LỜI MỞ ĐẦU Lý do chọn đề tài Hiện nay, kỹ thuật nuôi cấy mô hay vi nhân giống được sử dụng rất rộng rãi để nhân giống các loài cây trồng khác nhau (cây hoa, cây rau, cây cảnh,…) và là công cụ hữu ích được sử dụng trong nghiên cứu sinh trưởng, sinh lý – sinh hóa của thực vật. Kỹ thuật nuôi cấy mô có thể sử dụng để sản xuất số lượng lớn cây giống sạch bệnh trong thời gian ngắn và sản xuất sinh khối chứa các chất có hoạt tính thứ cấp,. Bên cạnh những thuận lợi mang lại thì kỹ thuật nuôi cấy mô vẫn còn một số hạn chế như nhiễm nấm, vi khuẩn,…chúng sinh trưởng và làm hạn chế sự sinh trưởng của mô cấy do chúng sử dụng môi trường dinh dưỡng [1]. Bên cạnh đó, môi trường nuôi cấy tối ưu hay lý tưởng cho sự sinh trưởng của mẫu cấy cần phải hấp khử trùng.
Các bình nuôi cấy (túi nylon hay chai thủy tinh) chứa môi trường cũng cần được hấp khử trùng, môi trường được đun sôi; sau đó khử trùng môi trường nuôi cấy mô ở nhiệt độ 121 C với áp suất 15 psi trong khoảng thời gian từ 20 đến 40 phút. Ngoài ra, các bước chuẩn bị môi trường cần trải qua nhiều giai đoạn khác nhau và tốn nhiều công lao động, điện năng, thời gian,…cho việc hấp khử trùng môi trường. Nano bạc (AgNPs) có tác dụng kháng các vi sinh vật (nấm, vi khuẩn,…) và được sử dụng trong nghiên cứu hay ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như y dược, y sinh,. Các nghiên cứu về tác động của AgNPs lên thực vật như khử trùng mẫu cấy [2], nảy mầm của một số cây trồng [3], sinh lý cũng như hình thái của thực vật [4] cũng đã được chỉ ra.
Tuy nhiên, ảnh hưởng của AgNPs lên khả năng khử trùng môi trường nuôi cấy mô mà không hấp tiệt trùng vẫn chưa được công bố trước đây. Trong luận án này, AgNPs được bổ sung vào môi trường nuôi cấy (không hấp khử trùng) nhằm đánh giá khả năng khử trùng môi trường nuôi cấy và cảm ứng sinh trưởng tiếp theo của mẫu cấy cây Cúc. Ngoài ra, những nghiên cứu trước đây chưa ghi nhận vai trò của nano đồng (CuNPs) trong giai đoạn khử trùng và cảm ứng của mẫu cấy; vì vậy, nghiên cứu này cũng đánh giá ảnh hưởng của AgNPs và CuNPs trong giai đoạn khử trùng mẫu cấy và sinh trưởng tiếp theo, cảm ứng tạo phôi,…trên cây Thu hải đường. Bên cạnh đó, vai trò của AgNPs lên khả năng sinh trưởng và các hiện tượng bất 2 thường ở giai đoạn nhân nhanh chồi cây Tử linh lan cũng được chỉ ra trong luận án này.
Đề tài “Nghiên cứu tác dụng của nano bạc và nano đồng trong khử trùng mẫu, khử trùng môi trường nuôi cấy và vi nhân giống một số cây trồng có giá trị kinh tế” hướng tới giải quyết một số vấn đề còn hạn chế của nuôi cấy mô. Đây là định hướng nghiên cứu chưa được quan tâm nhiều ở trên thế giới cũng như tại Việt Nam. Kết quả của nghiên cứu sẽ góp phần đưa ra một hướng nghiên cứu mới trong vi nhân giống thực vật. Mục tiêu của đề tài Mục tiêu tổng quát Luận án được thực hiện nhằm đưa ra được giải pháp mới để khắc phục một số hạn chế đang gặp phải trong vi nhân giống như khử trùng môi trường nuôi cấy, khử trùng mẫu cấy, cải thiện sinh trưởng tiếp theo của mẫu cấy, khắc phục một số hiện tượng bất thường của cây Cúc, cây Thu hải đường và cây Tử linh lan nuôi cấy in vitro.
