Tổng quan luận án
Tăng acid uric huyết thanh là nguyên nhân trực tiếp dẫn đến bệnh gout và làm gia tăng nguy cơ mắc các bệnh lý liên quan như tim mạch, sỏi thận, đái tháo đường cùng các rối loạn chuyển hóa. Quá trình sinh tổng hợp acid uric trong cơ thể được xúc tác chủ yếu bởi enzyme xanthine oxidase (XO) thông qua hai phản ứng oxy hóa liên tiếp: chuyển đổi hypoxanthine thành xanthine và từ xanthine thành acid uric. Đồng thời, phản ứng do XO xúc tác còn giải phóng các gốc tự do có hại cho tế bào. Do đó, ức chế enzyme XO là mục tiêu căn bản trong phòng ngừa và điều trị tăng acid uric máu. Mặc dù thuốc ức chế tổng hợp hóa dược như allopurinol được sử dụng phổ biến, các nghiên cứu tìm kiếm nguồn thảo dược tự nhiên có khả năng ức chế XO với độ an toàn cao vẫn là một nhu cầu cấp thiết. Tại Việt Nam, nguồn tài nguyên thực vật phong phú nhưng nhiều loài thảo dược bản địa tại khu vực đồng bằng sông Cửu Long vẫn chưa được khảo sát đầy đủ về hoạt tính ức chế enzyme XO. Luận án tiến sĩ ngành Công nghệ Sinh học (mã ngành 62420201) của nghiên cứu sinh Từ Văn Quyền, thực hiện dưới sự hướng dẫn chính của PGS. Đái Thị Xuân Trang tại Trường Đại học Cần Thơ (năm 2021), được triển khai nhằm giải quyết khoảng trống nghiên cứu này.
Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định gồm 4 mục tiêu cụ thể:
- Phân lập được enzyme XO từ sữa bò và xác định được các điều kiện phù hợp cho hoạt động của enzyme XO phân lập được.
- Xác định được một số thảo dược có khả năng ức chế enzyme XO.
- Phân lập và xác định được cấu trúc một số hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme XO từ thảo dược.
- Đánh giá được tác dụng của thảo dược có hoạt tính ức chế enzyme XO lên nồng độ acid uric trong máu và hoạt tính enzyme XO gan chuột thực nghiệm.
Nội dung nghiên cứu tương ứng gồm 4 phần:
- Chuẩn bị nguồn enzyme XO từ sữa bò.
- Khảo sát khả năng ức chế enzyme XO in vitro của 8 loại thảo dược.
- Phân lập một số hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme XO từ thảo dược.
- Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết lên nồng độ acid uric trong máu chuột thực nghiệm.
Đối tượng nghiên cứu của đề tài bao gồm enzyme XO; 8 loại thảo dược: húng chanh (Plectranthus amboinicus (Lour.)), kinh giới (Elsholtzia ciliata (Thunb.)), cây râu mèo (Orthosiphon stamineus Benth.), cây sương sáo (Mesona chinensis Benth.), dền gai (Amaranthus spinosus L.), nở ngày (Gomphrena globosa L.), nở ngày đất (Gomphrena celosiodes Mart.) và cỏ xước (Achyranthes aspera L.); cùng đối tượng động vật thực nghiệm là chuột nhắt trắng Mus musculus var. albino. Phạm vi nghiên cứu tập trung vào quy trình phân lập enzyme XO từ sữa bò tươi thu nhận tại Trường Đại học Cần Thơ, tối ưu hóa các điều kiện phản ứng (pH, nhiệt độ, nồng độ cơ chất và enzyme); sàng lọc hoạt tính in vitro của cao chiết ethanol 70% từ 8 loại thảo dược; tinh sạch và xác định cấu trúc hóa học các chất ức chế XO từ cây cỏ xước; và đánh giá tác động in vivo trên mô hình chuột bị gây tăng acid uric máu cấp tính bằng kali oxonate. Thời gian nghiên cứu diễn ra từ tháng 03 năm 2016 đến tháng 11 năm 2018 tại các phòng thí nghiệm thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học và Khoa Khoa học Tự nhiên, Trường Đại học Cần Thơ.
Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án
Luận án tổng hợp hệ thống các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước về cấu trúc, động học enzyme XO, cơ chế bệnh sinh liên quan đến acid uric và các hoạt chất ức chế XO từ thực vật. Về mặt phân tử, enzyme XO là phức hợp metallo-flavoenzyme có cấu trúc nhị phân đồng thể (homodimer), khối lượng phân tử 283 kDa, mỗi tiểu đơn vị gồm 3 domain chức năng chứa một tâm cofactor molybden (molybdopterin), hai cụm sắt–lưu huỳnh [2Fe-2S] và một coenzyme flavin adenine dinucleotide (FAD) (Bray, 1975; Enroth et al., 2000; Hall, 2014). Tác giả điểm lại các quy trình phân lập enzyme XO từ sữa bò qua các giai đoạn từ Ball (1939), Palmer et al. (1969), Hart et al. (1970) đến cải tiến của Özer et al. (1999) sử dụng muối ammonium sulfate và sắc ký trao đổi ion DEAE-Sepharose.
Về các nghiên cứu sàng lọc thảo dược trên thế giới, tác giả tổng hợp nhiều công trình tiêu biểu:
- Umamaheswari et al. (2007) sàng lọc 6 loài cây tại Ấn Độ, ghi nhận dịch chiết methanol của Coccinia grandis, Datura metel, Strychnos nuxvomica và Vitex negundo ức chế hơn 50% enzyme XO ở 100 µg/mL;
- Apaya và Chichioco-Hernandez (2011) xác định dịch chiết Mimosa pudica có IC50 = 32,8 µg/mL;
- Mohammad et al. (2011) ghi nhận dịch chiết Salvia spinosa có IC50 = 53,7 µg/mL;
- Azmi et al. (2012) và Stalin et al. (2013) nghiên cứu dịch chiết nước lá Carica papaya đạt tỷ lệ ức chế XO đến 86,93% (IC50 = 4,33 µg/mL);
- Muthiah (2012) công bố dịch chiết vỏ quả Citrus limetta có IC50 = 40,16 µg/mL;
- Abdullahi et al. (2012) phân lập phân đoạn chloroform từ Crateva adansonii có IC50 = 20,20 µg/mL;
- Agustin et al. (2013) ghi nhận phân đoạn ethyl acetate của Woodfordia floribunda có IC50 = 38,92 µg/mL;
- Thiombiano et al. (2014) khảo sát phân đoạn n-hexane của Pandiaka angustifolia ức chế 77,61% XO ở nồng độ 100 µg/mL;
- Rini et al. (2014) ghi nhận phân đoạn ethyl acetate của lá Sonchus arvensis có IC50 = 15,29 µg/mL;
- Trabsa et al. (2015) xác định dịch chiết lá Lycium arabicum có IC50 = 0,017 mg/mL và làm giảm acid uric máu chuột từ 4,71 mg/L xuống 1,78 mg/L;
- Haddi và Marouf (2015) đánh giá hoạt tính của cao lá Pistacia lentiscus với IC50 phân đoạn ethyl acetate đạt 2,50 mg/mL.
Về các hợp chất tinh khiết ức chế XO, luận án điểm lại các hoạt chất như acid caffeic từ Cyathea spinulosa (Chiang et al., 1994); acid caffeic, vinyl caffeate, apigenin, acid rosmarinic và methyl rosmarinate từ lá Perilla frutescens (Huo et al., 2015); cấu trúc các dẫn xuất flavonoid như luteolin, quercetin, kaempferol, myricetin, isorhamnetin, hesperetin (Nagao et al., 1999); cinnamaldehyde từ Cinnamomum osmophloeum (Wang et al., 2008); hydroxychavicol từ Piper betle (Kazuya et al., 2009); nudibaccatumin A, B và neotaiwanensol B từ Piper nudibaccatum (Liu et al., 2015); tetrahydroxymentoflavone từ Semecarpus anacardium (Arimboor et al., 2014); 10 flavonoid từ Chrysanthemum sinense (Nguyen et al., 2006); và riparsaponin từ Homonoia riparia (Xu et al., 2014).
