Luận án: Nghiên cứu tác dụng nano bạc và nano đồng trong vi nhân giống cây trồng - Huỳnh Gia Bảo 2023

Luận án tiến sĩ nghiên cứu nghiên cứu tác dụng của nano bạc và nano đồng trong khử trùng mẫu khử trùng môi trường nuôi cấy và, phát triển phương pháp mới, đánh giá hiệu quả ứng

• Tác giả: Huỳnh Gia Bảo
• Người hướng dẫn: TS. Hoàng Thanh Tùng
• Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu tác dụng của nano bạc và nano đồng trong khử trùng mẫu, khử trùng môi trường nuôi cấy và vi nhân giống một số cây trồng có giá trị kinh tế
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỤC LỤC
• DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Khử trùng môi trường nuôi cấy in vitro
• 1.2. Khử trùng mẫu cấy
• 1.3. Nano bạc và ứng dụng
• 1.3.1. Giới thiệu chung
• 1.3.2. Đặc tính kháng khuẩn của nano bạc
• 1.3.3. Ảnh hưởng của AgNPs lên sự sinh trưởng thực vật
• 1.3.4. Hấp thụ, vận chuyển và chuyển hóa nano bạc trên thực vật
• 1.3.5. Nano bạc trong nghiên cứu vi nhân giống thực vật
• 1.4. Nano đồng và ứng dụng
• 1.4.1. Ảnh hưởng của đồng lên sinh trưởng thực vật
• 1.4.2. Nano đồng trong vi nhân giống thực vật
• 1.5. Hiện tượng bất thường trong vi nhân giống
• 1.5.1. Hiện tượng thủy tinh thể
• 1.5.2. Sự tích lũy khí ethylene
• 1.5.3. Hiện tượng rụng cơ quan
• 1.5.4. Hiện tượng hóa nâu
• 1.6. Tổng quan về các đối tượng nghiên cứu
• 1.6.1. Cây Thu hải đường
• 1.6.2. Cây Tử linh lan
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu thực vật
• 2.2. Dung dịch nano kim loại
• 2.3. Hệ thống nuôi cấy
• 2.4. Thiết bị và dụng cụ
• 2.5. Điều kiện nuôi cấy
• 2.6. Nội dung nghiên cứu
• 2.6.1. Ảnh hưởng của AgNPs lên khử trùng mẫu cấy, môi trường nuôi cấy và vi nhân giống cây hoa Cúc
• 2.6.2. Ảnh hưởng của AgNPs và CuNPs lên khả năng khử trùng mẫu cấy và sinh trưởng tiếp theo của cây Thu hải đường
• 2.6.3. Ảnh hưởng của AgNPs lên khả năng tái sinh chồi và hạn chế một số hiện tượng bất thường trong nuôi cấy in vitro của cây Tử linh lan
• 2.7. Phương pháp nghiên cứu
• 2.7.1. Bố trí thí nghiệm
• 2.7.2. Xác định hàm lượng khí ethylene bằng phương pháp sắc ký khí
• 2.7.3. Xác định hoạt độ của enzyme kháng oxy hóa bằng phương pháp phân tích phổ tử ngoại
• 2.7.4. Xác định hàm lượng đường và tinh bột bằng phương pháp phân tích phổ tử ngoại
• 2.7.5. Giải phẫu hình thái
• 2.7.6. Xử lí số liệu
• 2.7.7. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 2.7.7.1. Địa điểm nghiên cứu
• 2.7.7.2. Thời gian nghiên cứu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Ảnh hưởng của AgNPs lên khử trùng môi trường nuôi cấy, khử trùng mẫu cấy và vi nhân giống cây hoa Cúc
• 3.1.1. Ảnh hưởng của AgNPs lên khử trùng môi trường nuôi cấy
• 3.1.2. Khử trùng mẫu cấy bằng AgNPs và cảm ứng mô sẹo
• 3.1.3. Tái sinh chồi trên môi trường bổ sung AgNPs không hấp khử trùng
• 3.1.4. Ảnh hưởng của nồng độ agar lên sự sinh trưởng của cây con trong môi trường bổ sung AgNPs không hấp khử trùng
• 3.2. Nhân giống cây cúc trong các hệ thống nuôi cấy khác nhau
• 3.2.1. Thích nghi và sinh trưởng tiếp theo ở giai đoạn vườn ươm
• 3.2.2. Đánh giá hiệu quả kinh tế của AgNPs lên khả năng khử trùng mẫu cấy, môi trường nuôi cấy và vi nhân giống cây hoa Cúc
• 3.3. Ảnh hưởng của AgNPs và CuNPs lên khả năng khử trùng mẫu cấy và sinh trưởng tiếp theo của cây Thu hải đường
• 3.3.1. Ảnh hưởng của AgNPs và CuNPs lên khử trùng mẫu cấy
• 3.3.2. Ảnh hưởng của AgNPs và CuNPs lên cảm ứng tạo phôi
• 3.3.3. Ảnh hưởng của AgNPs và CuNPs lên sinh trưởng của phôi soma
• 3.3.4. Tạo cây hoàn chỉnh và sinh trưởng tiếp theo ở điều kiện vườn ươm
• 3.4. Ảnh hưởng của AgNPs lên khả năng tái sinh chồi và hạn chế một số hiện tượng bất thường trong nuôi cấy in vitro của cây Tử linh lan
• 3.4.1. Đánh giá khả năng tái sinh chồi của các nguồn mẫu khác nhau và ghi nhận hiện tượng bất thường
• 3.4.2. AgNPs gia tăng hiệu quả tái sinh chồi và khắc phục một số hiện tượng bất thường
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu tác dụng của nano bạc và nano đồng

Nghiên cứu tác dụng của nano bạc và nano đồng trong khử trùng mẫu và môi trường nuôi cấy là một lĩnh vực đang thu hút sự quan tâm lớn trong nông nghiệp hiện đại. Việc áp dụng công nghệ nano không chỉ giúp cải thiện hiệu quả khử trùng mà còn nâng cao khả năng sinh trưởng của cây trồng. Luận án này sẽ trình bày chi tiết về các ứng dụng của nano bạc và nano đồng trong việc khử trùng môi trường nuôi cấy và vi nhân giống một số cây trồng có giá trị kinh tế.

1.1. Khái niệm về nano bạc và nano đồng trong nông nghiệp

Nano bạc (AgNPs) và nano đồng (CuNPs) là các hạt nano có kích thước nhỏ, được biết đến với khả năng kháng khuẩn và khử trùng hiệu quả. Chúng được sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp để cải thiện chất lượng cây trồng và giảm thiểu sự phát triển của vi sinh vật gây hại.