Mục tiêu cụ thể Xác định hiệu quả của AgNPs lên khả năng khử trùng môi trường nuôi cấy in vitro thay thế hấp tiệt trùng cũng như sinh trưởng tiếp theo của mẫu cấy cây Cúc. Xác định hiệu quả của AgNPs và CuNPs thay thế các chất khử trùng truyền thống như thủy ngân clorua (HgCl2) hay canxi hypochlorite (Ca(ClO)2) và ảnh hưởng của chúng lên sự sinh trưởng tiếp theo của mẫu cấy cây Thu hải đường. Xác định hiệu quả của AgNPs lên sự sinh trưởng và hạn chế một số hiện tượng bất thường trong giai đoạn tái sinh chồi cây Tử linh lan. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài Đối tượng nghiên cứu Ba loại cây trồng (Cúc, Thu hải đường và Tử linh lan) được sử dụng làm đối tượng nghiên cứu của luận án.
Hai loại vật liệu nano (AgNPs và CuNPs) được sử dụng làm vật liệu để khử trùng mẫu cấy và môi trường hoặc bổ sung vào môi trường nuôi cấy in vitro. 3 Phạm vi nghiên cứu Luận án đánh giá hiệu quả của AgNPs và CuNPs lên khả năng khử trùng môi trường nuôi cấy mô, mẫu cấy và khả năng sinh trưởng tiếp theo của mẫu cấy, các chỉ tiêu sinh lý - sinh hóa của cây Cúc, Thu hải đường và Tử linh lan nuôi cấy in vitro. Trong quá trình thực hiện thí nghiệm, mỗi đối tượng cây trồng có các chương trình phát sinh hình thái khác nhau cũng như AgNPs và CuNPs có những tác động khác nhau phụ thuộc vào giai đoạn nuôi cấy cũng như mẫu cấy của từng loại cây trồng: Đối với cây Cúc, AgNPs có hiệu quả khử trùng mẫy cấy cũng như khử trùng môi trường nuôi cấy không hấp tiệt trùng. Ngoài ra, mẫu cấy có thể sinh trưởng trên môi trưởng bổ sung AgNPs ở nồng độ cao.
Bên cạnh đó, qua đánh giá trạng thái môi trường nuôi cấy không hấp tiệt trùng thì độ cứng môi trường là lớn hơn so với hấp tiệt trùng; vì vậy, thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ agar cũng như đưa ra các hệ thống nuôi cấy khác nhau cũng được khảo sát. Đối với cây Thu hải đường, CuNPs được sử dụng như một chất khử trùng mới và chưa được công bố trước đây. CuNPs được sử dụng để khử trùng mẫu cấy và so sánh với các chất khử trùng khác cũng như đánh giá dư lượng Cu trong mẫu cấy (sau khi khử trùng) tác động đến sinh trưởng tiếp theo của mẫu cấy (cảm ứng tạo phôi, phát sinh phôi và sinh trưởng tiếp theo). Đối với cây Tử linh lan, nghiên cứu này đánh giá vai trò của AgNPs trong việc khắc phục một số hiện tượng bất thường trong nuôi cấy mô và gia tăng sinh trưởng của mẫu cấy.
Do đó, trên 3 đối tượng nghiên cứu khác nhau, 3 vấn đề có những điểm tương đồng và cũng có những điểm khác biệt được giải quyết trong luận án này. Vì vậy, cách trình bày luận án theo đối tượng nghiên cứu có thể giải quyết trọn vẹn từng bài toán trên từng đối tượng cây trồng cụ thể. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn Ý nghĩa khoa học Luận án này đã đánh giá được hiệu quả của AgNPs hoặc CuNPs lên khử trùng môi trường nuôi cấy mô thay thế hấp tiệt trùng, cảm ứng phát sinh hình thái, sinh 4 trưởng tiếp theo và hạn chế một số hiện tượng bất thường trong nuôi cấy in vitro cây trong nuôi cấy cây Cúc, cây Tử linh lan và cây Thu hải đường. Ý nghĩa thực tiễn Luận án đã sử dụng AgNPs là chất khử trùng môi trường nuôi cấy mô thay thế chất khử trùng truyền thống và không ảnh hưởng đến sinh trưởng tiếp theo của mẫu cấy.