Tại Việt Nam, các nghiên cứu đã công bố gồm: Nguyen et al. (2004) sàng lọc 288 dịch chiết từ 96 cây thuốc miền Nam, xác định 4 loài có IC50 < 20 µg/mL (Artemisia vulgaris, Caesalpinia sappan, Blumea balsamifera, Chrysanthemum sinense); Nguyễn Thùy Dương và ctv. (2012, 2013) nghiên cứu cao chiết và phân đoạn n-butanol cây hy thiêm (Siegesbeckia orientalis); Hoàng Thị Thanh Thảo và ctv. (2013) sàng lọc 91 mẫu thực vật miền Bắc, xác định cây mán đĩa (Archidendron clypearia) có IC50 = 15,6 µg/mL; Nguyễn Thu Hằng và ctv. (2013, 2014) khảo sát dịch chiết và flavonoid từ hạt cần tây; Nguyễn Thị Phượng và ctv. (2015) khảo sát hoạt tính của cao cành non cây dâu tằm (Morus alba).
Khoảng trống nghiên cứu mà luận án lựa chọn giải quyết là: thiết lập quy trình phân lập enzyme XO từ nguồn sữa bò tại chỗ nhằm thay thế nguồn chế phẩm thương mại; sàng lọc so sánh 8 loài thảo dược phổ biến tại địa phương; xác định hoạt chất chính chịu trách nhiệm ức chế XO từ đối tượng tiềm năng nhất (cây cỏ xước); và kiểm chứng tác dụng sinh học trên mô hình động vật sống để cung cấp bằng chứng thực nghiệm toàn diện từ mức độ phân tử, in vitro đến in vivo.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu
Luận án dựa trên cơ sở lý thuyết động học enzyme Michaelis-Menten và mô hình tuyến tính hóa Lineweaver-Burk để phân tích hoạt độ xúc tác và cơ chế ức chế:
$$\frac{1}{V_0} = \frac{K_m}{V_{max}}\frac{1}{[S]} + \frac{1}{V_{max}}$$
Các dạng ức chế thuận nghịch được khảo sát dựa trên sự biến thiên của $K_m$ và $V_{max}$:
- Ức chế cạnh tranh: $K_m$ tăng, $V_{max}$ không đổi, các đường thẳng cắt nhau tại trục tung ($1/V_{max}$).
- Ức chế không cạnh tranh: $V_{max}$ giảm, $K_m$ không đổi, các đường thẳng cắt nhau tại trục hoành ($-1/K_m$).
- Ức chế hỗn hợp: $K_m$ tăng, $V_{max}$ giảm, các đường biểu diễn cắt nhau tại một điểm nằm ngoài cả hai trục tọa độ.
- Ức chế kháng cạnh tranh: cả $K_m$ và $V_{max}$ đều giảm cùng tỷ lệ, các đường biểu diễn song song.
Về mặt bệnh học, trạng thái tăng acid uric máu được xác định khi nồng độ acid uric vượt ngưỡng hòa tan trong huyết tương (trên 420 µmol/L tương đương 7,0 mg/dL ở nam giới; trên 360 µmol/L tương đương 6,0 mg/dL ở nữ giới). Mô hình đánh giá in vivo sử dụng kali oxonate làm chất ức chế chọn lọc enzyme uricase, ngăn cản sự chuyển hóa acid uric thành allantoin, từ đó làm tăng acid uric huyết thanh thực nghiệm ở chuột.
Phương pháp thực nghiệm của luận án kết hợp các kỹ thuật sinh hóa, hóa thực vật và dược lý thực nghiệm:
- Chuẩn bị enzyme XO: Phân lập từ nguồn sữa bò tươi bằng kỹ thuật kết tủa phân đoạn protein bằng ammonium sulfate kết hợp xử lý EDTA và dung môi hữu cơ. Định lượng protein hòa tan bằng phương pháp Folin-Lowry sử dụng đường chuẩn Bovine Serum Albumin (BSA). Xác định sự hiện diện và độ tinh sạch của enzyme bằng điện di gel polyacrylamide có sodium dodecyl sulfate (SDS-PAGE).
- Đo hoạt tính và khảo sát ức chế XO in vitro: Đo độ hấp thu quang phổ UV ở bước sóng 290 nm tương ứng với sự hình thành acid uric từ cơ chất xanthine ở 25°C. Hoạt tính ức chế được tính toán thông qua độ giảm mật độ quang khi có mặt mẫu thử so với đối chứng không có mẫu thử. Chất đối chứng dương chuẩn là allopurinol. Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% hoạt tính enzyme) được ngoại suy từ phương trình hồi quy tuyến tính giữa nồng độ mẫu thử và phần trăm ức chế.
