CHƯƠNG 1.1 Đặc điểm của chitosan 1.1 Chitosan Chitosan là sản phẩm deacetyl hóa chitin, trong đó nhóm (-NH2) thay thế nhóm (- COCH3) ở vị trí C(2). Do quá trình khử acetyl xảy ra không hoàn toàn nên người ta quy ước độ deacetyl hóa (degree of deacetylation) DDA > 50% thì gọi là chitosan [1]. Chitosan có cấu trúc tuyến tính từ các đơn vị 2-amino-2-deoxy-β-D- glucosamine liên kết với nhau bằng liên kết β-(1,4)-glucoside (Hình 1.1: Công thức cấu tạo của chitosan Trong các loài thủy sản đặc biệt là trong vỏ tôm, cua, ghẹ, hàm lượng chitin - chitosan chiếm khá cao dao động từ 14 - 35% so với trọng lượng khô. Vì vậy vỏ tôm, cua, ghẹ là nguồn nguyên liệu chính để sản xuất chitin – chitosan [1].
Chitosan được xem là polyme tự nhiên quan trọng nhất, không độc, có khả năng phân huỷ sinh học, có khả năng tạo màng và có tính tương thích về mặt sinh học. Chitosan có khả năng tích điện dương do đó nó có khả năng kết hợp với những chất tích điện âm như chất béo, lipid và axit mật. Với đặc tính có thể hoà tan tốt trong môi trường axit, chitosan được chú ý đặc biệt như là một loại vật liệu mới và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như dược phẩm, mỹ phẩm, xử lý nước thải và trong thực phẩm như là tác nhân kết hợp, gel hóa, hay tác nhân ổn định.2 Sản xuất chitosan Chitosan thường được sản xuất từ chất thải giáp xác vỏ như tôm, cua, ghẹ [3]. Chitosan phân tách từ vỏ tôm được thực hiện qua 4 bước cơ bản: khử khoáng (DM), khử protein (DP), khử màu (DC), và deacetyl hóa (DDA).1 Các phương pháp sản xuất chitosan Hiện nay, chitosan được thu từ chitin theo hai phương pháp chính là phương pháp hóa học và phương pháp sinh học.
+ Phương pháp hóa học: được chia làm 3 giai đoạn chính: loại bỏ khoáng bằng axit, loại bỏ protein bằng kiềm và tẩy màu loại sắc tố và chất béo [1]. Ưu điểm: Thời gian xử lý vỏ tôm thu được chitin nhanh. 4 luan an Nhược điểm: Chitin thu được phụ thuộc nhiều vào qui trình xử lý với axit và kiềm. Quá trình này tiêu tốn năng lượng, đưa ra môi trường một lượng lớn nước thải chứa kiềm và axit gây ăn mòn và ô nhiễm mạnh, đồng thời rất khó tách các sản phẩm còn giá trị như: chất màu, protein… Chitin thu được có tính ổn định thấp.
Giá thành của sản phẩm chitin và chitosan sản xuất theo phương pháp này cao, nên bất lợi trong vấn đề thương mại. + Phương pháp sinh học: sử dụng vi khuẩn sinh protease hay chế phẩm protease để loại protein, vi khuẩn lactic hay Bacillus để loại khoáng. Phương pháp dùng chế phẩm protease, các chế phẩm enzyme sử dụng như: trypsin, papain, pepsin [4], chymotrysin, pancreatin, alcalase [5]. Phương pháp enzyme có ưu điểm là thời gian ngắn (vài giờ) tuy nhiên có giá thành cao hơn so với phương pháp vi sinh, lượng protein còn lại trong chitin cao (4,4-7,9%) [6].
Phương pháp loại khoáng ra khỏi phế liệu tôm sử dụng vi khuẩn lactic là hướng nghiên cứu hiện nay [7]. So với loại protein, phương pháp sinh học loại khoáng dùng vi khuẩn lactic đạt hiệu quả khá cao, thường loại >90% khoáng thậm chí có thể loại được đến 99,7% khoáng chỉ trong thời gian 2-3 ngày [7]. Rao và Stevens (2006) cho thấy dùng Lactobacillus có thể khử 81,6% protein và 59,8% khoáng [8]. Phương pháp sinh học ngoài việc cho chitin có chất lượng cao, thân thiện môi trường còn cho phép tận thu dịch lên men dùng làm thức ăn cho gia súc có giá trị.
Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp là thời gian lên men kéo dài.2 Tình hình nghiên cứu quy trình sản xuất tại Việt Nam Tại Việt Nam đã có một vài nghiên cứu về tách chiết chitin, chitosan. Năm 1978, trường Đại học Thủy sản Nha Trang bắt đầu nghiên cứu vấn đề này. Sau đó, Nguyễn Văn Ngoạn và cs. thuộc viện nghiên cứu Hải sản (1993 - 1995) đã nghiên cứu và sản xuất chitin, chitosan.
Vật liệu chitosan của Viện Hóa học được Bộ Y tế công nhận là nguyên liệu dược dụng, đạt tiêu chuẩn dùng trong y tế. Chitosan đã được thành công ứng dụng trong chế biến thực phẩm hoặc làm chế phẩm công nghiệp vải, màng chitosan và glucosamin [9]. Trần Thị Luyến và cs. nghiên cứu thu hồi chitin bằng phương pháp lên men lactic dùng vi khuẩn L.
Tuy nhiên, hàm lượng protein và khoáng bị khử chưa cao chỉ tương ứng 61% và 43% [10]. Hạn chế của các nghiên cứu trên là chưa đưa ra được qui trình hoàn thiện để thu hồi được chitin đạt tiêu chuẩn. Gần đây nhất, việc nghiên cứu thu nhận chitin từ phế liệu tôm bằng phương pháp sinh học đã được nghiên cứu bởi Lê Thanh Hà và cs. thuộc Trường Đại học Bách Khoa Hà nội và đã thu được kết quả khả quan [11].
Gần đây nhất, tác giả Nguyễn Thị Minh Nguyệt và cs.3 Các tính chất của chitosan 1.1 Tính chất vật lý của chitosan Chitosan là chất rắn, xốp, nhẹ, hình vảy, màu trắng hay vàng nhạt, không mùi vị, có độ nhớt tương đối cao phụ thuộc vào quá trình chế tạo [9, 13]. Chitosan 5 luan an tan tốt trong axit có pH <6,0; tuy nhiên tại pH>7,0 chitosan khó hoà tan hơn do khuynh hướng xảy ra kết lắng hoặc tạo gel [14]. Chitosan có khối lượng phân tử khác nhau ứng với các nguồn chitin khác nhau. Sản phẩm chitosan có khối lượng phân tử từ 100,000 - 1,200,000 Daltons phụ thuộc vào quá trình xử lý.
Người ta thường phân loại chitosan dựa vào trọng lượng phân tử [15, 16]. Bản chất của chitosan là polyme sinh học có phân tử lượng lớn nên khi hòa tan vào dung môi, chitosan tạo dung dịch có độ nhớt lớn, dung dịch dạng gel, tạo thành màng mỏng khi được phun hay phủ một lớp mỏng lên bề mặt vật liệu và để khô tự nhiên. Màng chitosan dai, khó xé rách, có khả năng tự phân hủy sinh học [14]. Ứng dụng tính chất này nên chitosan được dùng để tạo màng không thấm bảo quản trứng, trái cây, hay dùng hỗ trợ trong điều trị viêm loét dạ dày, tá tràng (trong môi trường axit của dạ dày, chitosan tạo gel che phủ, bảo vệ niêm mạc) [9].