1.2. Lợi ích của việc sử dụng nano trong khử trùng môi trường nuôi cấy

Việc sử dụng nano bạc và nano đồng trong khử trùng môi trường nuôi cấy giúp giảm thiểu thời gian và công sức so với các phương pháp truyền thống. Hơn nữa, chúng còn giúp duy trì sự sạch sẽ của môi trường nuôi cấy, từ đó nâng cao tỷ lệ sống sót của mẫu cấy.

II. Thách thức trong khử trùng môi trường nuôi cấy hiện nay

Khử trùng môi trường nuôi cấy là một trong những bước quan trọng trong quy trình vi nhân giống. Tuy nhiên, nhiều thách thức vẫn tồn tại, như sự phát triển của vi sinh vật kháng thuốc và hiệu quả không đồng đều của các chất khử trùng truyền thống. Nghiên cứu này sẽ chỉ ra những vấn đề này và cách mà nano bạc và nano đồng có thể giải quyết.

2.1. Các vấn đề thường gặp trong khử trùng mẫu cấy

Nhiễm khuẩn là một trong những vấn đề lớn nhất trong khử trùng mẫu cấy. Việc sử dụng các chất khử trùng truyền thống đôi khi không đạt hiệu quả cao, dẫn đến sự phát triển của nấm và vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy.

2.2. Tác động của vi sinh vật đến sự sinh trưởng của cây trồng

Sự hiện diện của vi sinh vật có thể làm giảm khả năng sinh trưởng và phát triển của cây trồng. Điều này không chỉ ảnh hưởng đến năng suất mà còn làm giảm chất lượng sản phẩm nông nghiệp.

III. Phương pháp nghiên cứu tác dụng của nano bạc và nano đồng

Luận án này áp dụng các phương pháp nghiên cứu hiện đại để đánh giá tác dụng của nano bạc và nano đồng trong khử trùng mẫu và môi trường nuôi cấy. Các thí nghiệm sẽ được thực hiện để xác định hiệu quả của các hạt nano này trong việc khử trùng và cải thiện sinh trưởng của cây trồng.

3.1. Thiết kế thí nghiệm và quy trình thực hiện

Thí nghiệm sẽ được thiết kế với nhiều nhóm mẫu khác nhau, bao gồm nhóm sử dụng nano bạc, nano đồng và nhóm đối chứng. Quy trình thực hiện sẽ bao gồm các bước chuẩn bị mẫu, khử trùng và theo dõi sự sinh trưởng của cây.

3.2. Phân tích kết quả và đánh giá hiệu quả

Kết quả từ các thí nghiệm sẽ được phân tích để đánh giá hiệu quả của nano bạc và nano đồng trong khử trùng và sinh trưởng. Các chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa sẽ được đo lường để đưa ra kết luận chính xác.

IV. Ứng dụng thực tiễn của nano bạc và nano đồng trong nông nghiệp

Kết quả nghiên cứu cho thấy nano bạc và nano đồng có thể được ứng dụng rộng rãi trong nông nghiệp, đặc biệt là trong khử trùng môi trường nuôi cấy và vi nhân giống. Những ứng dụng này không chỉ giúp cải thiện năng suất mà còn nâng cao chất lượng sản phẩm nông nghiệp.

4.1. Ứng dụng trong vi nhân giống cây trồng

Việc sử dụng nano bạc và nano đồng trong vi nhân giống giúp tăng tỷ lệ sống sót của mẫu cấy và giảm thiểu sự phát triển của vi sinh vật gây hại. Điều này tạo điều kiện thuận lợi cho việc sản xuất cây giống sạch bệnh.

4.2. Tác động đến chất lượng sản phẩm nông nghiệp

Sử dụng nano bạc và nano đồng không chỉ giúp khử trùng mà còn cải thiện chất lượng sản phẩm nông nghiệp. Các sản phẩm từ cây trồng được nuôi cấy bằng công nghệ này thường có chất lượng cao hơn và ít bị nhiễm bệnh.

V. Kết luận và triển vọng nghiên cứu trong tương lai

Nghiên cứu về tác dụng của nano bạc và nano đồng trong khử trùng mẫu và môi trường nuôi cấy đã mở ra nhiều triển vọng mới cho ngành nông nghiệp. Kết quả nghiên cứu không chỉ có giá trị lý thuyết mà còn có thể áp dụng thực tiễn trong sản xuất nông nghiệp.

5.1. Tóm tắt kết quả nghiên cứu

Kết quả cho thấy nano bạc và nano đồng có hiệu quả cao trong việc khử trùng mẫu và môi trường nuôi cấy, đồng thời cải thiện sự sinh trưởng của cây trồng. Những phát hiện này có thể giúp nâng cao hiệu quả sản xuất nông nghiệp.

5.2. Định hướng nghiên cứu trong tương lai

Nghiên cứu trong tương lai có thể tập trung vào việc tối ưu hóa nồng độ và phương pháp sử dụng nano bạc và nano đồng để đạt được hiệu quả tốt nhất trong khử trùng và sinh trưởng cây trồng.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ chuyên ngành Công nghệ sinh học (mã số: 9 42 02 01) của nghiên cứu sinh Huỳnh Gia Bảo, được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Hoàng Thanh Tùng và GS. Dương Tấn Nhựt tại Học viện Khoa học và Công nghệ – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (chủ trì tại Phòng Sinh học Phân tử và Chọn tạo giống cây trồng, Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên).

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu của đề tài xuất phát từ các rào cản kỹ thuật trong nhân giống vô tính thực vật (in vitro). Mặc dù vi nhân giống là công cụ sản xuất cây giống sạch bệnh và sinh khối hoạt chất thứ cấp, quy trình truyền thống tiêu tốn nhiều năng lượng, nhân công và chi phí cho khâu hấp tiệt trùng môi trường bằng nồi hấp (autoclave ở 121°C, áp suất 15 psi trong 20–40 phút). Việc gia nhiệt cao còn gây biến tính các hợp chất mẫn cảm nhiệt (đường, vitamin, chất điều hòa sinh trưởng như gibberellin), làm thay đổi độ pH, biến tính agar và sinh ra các phụ phẩm độc hại như 5-(hydroxymethyl)-2-furaldehyde và hợp chất phenolic. Bên cạnh đó, các chất khử trùng mẫu cấy ngoại sinh truyền thống như thủy ngân clorua ($\text{HgCl}_2$) hay canxi hypoclorit ($\text{Ca(ClO)}_2$) có tính oxy hóa và ăn mòn mạnh, dễ gây tổn thương mô, hoại tử mẫu và độc hại đối với người thao tác. Quá trình nuôi cấy trong bình kín có độ ẩm cao (>95%) cũng làm phát sinh các hiện tượng bất thường như thủy tinh thể, rụng lá, hóa nâu mô và tích lũy khí ethylene. Việc ứng dụng hạt nano bạc (AgNPs) và nano đồng (CuNPs) để khử trùng môi trường không qua hấp nhiệt, thay thế chất khử trùng mẫu truyền thống và hạn chế các rối loạn sinh lý là khoảng trống nghiên cứu cần được giải quyết.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án gồm:

• Mục tiêu tổng quát: Đưa ra giải pháp sử dụng nano kim loại nhằm khắc phục các hạn chế trong vi nhân giống về khử trùng môi trường, khử trùng mẫu cấy, cải thiện sinh trưởng và hạn chế hiện tượng bất thường ở cây hoa Cúc, Thu hải đường và Tử linh lan in vitro.
• Các mục tiêu cụ thể:
  1. Xác định hiệu quả của AgNPs trong khử trùng môi trường nuôi cấy in vitro thay thế công đoạn hấp tiệt trùng và đánh giá sinh trưởng của cây hoa Cúc.
  2. Xác định hiệu quả của AgNPs và CuNPs thay thế chất khử trùng truyền thống ($\text{HgCl}_2$, $\text{Ca(ClO)}_2$) lên khả năng vô trùng mẫu và sinh trưởng tiếp theo của cây Thu hải đường.
  3. Xác định hiệu quả của AgNPs lên sự sinh trưởng, khả năng tái sinh chồi và hạn chế các hiện tượng bất thường ở cây Tử linh lan in vitro.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng thực vật: Cây hoa Cúc (Chrysanthemum morifolium 4 tuần tuổi), cây Thu hải đường (Begonia tuberous 8 tuần tuổi) và cây Tử linh lan (Saintpaulia ionantha 8 tuần tuổi).
• Vật liệu nano: Dung dịch nano bạc (AgNPs, kích thước hạt khoảng 20 nm) và nano đồng (CuNPs, kích thước hạt 20–60 nm) nồng độ gốc 1.000 mg/L tổng hợp bằng phương pháp hóa học từ Viện Công nghệ Môi trường (VAST).
• Phạm vi không gian và thời gian: Nghiên cứu thực hiện từ tháng 10/2019 đến tháng 10/2022 tại Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên (Đà Lạt, Lâm Đồng), phối hợp phân tích chuyên sâu tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM, Trường Đại học Y Dược TP.HCM, Viện Cây ăn quả miền Nam, Viện Nghiên cứu Hạt nhân Đà Lạt và Trường Đại học Tây Nguyên.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã hệ thống hóa các hướng nghiên cứu trong nước và quốc tế liên quan đến kỹ thuật vô trùng và ứng dụng vật liệu nano:

• Về khử trùng môi trường và hạn chế của nhiệt độ cao: Leifert và cộng sự (1994) ghi nhận vi khuẩn Bacillus có thể sống sót sau khi hấp ở 120°C; George và cộng sự (2008) chỉ ra sự phân hủy của các vitamin và chất điều hòa sinh trưởng khi hấp khử trùng; hiện tượng hình thành độc chất phenolics và 5-(hydroxymethyl)-2-furaldehyde làm suy giảm chất lượng môi trường nuôi cấy.
• Về khử trùng mẫu cấy ngoại sinh: Các nghiên cứu của Yildiz (2013), Mihaljević và cộng sự (2013) chỉ rõ nhược điểm của các chất khử trùng gốc clo, ethanol, $\text{H}_2\text{O}_2$ và $\text{HgCl}_2$ trong việc gây cháy mô, tổn thương tế bào và rủi ro sức khỏe.
• Về đặc tính và ứng dụng của nano bạc: Shrivastava và cộng sự (2007), Kim và cộng sự (2007) phân tích cơ chế kháng khuẩn của AgNPs thông qua tương tác với protein màng chứa lưu huỳnh và DNA chứa phosphor; Abdi (2012) dùng 100 µg/mL AgNPs khử trùng mẫu đốt thân Valeriana officinalis; Sarmast và cộng sự (2012) ghi nhận AgNPs tăng cường sinh trưởng ở Araucaria heterophylla; các nghiên cứu tại Việt Nam của Dương Tấn Nhựt và cộng sự từ 2017–2021 ứng dụng AgNPs khử trùng mẫu lá Dâu tây, Sâm Ngọc Linh, Đồng tiền, Hồng môn, Tử linh lan, Chanh dây và rong Bắp sú.
• Về nano đồng và hiện tượng bất thường: Rajput và cộng sự (2018), Lee và cộng sự (2008) khảo sát tác động của CuNPs đến sinh lý thực vật; Ziv (1991), Hazarika (2006) mô tả cơ chế của hiện tượng thủy tinh thể, tích lũy ethylene từ tiền chất S-adenosyl-L-methionine (SAM) qua enzyme ACS và ACO, cũng như đáp ứng của hệ enzyme kháng oxy hóa (SOD, CAT, APX) trước stress gốc oxy tự do (ROS).

Khoảng trống học thuật mà luận án tập trung giải quyết là việc chứng minh khả năng thay thế hoàn toàn quy trình hấp nhiệt môi trường bằng AgNPs kết hợp điều chỉnh hàm lượng agar; ứng dụng CuNPs như một chất khử trùng mẫu cấy mới chưa từng được công bố và đánh giá dư lượng đồng ảnh hưởng đến phát sinh phôi soma; làm rõ vai trò sinh lý của AgNPs trong ức chế ethylene và điều hòa enzyme chống oxy hóa để giảm thiểu dị tật hình thái.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án vận dụng cơ sở lý thuyết về phát sinh hình thái thực vật in vitro, cơ chế kháng khuẩn – kháng nấm của nano kim loại, quá trình truyền điện tử quang hợp có sự tham gia của ion đồng trong plastocyanin, và cơ chế điều hòa cân bằng oxy hóa tế bào.