- Chiết xuất và phân lập hoạt chất: Nguyên liệu thảo dược khô được trích hồi lưu hoặc ngâm dầm với ethanol 70%, cô thu hồi dung môi thu cao tổng. Cao tổng từ loài thảo dược có hoạt tính mạnh nhất (cỏ xước) được phân bố lỏng - lỏng liên tục qua các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexane, ethyl acetate, n-butanol và nước. Phân đoạn có hoạt tính cao nhất (ethyl acetate) được đưa vào sắc ký cột hở pha thuận (silica gel) để phân tách các phân đoạn phụ và thu nhận các hợp chất sạch.
- Xác định cấu trúc hóa học: Sử dụng các phương pháp phổ nghiệm hiện đại gồm phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$), phổ khối lượng (MS), phổ hồng ngoại (IR) và phổ tử ngoại - khả kiến (UV-Vis), đối chiếu với các dữ liệu phổ chuẩn đã công bố.
- Đánh giá in vivo trên chuột: Chuột nhắt trắng Mus musculus var. albino được chia thành các lô nghiệm thức. Chuột được gây tăng acid uric máu cấp tính bằng đường tiêm màng bụng dung dịch kali oxonate với liều 250 mg/kg. Cao chiết cỏ xước được đưa vào cơ thể chuột qua đường uống ở 3 mức liều (150, 300 và 450 mg/kg thể trọng). Sau thời gian quy định, thu mẫu máu để định lượng acid uric huyết thanh và tách chiết mô gan chuột để xác định hoạt tính enzyme XO trong mô gan.
- Xử lý số liệu: Dữ liệu thực nghiệm được xử lý thống kê, trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn ($M \pm SD$).
Nội dung chính theo từng chương
Chương 1: Giới thiệu
Chương 1 thiết lập khung nghiên cứu tổng thể của luận án. Tác giả trình bày lý do chọn đề tài dựa trên cơ chế sinh hóa của enzyme XO trong quá trình thoái hóa purine tạo acid uric và vai trò của việc ức chế enzyme này trong can thiệp bệnh lý gout cùng các biến chứng tim mạch, chuyển hóa. Tác giả xác định rõ 4 mục tiêu nghiên cứu, 4 nội dung nghiên cứu tương ứng, đối tượng và phạm vi nghiên cứu (8 loại thảo dược, enzyme XO từ sữa bò, mô hình chuột nhắt trắng), thời gian (2016-2018) và địa điểm thực hiện tại Đại học Cần Thơ. Chương này cũng nêu tóm tắt những đóng góp mới và ý nghĩa khoa học, thực tiễn của công trình.
Chương 2: Tổng quan tài liệu
Chương 2 cung cấp cơ sở dữ liệu học thuật gồm 8 tiểu mục:
- Lý thuyết về động học enzyme, phương trình Michaelis-Menten, phương trình Lineweaver-Burk và các kiểu ức chế thuận nghịch (cạnh tranh, không cạnh tranh, hỗn hợp, kháng cạnh tranh).
- Cấu trúc không gian, các trung tâm oxy hóa - khử và cơ chế xúc tác phản ứng của enzyme XO; các thông số động học ($K_m$ của XO gan người là 7 µM, sữa bò là 1,7 mM); các yếu tố ảnh hưởng gồm nhiệt độ, pH, ion kim loại và các chất ức chế.
- Cơ chế bệnh sinh của tăng acid uric máu, mối liên hệ với bệnh gout, bệnh mạch vành, tăng huyết áp, suy thận và hội chứng chuyển hóa.
- Các kỹ thuật đánh giá hoạt tính XO in vitro (phương pháp quang phổ đo acid uric ở 290 nm, phương pháp đo ABTS ở 410 nm, phương pháp HPLC đầu dò huỳnh quang ở bước sóng kích thích 343 nm và phát hiện 410 nm) và mô hình in vivo gây tăng acid uric bằng kali oxonate.
- Điểm luận các nghiên cứu thảo dược và hoạt chất ức chế XO trên thế giới và tại Việt Nam.