Ngoài ra, AgNPs và CuNPs có thể sử dụng làm chất khử trùng mẫu cấy thay thế cho các chất khử trùng truyền thống và gia tăng sinh trưởng tiếp theo của mẫu cấy. Những đóng góp mới của luận án AgNPs bổ sung vào môi trường nuôi cấy được giảm một nửa hàm lượng agar có hiệu quả khử trùng môi trường nuôi cấy và không cần hấp tiệt trùng bằng nồi hấp. AgNPs và CuNPs có thể sử dụng làm tác nhân khử trùng mẫu cấy thay chất khử trùng truyền thống và cải thiện sinh trưởng tiếp theo của mẫu cấy. AgNPs gia tăng hiệu quả tái sinh chồi, giảm hiện tượng bất thường và giảm sự tích lũy ethylene, gia tăng hoạt tính enzyme chống oxy hóa của mẫu cấy nuôi cấy in vitro.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Khử trùng môi trường nuôi cấy in vitro Môi trường lý tưởng hay tối ưu cho sự sinh trưởng của cây trồng nuôi cấy mô cần được vô trùng; do đó, chúng phải được hấp tiệt trùng. Ngoài ra, các bình chứa môi trường nuôi cấy mô (bình thủy tinh, tam giác, túi nylon,…) cũng cần được hấp tiệt trùng. Môi trường nuôi cấy mô sau khi chuẩn bị cần được đun sôi nhằm hòa tan các thành phần môi trường và được hấp tiệt trùng bằng nồi hấp ở nhiệt độ 121 C, áp suất khoảng 15 psi trong khoảng thời gian từ 20 đến 40 phút tùy theo thể tích môi trường nuôi cấy mô (từ 20 đến 80 mL nếu là môi trường ở các bình nuôi cấy có thể tích từ 100 đến 500 mL).
Bên cạnh đó, chuẩn bị môi trường nuôi cấy mô cần trải qua nhiều giai đoạn; do đó, nó sẽ mất thời gian, công lao động, điện năng cho việc hấp tiệt trùng môi trường. Hầu hết môi trường nuôi cấy mô đều được tiệt trùng bằng nồi hấp (autoclave). Nồi hấp là một thiết bị khử trùng bằng áp suất hơi nước. Đối với thể tích môi trường nhỏ, có thể sử dụng một nồi áp suất mà hoạt động của nó theo nguyên tắc giống với nồi hấp.
Thời gian hấp khác nhau đối với thể tích môi trường khác nhau (Bảng 1. Thời gian hấp kéo dài có thể ảnh hưởng xấu đến khả năng đông của agar và chất lượng của môi trường [5]. Điều kiện hấp khử trùng môi trường nuôi cấy [5]. TT Thể tích môi trường/ o bình (mL) Thời gian tối thiểu ở 121 C (phút) 1 20-50 15 2 75 20 3 250 - 500 25 4 1.000 40 6 Hơn nữa, Leifert và cộng sự (1994) báo cáo rằng, vi khuẩn Bacillus có thể tồn tại sau khi hấp tiệt trùng ở khoảng 120°C [6].
Do đó, nên ủ môi trường sau khi hấp ở o nhiệt độ 30 đến 35 C trong khoảng 24 đến 48 giờ trước khi sử dụng để đánh giá xem nấm, vi khuẩn,…có trong môi trường nuôi cấy mô hay không [6]. Bên cạnh đó, hấp tiệt trùng môi trường sẽ ảnh hưởng đến sự thay đổi pH của môi trường và làm biến tính các thành phần của môi trường như đường, chất điều hòa sinh trưởng thực vật (CĐHSTTV), dịch chiết hữu cơ,…[7, 8]. Các CĐHSTTV nhạy cảm với nhiệt như Gibêrelin có thể mất hầu hết hoạt tính của chúng. Ngoài ra, một số vitamin bị phân hủy khi hấp tiệt trùng nhiệt độ cao.
Thời gian khử trùng quá lâu có thể làm thay đổi tính chất của agar và nó cũng có thể dẫn đến tạo ra các sản phẩm độc hại như 5- (hydroxymethyl) -2-furaldehyde và phenolics [9] dẫn đến làm giảm hiệu quả của môi trường lên sự sinh trưởng của mẫu cấy.