Phương pháp bố trí thí nghiệm và thu thập dữ liệu định lượng:

• Thiết kế thí nghiệm: Bố trí theo khối hoàn toàn ngẫu nhiên, các thí nghiệm lặp lại 3 lần.
• Hệ thống nuôi cấy: Bình thủy tinh đối chứng (AuM1 thể tích 250 mL chứa 30 mL môi trường; AuM2 thể tích 500 mL chứa 60 mL môi trường) được hấp tiệt trùng ở 121°C, 15 psi trong 20–30 phút. Hệ thống hộp nhựa (NoM1 thể tích 5 L chứa 250 mL môi trường; NoM2 thể tích 15 L chứa 500 mL môi trường) bổ sung AgNPs và không hấp tiệt trùng.
• Quy trình phân tích hóa lý, sinh lý và sinh hóa chuyên biệt:

Tên chỉ tiêu phân tích	Phương pháp và thiết bị sử dụng	Cơ chế và bước sóng đo
Định danh vi sinh vật nhiễm	ISO 16266, Bergey, NHS-F15 (vi khuẩn); ISO 21527-1 (nấm)	Phân lập trên môi trường PDA và WA, soi kính hiển vi 1000X
Dư lượng đồng (Cu)	Quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS-6800, Shimadzu)	Vô cơ hóa ướt mẫu cấy 50 mg
Hàm lượng khí ethylene	Sắc ký khí (GC) với cột Porapack P (80–100 Mesh)	Cột $60^\circ\text{C}$, đầu phun/ngọn lửa $90^\circ\text{C}$, khí mang $\text{N}_2$ 55 mL/phút
Hoạt độ Superoxide dismutase (SOD)	Phân tích phổ tử ngoại (UV-Vis)	Đo ức chế tự oxy hóa pyrogallol ở bước sóng 320 nm
Hoạt độ Catalase (CAT)	Phân tích phổ tử ngoại (UV-Vis)	Đo phức hợp ammonium molybdate với $\text{H}_2\text{O}_2$ ở bước sóng 405 nm
Hoạt độ Ascorbate peroxidase (APX)	Phân tích phổ tử ngoại theo Nakano & Asada (1981)	Đo độ suy giảm hấp thụ của ascorbate ở bước sóng 290 nm
Hàm lượng đường khử và tổng số	Thuốc thử DNS và GOPOD	Đo độ hấp thụ ở 540 nm (DNS) và 510 nm (GOPOD)
Tổng hàm lượng tinh bột	Thủy phân enzym ($\alpha$-amylase, amyloglucosidase)	Đo phản ứng GOPOD ở bước sóng 510 nm
Giải phẫu hình thái mô	Cắt lát vi phẫu (30–40 µm), nhuộm kép	Tẩy Javel 10%, acid acetic 45%, nhuộm xanh methylene và đỏ carmin

Số liệu được phân tích thống kê phương sai (ANOVA) và kiểm định Duncan hoặc t-test bằng phần mềm SPSS phiên bản 18.0 và Microsoft Excel 2016 ở mức ý nghĩa thống kê $p < 0{,}05$.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này trình bày cơ sở lý luận tổng quan gồm 6 nội dung chính:

1. Phân tích nguyên lý và điều kiện hấp tiệt trùng môi trường in vitro, những biến đổi hóa lý bất lợi của môi trường và các trường hợp vi khuẩn chịu nhiệt còn tồn tại sau hấp.
2. Tổng kết phương pháp và cơ chế tác động của các tác nhân khử trùng mẫu cấy truyền thống ($\text{Ca(ClO)}_2$, $\text{NaClO}$, $\text{H}_2\text{O}_2$, $\text{HgCl}_2$, cồn, kháng sinh).
3. Tổng quan về nano bạc: phương pháp tổng hợp hóa học, cấu trúc nano core-shell, cơ chế bám dính màng, phóng thích ion $\text{Ag}^+$, tác động kháng khuẩn/kháng nấm, hấp thụ và chuyển hóa trong mô mạch thực vật, cùng các ứng dụng của AgNPs trong nuôi cấy mô tại Việt Nam và trên thế giới.
4. Tổng quan về nano đồng: vai trò sinh lý của Cu trong lục lạp, plastocyanin và enzyme Cu-Zn.SOD; tổng kết các nghiên cứu về ảnh hưởng tích cực và tiêu cực của CuNPs đến sinh trưởng thực vật.
5. Bản chất sinh lý của các hiện tượng bất thường trong vi nhân giống: hiện tượng thủy tinh thể, sự tích lũy ethylene từ chu trình SAM-ACC, rụng cơ quan, hóa nâu mô cấy và sự hình thành stress oxy hóa (ROS).
6. Đặc điểm sinh học, giá trị thương mại và lịch sử nhân giống in vitro của 3 đối tượng cây trồng: Cúc (Chrysanthemum morifolium), Thu hải đường (Begonia tuberous), và Tử linh lan (Saintpaulia ionantha).

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết vật liệu ban đầu, xuất xứ hóa chất, quy cách thiết bị và cách thức bố trí 3 nhánh nghiên cứu thực nghiệm:

• Nhánh 1 (Cây hoa Cúc): Khảo sát nồng độ AgNPs (1, 2, 3, 4, 5 mg/L) khử trùng môi trường MS0 không qua hấp nhiệt; khử trùng mẫu lá bằng AgNPs (125, 250, 500 mg/L) so sánh với $\text{HgCl}_2$ 1.000 mg/L; định danh nấm/khuẩn; tái sinh chồi trên môi trường bổ sung 0,2 mg/L BA; khảo sát nồng độ agar (3, 4, 5, 6, 7, 8 g/L); nhân giống trong các hệ thống nuôi cấy AuM1, AuM2, NoM1, NoM2; theo dõi thích nghi tại vườn ươm 16 tuần; hạch toán kinh tế sản xuất 10.000 cây con.
• Nhánh 2 (Cây Thu hải đường): Khử trùng mẫu cuống lá (tTCL-P), cuống hoa (tTCL-F) và đoạn thân (tTCL-S) bằng AgNPs và CuNPs (50, 100, 200, 300, 400 mg/L) so sánh với $\text{HgCl}_2$ 1.000 mg/L (6 phút) và $\text{Ca(ClO)}_2$ 60.000 mg/L (10 phút); đo dư lượng Cu bằng AAS; cảm ứng tạo phôi trên môi trường MS0 bổ sung 0,1 mg/L TDZ và 0,2 mg/L NAA; phát sinh phôi soma trên môi trường 1/2 MS bổ sung 0,2 mg/L TDZ và 0,2 mg/L NAA; định lượng CAT, APX, đường, tinh bột; ra rễ trên MS0 và theo dõi ex vitro 16 tuần.
• Nhánh 3 (Cây Tử linh lan): Đánh giá khả năng tái sinh chồi từ mẫu lá nguyên và mẫu gân lá chính trên môi trường MS0 chứa 0,1 mg/L NAA, 0,2 mg/L BA và 1 g/L than hoạt tính; ghi nhận tỷ lệ thủy tinh thể, hóa nâu, mô sẹo mép lá và hoại tử; khảo sát bổ sung AgNPs (1, 2, 3, 4 mg/L); đo hàm lượng ethylene bằng GC; đo hoạt độ SOD, CAT, APX; đánh giá giải phẫu vi phẫu.