- Đặc điểm thực vật học, thành phần hóa học và công dụng theo dược điển/dân gian của 8 loại thảo dược nghiên cứu: húng chanh, kinh giới, râu mèo, sương sáo, dền gai, nở ngày, nở ngày đất và cỏ xước.
- Kỹ thuật chiết ngâm dầm rắn - lỏng và chiết lỏng - lỏng.
- Nguyên lý các phương pháp phổ nghiệm (IR, UV-Vis, MS, NMR).
Chương 3: Phương pháp nghiên cứu
Chương 3 mô tả chi tiết quy trình thực nghiệm:
- Phương tiện, hóa chất, thiết bị sử dụng (máy đo quang phổ UV-Vis, hệ thống điện di SDS-PAGE, máy cô quay chân không, phổ kế NMR).
- Quy trình phân lập XO từ sữa bò bằng muối ammonium sulfate, định lượng protein bằng phương pháp Lowry, xác định hoạt tính riêng và tối ưu hóa các thông số phản ứng (pH, nhiệt độ, nồng độ xanthine và enzyme).
- Quy trình điều chế cao ethanol 70% từ 8 loại thảo dược và phương pháp đo quang phổ ở 290 nm xác định tỷ lệ ức chế và giá trị IC50.
- Quy trình chiết phân đoạn cao cỏ xước bằng n-hexane, ethyl acetate, n-butanol, nước; quy trình chạy sắc ký cột hở phân đoạn ethyl acetate để phân lập các hợp chất sạch và phương pháp xác định kiểu ức chế động học bằng đồ thị Lineweaver-Burk.
- Quy trình bố trí thí nghiệm in vivo trên chuột bình thường và chuột gây tăng acid uric máu cấp tính bằng kali oxonate (250 mg/kg, tiêm màng bụng); phác đồ cho uống cao cỏ xước (150, 300, 450 mg/kg) và allopurinol; quy trình lấy mẫu máu định lượng acid uric và đồng hóa mô gan để đo hoạt tính enzyme XO gan.
Chương 4: Kết quả và thảo luận
Chương 4 trình bày toàn bộ các số liệu và biện giải kết quả thực nghiệm:
- Chuẩn bị nguồn enzyme XO từ sữa bò:
- Enzyme XO thô phân lập từ sữa bò có hàm lượng protein hòa tan đạt 0,509 mg/mg enzyme thô.
- Hoạt tính enzyme thô đạt 0,2095 U/mg enzyme thô; hoạt tính riêng đạt 0,412 U/mg protein.
- Điện di SDS-PAGE xác nhận sự hiện diện của phân tử enzyme XO tương đồng với mẫu enzyme chuẩn thương mại.
- Điều kiện tối ưu cho hoạt động của enzyme XO phân lập được xác định: pH = 7,5; nhiệt độ = 25°C; nồng độ enzyme = 0,02 U/mL; nồng độ cơ chất xanthine = 0,15 mM.
- Hiệu quả ức chế của allopurinol đối với enzyme XO phân lập từ sữa bò và enzyme XO thương mại là tương đương nhau.
- Khả năng ức chế enzyme XO của 8 loại thảo dược:
- Cao ethanol nở ngày, húng chanh và dền gai thể hiện hoạt tính ức chế enzyme XO yếu ở các nồng độ thử nghiệm.
- Năm loại cao chiết còn lại thể hiện hoạt tính ức chế XO phụ thuộc nồng độ, với giá trị IC50 cụ thể được tổng hợp trong bảng:
| STT |
Loại thảo dược / Mẫu thử |
Tên khoa học |
IC50 (µg/mL) |
| 1 |
Cỏ xước |
Achyranthes aspera L. |
17,5 ± 0,10 |
| 2 |
Nở ngày đất |
Gomphrena celosiodes Mart. |
42,5 ± 2,99 |
| 3 |
Kinh giới |
Elsholtzia ciliata (Thunb.) |
138 ± 1,73 |
| 4 |
Cây râu mèo |
Orthosiphon stamineus Benth. |
143 ± 4,04 |
| 5 |
Cây sương sáo |
Mesona chinensis Benth. |
222 ± 2,65 |
| 6 |
Đối chứng Allopurinol (AP) |
- |
9,24 ± 0,275 |
- Phân lập và xác định cấu trúc hợp chất từ cây cỏ xước:
- Từ phân đoạn ethyl acetate của cao ethanol cỏ xước, tác giả phân lập được 5 hợp chất sạch (ký hiệu từ CXQ01 đến CXQ05).
