông Cửu Long. Cao chiết ethanol cỏ xước là một đối tượng mới đã được chứng minh có tác dụng ức chế enzyme XO và làm nồng độ acid uric trong máu chuột bị tăng acid uric xuống đạt mức bình thường. Đề tài đã phân lập được 3 hợp chất có khả năng ức chế enzyme XO từ cây cỏ xước. Trong đó, quercitrin có hoạt tính ức chế khá mạnh enzyme XO (IC50 = 37,7 µg/mL).6 Ý nghĩa của luận án Luận án đã mang lại ý nghĩa về mặt khoa học là tạo được cơ sở khoa học về khả năng ức chế enzyme XO của 8 loại thảo dược bao gồm: Húng chanh, kinh giới, cây râu mèo, cây sương sáo, dền gai, nở ngày, nở ngày đất và cỏ xước.

Luận án còn có một ý nghĩa đặc biệt là chứng minh được cao ethanol cỏ xước có hoạt tính ức chế enzyme XO mạnh và có tác dụng làm nồng độ acid uric trong máu chuột bị tăng acid uric giảm xuống đạt mức bình thường. Từ đó, luận án đã mang lại ý nghĩa về mặt thực tiễn là đã gợi ý hướng ứng dụng cây cỏ xước trong phòng trị tăng acid uric trong máu. 3 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Ảnh hưởng của chất ức chế đến hoạt động của enzyme Phương trình động học enzyme là phương trình Michaelis-Menten: V = Vmax [S]/(Km + [S]) V là vận tốc phản ứng, [S] là nồng độ cơ chất. Km là hằng số Michaelis-Menten đặc trưng cho mỗi enzyme.

Km đặc trưng cho ái lực của enzyme với cơ chất, Km có trị số càng nhỏ thì ái lực của enzyme với cơ chất càng lớn, nghĩa là vận tốc của phản ứng do enzyme xúc tác càng lớn. Ý nghĩa thực tiễn của hằng số Michaelis-Menten là ở chỗ nó chính là giá trị của nồng độ cơ chất khi tốc độ phản ứng bằng nửa tốc độ tối đa (Vmax) (Phạm Thị Trân Châu và Phan Tuấn Nghĩa, 2009). Phương trình Michaelis-Menten có dạng đường cong. Năm 1934, trên cơ sở của phương trình Michaelis-Menten, Lineweaver-Burk đã nghịch đảo để biến thành dạng đường thẳng.

1 K 1 1 Phương trình Lineweaver-Burk:  m   có dạng: V0 Vmax [ S ] Vmax y = ax+b, nó có ý nghĩa lớn đối với việc nghiên cứu ức chế enzyme. Chất ức chế là chất có tác dụng làm giảm hoạt độ hay làm enzyme không còn khả năng xúc tác biến cơ chất thành sản phẩm. Nó có thể là chất ức chế thuận nghịch hay bất thuận nghịch. Ức chế thuận nghịch (reversible inhibition) có thể là cạnh tranh (competitive), không cạnh tranh (uncompetitive) hay hỗn hợp (mixed).

Ức chế cạnh tranh (competitive) Chất ức chế cạnh tranh trực tiếp vào tâm hoạt động của enzyme được gọi là chất ức chế cạnh tranh. Những chất ức chế này thường có cấu trúc giống với cơ chất và làm giảm lượng enzyme tự do (Hình 2. Enzyme Cơ chất Chất ức chế Hình 2.1: Kiểu ức chế cạnh tranh E: enzyme; S: cơ chất; I: chất ức chế; P: sản phẩm 4 Phương trình Lineweaver- Burk khi có chất ức chế cạnh tranh: 1 K m 1 1    (1) V0 Vmax [ S ] Vmax [I ]   1 KI Với [I] là nồng độ của chất ức chế cạnh tranh. KI là hằng số thể hiện ái lực của chất ức chế và enzyme.

Dựa vào phương trình (1) ta thấy: nếu nồng độ cơ chất lớn, nồng độ chất ức chế thấp thì có thể loại bỏ tác dụng của chất ức chế. Đồ thị Lineweaver-Burk biểu thị sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ cơ chất khi có chất ức chế cạnh tranh được trình bày trong Hình 2.2: Đồ thị Lineweaver-Burk của chất ức chế cạnh tranh. Kiểu ức chế cạnh tranh làm cho giá trị Km tăng nhưng giá trị Vmax không thay đổi. Đồ thị Lineweaver-Burk cho thấy đường thẳng có nồng độ chất ức chế càng cao thì có độ xiên càng lớn.

Các đường thẳng không có chất ức chế và có chất ức chế cắt trục tung ở một điểm là 1/Vmax. Phần lớn các chất ức chế cạnh tranh và cơ chất có sự tương đồng về mặt hóa học. Trường hợp đặc biệt của ức chế cạnh tranh là ức chế bằng sản phẩm. Trường hợp này xảy ra khi một sản phẩm phản ứng tác dụng trở lại enzyme và choán vị trí hoạt động của phân tử enzyme.

Ức chế không cạnh tranh (uncompetitive) Ức chế không cạnh tranh là kiểu ức chế mà chất ức chế bám trực tiếp vào phức hợp enzyme-cơ chất nhưng không bám vào enzyme tự do (Hình 2.3: Kiểu ức chế không cạnh tranh E: enzyme; S: cơ chất; I: chất ức chế; P: sản phẩm Phương trình Lineweaver-Burk khi có chất ức chế không cạnh tranh: 1 K 1  '  m   (2) V0 Vmax [ S ] Vmax [I ]   1  K I Với [I] là nồng độ chất ức chế. K’I là hằng số thể hiện ái lực của chất ức chế và enzyme. Trong trường hợp này ta thấy khi E kết hợp với S làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử enzyme và tạo trung tâm kết hợp với I, do đó không thể loại bỏ tác dụng ức chế bằng cách tăng nồng độ cơ chất. Đồ thị Lineweaver-Burk biểu thị sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ cơ chất khi có chất ức chế không cạnh tranh được trình bày trong Hình 2.4: Đồ thị Lineweaver-Burk của chất ức chế không cạnh tranh 6 Kiểu ức chế không cạnh tranh làm giảm giá trị Vmax nhưng giá trị Km không thay đổi.