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm đạt được:

• Trên cây hoa Cúc: Nồng độ 4 mg/L AgNPs bổ sung vào môi trường MS0 không hấp tiệt trùng đạt hiệu quả vô trùng môi trường tương đương nghiệm thức hấp tiệt trùng truyền thống sau 4 tuần theo dõi. Môi trường không hấp tiệt trùng có độ cứng cao hơn môi trường hấp tiệt trùng, cho phép giảm hàm lượng agar từ 8 g/L xuống còn 4 g/L mà vẫn đảm bảo độ nâng đỡ và giúp rễ, chồi sinh trưởng tối ưu. Hệ thống hộp nhựa NoM2 (15 L) cho phép nuôi cấy 330 mẫu/hộp, cây con phát triển đồng đều, tích lũy hoạt độ enzyme chống oxy hóa cao, khi chuyển ra vườn ươm đạt tỷ lệ sống sót cao và ra hoa bình thường. Phân tích kinh tế cho thấy hệ thống NoM kết hợp AgNPs giúp giảm đáng kể chi phí điện năng, nhân công và khấu hao thiết bị trên 10.000 cây giống.
• Trên cây Thu hải đường: CuNPs và AgNPs thể hiện hiệu quả khử trùng mẫu ngoại sinh tương đương hoặc vượt trội so với $\text{HgCl}_2$ và $\text{Ca(ClO)}_2$. Mẫu cấy khử trùng bằng CuNPs không ghi nhận sự tích lũy dư lượng Cu độc hại, đồng thời kích thích tỷ lệ cảm ứng phôi soma cao hơn, tăng số lượng phôi các giai đoạn (hình cầu, hình tim, hình thủy lôi, hai lá mầm), tăng tích lũy tinh bột, đường và hoạt tính enzyme CAT, APX. Cây con tái sinh hoàn chỉnh sinh trưởng khỏe mạnh ở vườn ươm sau 16 tuần.
• Trên cây Tử linh lan: Mẫu gân lá chính cho hiệu quả tái sinh chồi cao nhưng dễ xuất hiện các bất thường sinh lý. Bổ sung 2 mg/L AgNPs vào môi trường nuôi cấy giúp hạn chế hiện tượng thủy tinh thể, giảm tỷ lệ mô sẹo mép lá và hóa nâu; làm giảm rõ rệt hàm lượng khí ethylene tích lũy trong bình nuôi cấy, đồng thời gia tăng hoạt tính của các enzyme SOD, CAT và APX.

Bảng tổng hợp một số thông số kỹ thuật tối ưu được xác định trong luận án:

Đối tượng cây trồng	Công đoạn kỹ thuật	Nghiệm thức tối ưu xác định	Chỉ tiêu sinh học / Kỹ thuật ghi nhận
Cây hoa Cúc (C. morifolium)	Khử trùng môi trường không hấp	Bổ sung 4 mg/L AgNPs, giảm agar còn 4 g/L	Môi trường vô trùng sau 4 tuần, cây sinh trưởng tốt
Cây hoa Cúc (C. morifolium)	Nhân giống quy mô lớn	Hệ thống hộp nhựa NoM2 (15 L, 500 mL MT)	Mật độ 330 chồi/hộp, tối ưu chi phí sản xuất
Cây Thu hải đường (B. tuberous)	Khử trùng mẫu cấy ngoại sinh	CuNPs và AgNPs nồng độ phù hợp (10 phút)	Thay thế $\text{HgCl}_2$, tăng cảm ứng tạo phôi soma
Cây Thu hải đường (B. tuberous)	Nuôi cấy phôi soma	1/2 MS + 0,2 mg/L TDZ + 0,2 mg/L NAA	Tăng số phôi 2 lá mầm, tăng hoạt độ CAT, APX
Cây Tử linh lan (S. ionantha)	Tái sinh chồi, hạn chế bất thường	MS0 + 0,1 NAA + 0,2 BA + 1 g/L than + 2 mg/L AgNPs	Giảm ethylene, giảm thủy tinh thể và hóa nâu

Chương 4: Kết luận và kiến nghị

Chương 4 đúc kết các kết luận khoa học:

1. Đã thiết lập được phương pháp khử trùng môi trường nuôi cấy mô cây hoa Cúc không cần hấp tiệt trùng bằng việc bổ sung 4 mg/L AgNPs và giảm 50% lượng agar (còn 4 g/L), đồng thời ứng dụng thành công hệ thống hộp nhựa NoM quy mô lớn.
2. Đã chứng minh nano đồng (CuNPs) và nano bạc (AgNPs) là tác nhân khử trùng mẫu cấy ngoại sinh hiệu quả trên cây Thu hải đường, thay thế hóa chất độc hại $\text{HgCl}_2$ và kích thích cảm ứng phát sinh phôi soma.
3. Đã chứng minh AgNPs (2 mg/L) giúp gia tăng khả năng tái sinh chồi, giảm tích lũy ethylene, tăng cường enzyme chống oxy hóa và khắc phục các bất thường sinh lý ở cây Tử linh lan.

Các kiến nghị bao gồm việc tiếp tục thử nghiệm mở rộng nồng độ và các loại nano kim loại khác trên nhiều đối tượng cây trồng có giá trị kinh tế, đánh giá biểu hiện gen liên quan đến đáp ứng stress và chuyển giao quy trình khử trùng không hấp nhiệt vào sản xuất thực tế.

Kết quả và những đóng góp mới

Những đóng góp mới về mặt lý luận và thực tiễn của luận án gồm:

• Về mặt lý luận: Luận án cung cấp các dẫn liệu khoa học mới về vai trò của CuNPs trong giai đoạn khử trùng mẫu cấy và kích thích cảm ứng tạo phôi soma; làm sáng tỏ cơ chế tác động của AgNPs trong việc làm chậm quá trình tích lũy khí ethylene và điều hòa hoạt tính hệ enzyme chống oxy hóa (SOD, CAT, APX), từ đó giải thích cơ chế hạn chế hiện tượng thủy tinh thể và hoại tử mô in vitro.
• Về mặt thực tiễn:
  1. Xác định AgNPs bổ sung vào môi trường nuôi cấy được giảm một nửa hàm lượng agar (từ 8 g/L xuống 4 g/L) có hiệu quả khử trùng môi trường nuôi cấy mà không cần hấp tiệt trùng bằng nồi hấp, giúp tiết kiệm năng lượng và nhân công.
  2. Xác định AgNPs và CuNPs có thể sử dụng làm tác nhân khử trùng mẫu cấy thay thế cho các chất khử trùng truyền thống độc hại ($\text{HgCl}_2$, $\text{Ca(ClO)}_2$), không để lại dư lượng kim loại gây độc và cải thiện sinh trưởng, phát sinh phôi ở giai đoạn tiếp theo.
  3. Ứng dụng thành công AgNPs trong việc gia tăng hiệu quả tái sinh chồi, giảm tỷ lệ dị tật hình thái và nâng cao chất lượng cây giống ở giai đoạn vườn ươm.