- Thử nghiệm hoạt tính cho thấy 2 hợp chất không thể hiện hoạt tính ức chế XO.
- Ba hợp chất có hoạt tính ức chế XO được định danh bằng dữ liệu phổ $^1\text{H-NMR}$ và $^{13}\text{C-NMR}$:
- CXQ02: Quercetin, IC50 = 14,6 µg/mL.
- CXQ05: Quercitrin, IC50 = 37,7 µg/mL.
- CXQ03: Hesperetin, IC50 = 103,2 µg/mL.
- Phân tích động học qua đồ thị Lineweaver-Burk xác định hợp chất quercitrin (CXQ05) ức chế enzyme XO theo kiểu ức chế hỗn hợp (mixed type).
- Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết cỏ xước trên chuột thực nghiệm:
- Trên chuột bình thường: Cao ethanol cỏ xước ở các mức liều khảo sát không làm thay đổi có ý nghĩa nồng độ acid uric huyết thanh so với lô đối chứng sinh lý (nồng độ acid uric ở chuột bình thường là 127,3 ± 38,4 µmol/L; hoạt tính XO gan là 3,11 ± 0,033 mM acid uric/phút/g protein).
- Trên mô hình chuột bị gây tăng acid uric cấp bằng kali oxonate: Cao ethanol cỏ xước thể hiện tác dụng hạ acid uric máu và ức chế hoạt tính XO gan rõ rệt ở cả 3 mức liều:
| Nghiệm thức |
Liều dùng (mg/kg) |
Nồng độ acid uric máu (µmol/L) |
Hoạt tính XO gan (mM acid uric/phút/g protein) |
| Chuột bình thường (đối chứng âm) |
- |
127,3 ± 38,4 |
3,11 ± 0,033 |
| Chuột bệnh (tiêm kali oxonate) |
250 (tiêm) |
Tăng cao |
Tăng cao |
| Chuột bệnh + Cao cỏ xước liều 1 |
150 (uống) |
186,0 ± 2,1 |
2,62 ± 0,084 |
| Chuột bệnh + Cao cỏ xước liều 2 |
300 (uống) |
129,4 ± 15,2 |
1,79 ± 0,127 |
| Chuột bệnh + Cao cỏ xước liều 3 |
450 (uống) |
128,7 ± 31,9 |
1,87 ± 0,075 |
Kết quả cho thấy ở liều 300 mg/kg và 450 mg/kg, cao ethanol cỏ xước đã đưa nồng độ acid uric trong máu chuột bệnh trở về tương đương mức chuột bình thường. Trong khi đó, allopurinol hạ acid uric trên cả chuột bệnh lẫn chuột bình thường.
Chương 5: Kết luận và đề xuất
Chương 5 tóm lược các kết luận chính của đề tài về việc phân lập thành công enzyme XO từ sữa bò; xác định cỏ xước là thảo dược tiềm năng nhất trong 8 loài khảo sát; phân lập được 3 hợp chất flavonoid ức chế XO (quercetin, quercitrin, hesperetin); chứng minh hiệu quả hạ acid uric máu và giảm hoạt tính XO gan in vivo của cao cỏ xước. Tác giả đề xuất định hướng tiếp tục nghiên cứu sử dụng cây cỏ xước trong các ứng dụng phòng ngừa và điều trị tăng acid uric máu.
Kết quả và những đóng góp mới
Luận án đã đạt được các đóng góp mới về mặt khoa học và thực tiễn được ghi nhận rõ ràng trong văn bản:
- Về mặt phương pháp và khoa học:
- Thiết lập quy trình phân lập enzyme XO từ nguồn sữa bò địa phương đạt hàm lượng protein 0,509 mg/mg enzyme thô và hoạt tính riêng 0,412 U/mg protein, có hoạt tính và tính chất ức chế tương đương với enzyme thương mại. Xác lập các thông số hoạt động tối ưu của enzyme (pH 7,5; 25°C; 0,02 U/mL enzyme; 0,15 mM xanthine), tạo tiền đề chủ động nguồn sinh phẩm cho các thử nghiệm sàng lọc in vitro.