Các giải pháp và kiến nghị đề xuất: Áp dụng hệ thống hộp nhựa thể tích lớn (NoM1 5 L, NoM2 15 L) kết hợp môi trường bổ sung AgNPs không hấp nhiệt trong quy trình vi nhân giống cây Cúc thương mại nhằm hạ giá thành cây giống; ứng dụng CuNPs và AgNPs trong khâu vào mẫu ban đầu đối với các loài cây hoa cảnh mẫn cảm.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Dựa trên các nội dung và phạm vi được tác giả trình bày trong văn bản luận án, các hạn chế và định hướng nghiên cứu tiếp theo bao gồm:

• Hạn chế: Nghiên cứu tập trung vào 3 đối tượng cây trồng cụ thể (Chrysanthemum morifolium, Begonia tuberous, Saintpaulia ionantha) với các quy trình phát sinh hình thái chuyên biệt; các phân tích chủ yếu dừng lại ở mức độ hình thái giải phẫu, chỉ tiêu sinh trưởng và hoạt độ enzyme sinh hóa, chưa đi sâu vào cơ chế biểu hiện ở mức độ phân tử/gen đối với các thụ thể tiếp nhận ethylene. Dư lượng nano kim loại mới được kiểm tra trên mẫu cấy Thu hải đường bằng AAS, cần tiếp tục mở rộng đánh giá an toàn sinh học trên các bộ phận thu hoạch thương phẩm.
• Hướng nghiên cứu tiếp: Mở rộng kiểm tra hiệu quả của khử trùng môi trường không hấp nhiệt trên các loài cây thân gỗ, cây dược liệu khác; nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tương tác ở cấp độ tế bào và phiên mã của CuNPs và AgNPs trong quá trình biệt hóa mô; hoàn thiện quy trình công nghệ nhân giống quy mô công nghiệp trên hệ thống hộp nhựa dung tích lớn.

Giá trị tham khảo

Luận án mang lại giá trị tham khảo cụ thể cho các nhóm đối tượng:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và giảng viên chuyên ngành Công nghệ sinh học thực vật, Sinh lý học thực vật và Nông nghiệp công nghệ cao: Tham khảo phương pháp luận thiết kế thí nghiệm vi nhân giống, các quy trình định lượng enzyme chống oxy hóa (SOD, CAT, APX), phương pháp định lượng ethylene bằng sắc ký khí (GC) và kỹ thuật giải phẫu mô học thực vật.
• Kỹ thuật viên và cán bộ quản lý tại các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô thương mại: Tham khảo quy trình khử trùng môi trường nuôi cấy không dùng nồi hấp bằng AgNPs kết hợp tối ưu hàm lượng agar để giảm tiêu thụ điện năng và tăng năng suất lao động; quy trình thay thế $\text{HgCl}_2$ bằng CuNPs/AgNPs nhằm bảo vệ sức khỏe người thao tác và giảm ô nhiễm môi trường.
• Doanh nghiệp sản xuất hoa và cây cảnh giống (Dalat Hasfarm, các đơn vị sản xuất hoa tại Lâm Đồng và các địa phương khác): Tham khảo mô hình nuôi cấy mật độ cao trong hệ thống hộp nhựa thể tích lớn (NoM 5 L và 15 L) và phương pháp kiểm soát hiện tượng thủy tinh thể, rụng lá trên cây Cúc, Thu hải đường và Tử linh lan.

Câu hỏi thường gặp

1. Luận án đã sử dụng nồng độ AgNPs nào để khử trùng môi trường nuôi cấy cây hoa Cúc mà không cần hấp tiệt trùng? Luận án đã khảo sát các nồng độ AgNPs từ 1, 2, 3, 4 đến 5 mg/L và xác định nồng độ 4 mg/L AgNPs bổ sung vào môi trường MS0 (chứa 30 g/L sucrose) trước khi đun sôi 4 phút đạt hiệu quả vô trùng môi trường tương đương với phương pháp hấp tiệt trùng bằng nồi hấp (121°C, 15 psi, 20 phút) sau 4 tuần nuôi cấy.

2. Tại sao khi sử dụng AgNPs khử trùng môi trường không hấp nhiệt lại có thể giảm hàm lượng agar từ 8 g/L xuống 4 g/L? Theo kết quả đánh giá trạng thái vật lý của môi trường, môi trường MS0 không qua hấp tiệt trùng có độ cứng cao hơn so với môi trường được hấp tiệt trùng bằng nhiệt. Do đó, việc giảm nồng độ agar từ 8 g/L xuống 4 g/L vẫn đảm bảo khả năng nâng đỡ mẫu cấy, giúp chồi và hệ rễ cây Cúc sinh trưởng tối ưu và giảm chi phí nguyên liệu.

3. Nano đồng (CuNPs) được sử dụng trong công đoạn nào và kích thước hạt là bao nhiêu? CuNPs có kích thước hạt từ 20 đến 60 nm, được sử dụng làm chất khử trùng mẫu cấy ngoại sinh (cuống lá, cuống hoa, đoạn thân) cây Thu hải đường ở các nồng độ 50, 100, 200, 300, 400 mg/L (trong 10 phút) nhằm thay thế $\text{HgCl}_2$ (1.000 mg/L trong 6 phút) và $\text{Ca(ClO)}_2$ (60.000 mg/L trong 10 phút), sau đó đánh giá khả năng cảm ứng tạo phôi soma.

4. AgNPs có vai trò gì trong việc khắc phục hiện tượng bất thường ở cây Tử linh lan in vitro? Môi trường bổ sung 2 mg/L AgNPs giúp giảm tỷ lệ xuất hiện các hiện tượng bất thường (thủy tinh thể, hoại tử, hóa nâu mô và mô sẹo mép lá) trên cây Tử linh lan. Phân tích sinh hóa cho thấy AgNPs làm giảm sự tích lũy khí ethylene trong bình nuôi cấy, đồng thời gia tăng hoạt tính của các enzyme kháng oxy hóa SOD, CAT và APX.

5. Các hệ thống nuôi cấy hộp nhựa (NoM) được thiết kế với kích thước và mật độ nuôi cấy như thế nào? Hệ thống NoM1 là hộp nhựa vuông thể tích 5 L (miệng 21,5 × 21,5 cm, cao 8,5 cm) chứa 250 mL môi trường cấy 169 mẫu; hệ thống NoM2 là hộp nhựa chữ nhật 15 L (miệng 24,0 × 35,0 cm, đáy 22,5 × 33,0 cm, cao 13,5 cm) chứa 500 mL môi trường cấy 330 mẫu.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của Huỳnh Gia Bảo đã giải quyết thành công các vấn đề kỹ thuật trọng tâm trong vi nhân giống thực vật thông qua việc ứng dụng vật liệu nano kim loại AgNPs và CuNPs trên ba đối tượng cây Cúc, Thu hải đường và Tử linh lan. Các kết quả thực nghiệm đã xác lập quy trình khử trùng môi trường không qua hấp nhiệt kết hợp giảm 50% lượng agar, chứng minh hiệu quả khử trùng mẫu ngoại sinh và kích thích tạo phôi của CuNPs thay thế $\text{HgCl}_2$, đồng thời làm rõ cơ chế ức chế ethylene và gia tăng enzyme chống oxy hóa của AgNPs giúp hạn chế các rối loạn sinh lý in vitro. Công trình cung cấp các dẫn liệu khoa học xác thực và giải pháp kỹ thuật có tính ứng dụng thực tiễn cao cho lĩnh vực công nghệ sinh học thực vật và sản xuất giống thương phẩm.

Trích đoạn nội dung tài liệu

LỜI MỞ ĐẦU Lý do chọn đề tài Hiện nay, kỹ thuật nuôi cấy mô hay vi nhân giống được sử dụng rất rộng rãi để nhân giống các loài cây trồng khác nhau (cây hoa, cây rau, cây cảnh,…) và là công cụ hữu ích được sử dụng trong nghiên cứu sinh trưởng, sinh lý – sinh hóa của thực vật. Kỹ thuật nuôi cấy mô có thể sử dụng để sản xuất số lượng lớn cây giống sạch bệnh trong thời gian ngắn và sản xuất sinh khối chứa các chất có hoạt tính thứ cấp,. Bên cạnh những thuận lợi mang lại thì kỹ thuật nuôi cấy mô vẫn còn một số hạn chế như nhiễm nấm, vi khuẩn,…chúng sinh trưởng và làm hạn chế sự sinh trưởng của mô cấy do chúng sử dụng môi trường dinh dưỡng [1]. Bên cạnh đó, môi trường nuôi cấy tối ưu hay lý tưởng cho sự sinh trưởng của mẫu cấy cần phải hấp khử trùng.

Các bình nuôi cấy (túi nylon hay chai thủy tinh) chứa môi trường cũng cần được hấp khử trùng, môi trường được đun sôi; sau đó khử trùng môi trường nuôi cấy mô ở nhiệt độ 121 C với áp suất 15 psi trong khoảng thời gian từ 20 đến 40 phút. Ngoài ra, các bước chuẩn bị môi trường cần trải qua nhiều giai đoạn khác nhau và tốn nhiều công lao động, điện năng, thời gian,…cho việc hấp khử trùng môi trường. Nano bạc (AgNPs) có tác dụng kháng các vi sinh vật (nấm, vi khuẩn,…) và được sử dụng trong nghiên cứu hay ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như y dược, y sinh,. Các nghiên cứu về tác động của AgNPs lên thực vật như khử trùng mẫu cấy [2], nảy mầm của một số cây trồng [3], sinh lý cũng như hình thái của thực vật [4] cũng đã được chỉ ra.

Tuy nhiên, ảnh hưởng của AgNPs lên khả năng khử trùng môi trường nuôi cấy mô mà không hấp tiệt trùng vẫn chưa được công bố trước đây. Trong luận án này, AgNPs được bổ sung vào môi trường nuôi cấy (không hấp khử trùng) nhằm đánh giá khả năng khử trùng môi trường nuôi cấy và cảm ứng sinh trưởng tiếp theo của mẫu cấy cây Cúc. Ngoài ra, những nghiên cứu trước đây chưa ghi nhận vai trò của nano đồng (CuNPs) trong giai đoạn khử trùng và cảm ứng của mẫu cấy; vì vậy, nghiên cứu này cũng đánh giá ảnh hưởng của AgNPs và CuNPs trong giai đoạn khử trùng mẫu cấy và sinh trưởng tiếp theo, cảm ứng tạo phôi,…trên cây Thu hải đường. Bên cạnh đó, vai trò của AgNPs lên khả năng sinh trưởng và các hiện tượng bất 2 thường ở giai đoạn nhân nhanh chồi cây Tử linh lan cũng được chỉ ra trong luận án này.

Đề tài “Nghiên cứu tác dụng của nano bạc và nano đồng trong khử trùng mẫu, khử trùng môi trường nuôi cấy và vi nhân giống một số cây trồng có giá trị kinh tế” hướng tới giải quyết một số vấn đề còn hạn chế của nuôi cấy mô. Đây là định hướng nghiên cứu chưa được quan tâm nhiều ở trên thế giới cũng như tại Việt Nam. Kết quả của nghiên cứu sẽ góp phần đưa ra một hướng nghiên cứu mới trong vi nhân giống thực vật. Mục tiêu của đề tài Mục tiêu tổng quát Luận án được thực hiện nhằm đưa ra được giải pháp mới để khắc phục một số hạn chế đang gặp phải trong vi nhân giống như khử trùng môi trường nuôi cấy, khử trùng mẫu cấy, cải thiện sinh trưởng tiếp theo của mẫu cấy, khắc phục một số hiện tượng bất thường của cây Cúc, cây Thu hải đường và cây Tử linh lan nuôi cấy in vitro.

Mục tiêu cụ thể Xác định hiệu quả của AgNPs lên khả năng khử trùng môi trường nuôi cấy in vitro thay thế hấp tiệt trùng cũng như sinh trưởng tiếp theo của mẫu cấy cây Cúc. Xác định hiệu quả của AgNPs và CuNPs thay thế các chất khử trùng truyền thống như thủy ngân clorua (HgCl2) hay canxi hypochlorite (Ca(ClO)2) và ảnh hưởng của chúng lên sự sinh trưởng tiếp theo của mẫu cấy cây Thu hải đường. Xác định hiệu quả của AgNPs lên sự sinh trưởng và hạn chế một số hiện tượng bất thường trong giai đoạn tái sinh chồi cây Tử linh lan. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài Đối tượng nghiên cứu Ba loại cây trồng (Cúc, Thu hải đường và Tử linh lan) được sử dụng làm đối tượng nghiên cứu của luận án.

Hai loại vật liệu nano (AgNPs và CuNPs) được sử dụng làm vật liệu để khử trùng mẫu cấy và môi trường hoặc bổ sung vào môi trường nuôi cấy in vitro. 3 Phạm vi nghiên cứu Luận án đánh giá hiệu quả của AgNPs và CuNPs lên khả năng khử trùng môi trường nuôi cấy mô, mẫu cấy và khả năng sinh trưởng tiếp theo của mẫu cấy, các chỉ tiêu sinh lý - sinh hóa của cây Cúc, Thu hải đường và Tử linh lan nuôi cấy in vitro. Trong quá trình thực hiện thí nghiệm, mỗi đối tượng cây trồng có các chương trình phát sinh hình thái khác nhau cũng như AgNPs và CuNPs có những tác động khác nhau phụ thuộc vào giai đoạn nuôi cấy cũng như mẫu cấy của từng loại cây trồng: Đối với cây Cúc, AgNPs có hiệu quả khử trùng mẫy cấy cũng như khử trùng môi trường nuôi cấy không hấp tiệt trùng. Ngoài ra, mẫu cấy có thể sinh trưởng trên môi trưởng bổ sung AgNPs ở nồng độ cao.