- Cung cấp dữ liệu sàng lọc định lượng có hệ thống về khả năng ức chế XO của 8 loài thảo dược tại đồng bằng sông Cửu Long, chứng minh cây cỏ xước (Achyranthes aspera) có hoạt tính ức chế mạnh nhất (IC50 = 17,5 ± 0,1 µg/mL), kế đến là nở ngày đất (IC50 = 42,5 ± 2,99 µg/mL).
- Phân lập và định danh thành công 3 hợp chất flavonoid ức chế XO từ cây cỏ xước gồm quercetin (IC50 = 14,6 µg/mL), quercitrin (IC50 = 37,7 µg/mL) và hesperetin (IC50 = 103,2 µg/mL); xác định quercitrin ức chế XO theo cơ chế hỗn hợp.
- Về mặt thực tiễn và ứng dụng:
- Chứng minh cao ethanol cỏ xước có tác dụng hạ acid uric máu ở chuột bị tăng acid uric cấp tính về ngưỡng sinh lý bình thường (ở liều 300 và 450 mg/kg) và làm giảm hoạt tính enzyme XO trong mô gan chuột, đồng thời không làm thay đổi nồng độ acid uric ở cá thể bình thường.
- Luận án đề xuất định hướng phát triển và ứng dụng cây cỏ xước làm nguồn dược liệu tự nhiên phục vụ công tác phòng ngừa và hỗ trợ điều trị tăng acid uric máu và bệnh gout.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
Dựa trên phạm vi và nội dung được trình bày trong luận án, các hạn chế và định hướng nghiên cứu tiếp theo bao gồm:
- Hạn chế về phạm vi mẫu và phân lập: Nghiên cứu chỉ tập trung sàng lọc 8 loài thảo dược với dung môi chiết xuất ban đầu là ethanol 70%. Quá trình phân lập hoạt chất sâu chỉ mới thực hiện trên phân đoạn ethyl acetate của một loài tiềm năng nhất là cỏ xước, chưa tiến hành phân lập hoạt chất đối với các loài có hoạt tính khá như nở ngày đất (Gomphrena celosiodes).
- Hạn chế về mô hình dược lý thực nghiệm: Thử nghiệm in vivo mới dừng lại ở mô hình gây tăng acid uric máu cấp tính bằng kali oxonate trên chuột nhắt trắng trong thời gian ngắn, chưa đánh giá trên mô hình mạn tính hoặc khảo sát độc tính bán trường diễn và trường diễn của cao chiết.
- Hướng nghiên cứu tiếp: Cần mở rộng nghiên cứu phân lập hoạt chất ức chế XO từ cây nở ngày đất; khảo sát tác dụng hạ acid uric của cao chiết và các hợp chất tinh khiết (đặc biệt là quercitrin) trên mô hình bệnh lý mạn tính dài ngày; nghiên cứu sâu hơn về dược động học, tính an toàn và xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho các chế phẩm từ cây cỏ xước.
Giá trị tham khảo
Luận án là tài liệu tham khảo có giá trị chuyên môn đối với các nhóm đối tượng:
- Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên ngành Công nghệ Sinh học, Dược học, Hóa sinh học: Tham khảo quy trình phân lập, tinh sạch và tối ưu hóa điều kiện hoạt động của enzyme XO từ nguồn sữa bò tươi địa phương để tự tạo nguồn enzyme phục vụ nghiên cứu thay thế chế phẩm thương mại đắt tiền; tham khảo phương pháp đo quang phổ 96 giếng xác định động học ức chế enzyme.
- Các nhà nghiên cứu Hóa hợp chất thiên nhiên và Dược liệu học: Sử dụng dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$) và quy trình sắc ký cột phân lập các hợp chất flavonoid (quercetin, quercitrin, hesperetin) từ cây cỏ xước.
- Các đơn vị nghiên cứu và phát triển sản phẩm dược: Tham khảo dữ liệu về liều lượng tác dụng (150, 300, 450 mg/kg) và cơ chế tác động kép (vừa hạ acid uric máu, vừa ức chế XO gan) của cao ethanol cỏ xước để xây dựng công thức các sản phẩm bảo vệ sức khỏe hỗ trợ điều trị tăng acid uric máu và gout.