Bên cạnh đó, qua đánh giá trạng thái môi trường nuôi cấy không hấp tiệt trùng thì độ cứng môi trường là lớn hơn so với hấp tiệt trùng; vì vậy, thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ agar cũng như đưa ra các hệ thống nuôi cấy khác nhau cũng được khảo sát. Đối với cây Thu hải đường, CuNPs được sử dụng như một chất khử trùng mới và chưa được công bố trước đây. CuNPs được sử dụng để khử trùng mẫu cấy và so sánh với các chất khử trùng khác cũng như đánh giá dư lượng Cu trong mẫu cấy (sau khi khử trùng) tác động đến sinh trưởng tiếp theo của mẫu cấy (cảm ứng tạo phôi, phát sinh phôi và sinh trưởng tiếp theo). Đối với cây Tử linh lan, nghiên cứu này đánh giá vai trò của AgNPs trong việc khắc phục một số hiện tượng bất thường trong nuôi cấy mô và gia tăng sinh trưởng của mẫu cấy.

Do đó, trên 3 đối tượng nghiên cứu khác nhau, 3 vấn đề có những điểm tương đồng và cũng có những điểm khác biệt được giải quyết trong luận án này. Vì vậy, cách trình bày luận án theo đối tượng nghiên cứu có thể giải quyết trọn vẹn từng bài toán trên từng đối tượng cây trồng cụ thể. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn Ý nghĩa khoa học Luận án này đã đánh giá được hiệu quả của AgNPs hoặc CuNPs lên khử trùng môi trường nuôi cấy mô thay thế hấp tiệt trùng, cảm ứng phát sinh hình thái, sinh 4 trưởng tiếp theo và hạn chế một số hiện tượng bất thường trong nuôi cấy in vitro cây trong nuôi cấy cây Cúc, cây Tử linh lan và cây Thu hải đường. Ý nghĩa thực tiễn Luận án đã sử dụng AgNPs là chất khử trùng môi trường nuôi cấy mô thay thế chất khử trùng truyền thống và không ảnh hưởng đến sinh trưởng tiếp theo của mẫu cấy.

Ngoài ra, AgNPs và CuNPs có thể sử dụng làm chất khử trùng mẫu cấy thay thế cho các chất khử trùng truyền thống và gia tăng sinh trưởng tiếp theo của mẫu cấy. Những đóng góp mới của luận án AgNPs bổ sung vào môi trường nuôi cấy được giảm một nửa hàm lượng agar có hiệu quả khử trùng môi trường nuôi cấy và không cần hấp tiệt trùng bằng nồi hấp. AgNPs và CuNPs có thể sử dụng làm tác nhân khử trùng mẫu cấy thay chất khử trùng truyền thống và cải thiện sinh trưởng tiếp theo của mẫu cấy. AgNPs gia tăng hiệu quả tái sinh chồi, giảm hiện tượng bất thường và giảm sự tích lũy ethylene, gia tăng hoạt tính enzyme chống oxy hóa của mẫu cấy nuôi cấy in vitro.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Khử trùng môi trường nuôi cấy in vitro Môi trường lý tưởng hay tối ưu cho sự sinh trưởng của cây trồng nuôi cấy mô cần được vô trùng; do đó, chúng phải được hấp tiệt trùng. Ngoài ra, các bình chứa môi trường nuôi cấy mô (bình thủy tinh, tam giác, túi nylon,…) cũng cần được hấp tiệt trùng. Môi trường nuôi cấy mô sau khi chuẩn bị cần được đun sôi nhằm hòa tan các thành phần môi trường và được hấp tiệt trùng bằng nồi hấp ở nhiệt độ 121 C, áp suất khoảng 15 psi trong khoảng thời gian từ 20 đến 40 phút tùy theo thể tích môi trường nuôi cấy mô (từ 20 đến 80 mL nếu là môi trường ở các bình nuôi cấy có thể tích từ 100 đến 500 mL).

Bên cạnh đó, chuẩn bị môi trường nuôi cấy mô cần trải qua nhiều giai đoạn; do đó, nó sẽ mất thời gian, công lao động, điện năng cho việc hấp tiệt trùng môi trường. Hầu hết môi trường nuôi cấy mô đều được tiệt trùng bằng nồi hấp (autoclave). Nồi hấp là một thiết bị khử trùng bằng áp suất hơi nước. Đối với thể tích môi trường nhỏ, có thể sử dụng một nồi áp suất mà hoạt động của nó theo nguyên tắc giống với nồi hấp.

Thời gian hấp khác nhau đối với thể tích môi trường khác nhau (Bảng 1. Thời gian hấp kéo dài có thể ảnh hưởng xấu đến khả năng đông của agar và chất lượng của môi trường [5]. Điều kiện hấp khử trùng môi trường nuôi cấy [5]. TT Thể tích môi trường/ o bình (mL) Thời gian tối thiểu ở 121 C (phút) 1 20-50 15 2 75 20 3 250 - 500 25 4 1.000 40 6 Hơn nữa, Leifert và cộng sự (1994) báo cáo rằng, vi khuẩn Bacillus có thể tồn tại sau khi hấp tiệt trùng ở khoảng 120°C [6].

Do đó, nên ủ môi trường sau khi hấp ở o nhiệt độ 30 đến 35 C trong khoảng 24 đến 48 giờ trước khi sử dụng để đánh giá xem nấm, vi khuẩn,…có trong môi trường nuôi cấy mô hay không [6]. Bên cạnh đó, hấp tiệt trùng môi trường sẽ ảnh hưởng đến sự thay đổi pH của môi trường và làm biến tính các thành phần của môi trường như đường, chất điều hòa sinh trưởng thực vật (CĐHSTTV), dịch chiết hữu cơ,…[7, 8]. Các CĐHSTTV nhạy cảm với nhiệt như Gibêrelin có thể mất hầu hết hoạt tính của chúng. Ngoài ra, một số vitamin bị phân hủy khi hấp tiệt trùng nhiệt độ cao.

Thời gian khử trùng quá lâu có thể làm thay đổi tính chất của agar và nó cũng có thể dẫn đến tạo ra các sản phẩm độc hại như 5- (hydroxymethyl) -2-furaldehyde và phenolics [9] dẫn đến làm giảm hiệu quả của môi trường lên sự sinh trưởng của mẫu cấy.