Câu hỏi thường gặp
1. Enzyme xanthine oxidase trong luận án được phân lập từ nguồn nào và có hoạt tính riêng là bao nhiêu?
Enzyme XO được phân lập từ nguồn sữa bò tươi tại địa phương bằng phương pháp kết tủa phân đoạn với ammonium sulfate. Enzyme sau phân lập có hàm lượng protein hòa tan là 0,509 mg/mg enzyme thô, hoạt tính đạt 0,2095 U/mg enzyme thô và hoạt tính riêng đạt 0,412 U/mg protein, với hiệu quả ức chế của allopurinol tương đương enzyme thương mại.
2. Điều kiện tối ưu cho phản ứng xúc tác của enzyme XO phân lập được xác định như thế nào?
Các điều kiện tối ưu được xác định gồm: pH = 7,5; nhiệt độ = 25°C; nồng độ enzyme XO trong phản ứng = 0,02 U/mL; và nồng độ cơ chất xanthine = 0,15 mM.
3. Trong 8 loài thảo dược khảo sát, loài nào thể hiện hoạt tính ức chế enzyme XO mạnh nhất?
Cây cỏ xước (Achyranthes aspera L.) thể hiện hoạt tính ức chế mạnh nhất với giá trị IC50 là 17,5 ± 0,10 µg/mL; tiếp theo là cây nở ngày đất (Gomphrena celosiodes Mart.) với IC50 là 42,5 ± 2,99 µg/mL (chất đối chứng allopurinol có IC50 là 9,24 ± 0,275 µg/mL). Ba loài có hoạt tính yếu là nở ngày, húng chanh và dền gai.
4. Những hợp chất nào đã được phân lập từ cao ethanol cây cỏ xước và kiểu ức chế của quercitrin là gì?
Từ phân đoạn ethyl acetate của cây cỏ xước, tác giả phân lập được 5 hợp chất sạch, trong đó định danh được 3 hợp chất có hoạt tính ức chế XO là quercetin (IC50 = 14,6 µg/mL), quercitrin (IC50 = 37,7 µg/mL) và hesperetin (IC50 = 103,2 µg/mL). Hợp chất quercitrin (CXQ05) được xác định ức chế enzyme XO theo kiểu ức chế hỗn hợp (mixed type).
5. Cao ethanol cỏ xước tác động như thế nào lên acid uric máu và enzyme XO gan chuột in vivo?
Cao ethanol cỏ xước không làm thay đổi acid uric máu ở chuột bình thường (127,3 ± 38,4 µmol/L). Trên chuột bị gây tăng acid uric cấp bằng kali oxonate, cao chiết ở các liều 150, 300 và 450 mg/kg làm giảm nồng độ acid uric máu lần lượt còn 186,0 ± 2,1; 129,4 ± 15,2 và 128,7 ± 31,9 µmol/L (liều 300 và 450 mg/kg đưa về mức bình thường), đồng thời làm giảm hoạt tính enzyme XO trong mô gan chuột từ 3,11 xuống lần lượt 2,62 ± 0,084; 1,79 ± 0,127 và 1,87 ± 0,075 mM acid uric/phút/g protein.
Kết luận
Luận án tiến sĩ của tác giả Từ Văn Quyền đã phân lập thành công enzyme xanthine oxidase từ nguồn sữa bò địa phương có hoạt tính và đặc tính động học tương đương enzyme thương mại. Nghiên cứu sàng lọc 8 loài thảo dược tại đồng bằng sông Cửu Long đã xác định cây cỏ xước (Achyranthes aspera L.) có hoạt tính ức chế XO mạnh nhất và phân lập được 3 hoạt chất flavonoid gồm quercetin, quercitrin và hesperetin. Thử nghiệm in vivo chứng minh cao chiết cỏ xước làm giảm hiệu quả nồng độ acid uric huyết thanh và hoạt tính XO gan trên chuột thực nghiệm bị tăng acid uric về mức bình thường mà không gây ảnh hưởng trên chuột khỏe mạnh. Công trình cung cấp luận cứ khoa học thực nghiệm vững chắc cho việc định hướng ứng dụng cây cỏ xước trong kiểm soát tăng acid uric máu và bệnh gout.