Quá trình deacetyl hóa (DDA) bao gồm quá trình loại nhóm acetyl khỏi chuỗi phân tử chitin và hình thành phân tử chitosan với nhóm amin hoạt động hóa học cao. Mức độ DDA của chitosan khoảng 56%-99% (nhìn chung là 80%) phụ thuộc vào loài giáp xác và phương pháp sử dụng [17]. Phương pháp để xác định mức độ deacetyl hóa của chitosan bao gồm thử ninhydrin, chuẩn độ theo điện thế, quang phổ hồng ngoại, chuẩn độ bằng HI.2 Tính chất hóa học của chitosan Trong phân tử chitosan có chứa các nhóm chức -OH, -NHCOCH3 và nhóm – OH, nhóm -NH2, phản ứng hóa học có thể xảy ra ở vị trí nhóm chức tạo ra dẫn xuất thế O-, dẫn xuất thế N- [15]. Mặt khác chitosan là những polyme mà các monome được nối với nhau bởi các liên kết α-(1-4)-glicoside, các liên kết này rất dễ bị cắt đứt bởi các chất hoá học như: axit, bazơ, tác nhân oxy-hóa và các enzyme thuỷ phân.
Trong phân tử chitosan và một số dẫn xuất của chitosan có chứa các nhóm chức mà trong đó các nguyên tử Oxi và Nitơ của nhóm chức còn cặp electron chưa sử dụng, do đó chúng có khả năng tạo phức, phối trí với hầu hết các kim loại nặng và các kim loại chuyển tiếp như: Hg2+, Cd2+, Zn2+, Cu2+, Ni2+, Co2+., tùy nhóm chức trên mạch polyme mà thành phần và cấu trúc của phức khác nhau. Hơn nữa chitosan và các kim loại như Ag+, Cu2+, Ni2+, …có tính chất khử trùng và diệt khuẩn, sau khi chitosan liên kết với các ion kim loại nhờ oxi hay nito, các liên kết ràng buộc làm tăng cường hoạt tính kháng khuẩn [18].3 Tính chất sinh học của chitosan Chitosan được chứng minh là có nhiều hoạt tính sinh học. Chitosan có khả năng kích thích làm tăng cường hệ thống miễn dịch cơ thể, hạn chế sự phát triển của các tế bào u bướu, ung thư, HIV/AIDS, chống tia tử ngoại, chống ngứa,… [19, 20]. Ngoài ra, chitosan có thể hấp thụ chất bẩn trong đường ruột, phòng chống bệnh tiểu đường, hạ huyết áp, phòng bệnh xơ cứng động mạch, đào thải độc tố và hấp thụ kim loại nặng, cải thiện cơ năng tiêu hóa [20-22].
Chitosan có khả năng thúc đẩy làm lành da, phục hồi vết thương, cầm máu, thấm máu ở vị trí bị xuất huyết [23]. 6 luan an Chitosan hầu như không độc, LD50 = 16 g/kg cân nặng cơ thể, không gây độc trên súc vật thực nghiệm và người, không gây độc tính trường diễn (LD50 lượng chất độc gây chế 50% số cá thể thí nghiệm) [24].4 Đặc tính kháng vi sinh vật của chitosan 1.1 Khả năng kháng vi sinh vật của chitosan Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng chitosan có khả năng ức chế sự phát triển của vi sinh vật. Khả năng kháng khuẩn của chitosan phụ thuộc các yếu tố: loại chitosan, pH, nhiệt độ, thành phần thực phẩm [38]. Chitosan có khả năng kháng virus [25] và nhiều loài vi sinh vật như vi khuẩn Gram (-), vi khuẩn Gram (+), nấm mốc và nấm men.
Khả năng kháng vi khuẩn Chitosan ức chế sự phát triển của rất nhiều vi khuẩn như Escherichia coli, Salmonella, Vibrio parahaemolyticus, Listeria monocytogenes, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus,…Nồng độ ức chế sự phát triển của vi khuẩn thay đổi trong khoảng 10 – 16000 ppm [26]. Ngoài ra, các thí nghiệm cũng cho thấy có rất nhiều ion kim loại có thể ảnh hưởng đến đặc tính kháng khuẩn của chitosan như K+, Na+, Mg2+,… Các nghiên cứu cho thấy chitosan có thể làm yếu đi chức năng bảo vệ của thành tế bào nhiều vi khuẩn [26-28]. Khả năng kháng nấm men và nấm mốc Hoạt tính kháng nấm của chitosan được chứng minh qua các nghiên cứu với nhiều loại nấm khác nhau như Saccharomyces ludwigii, Pichia, Pseudomonas fragi, Candida, Zygosaccharomyces bailii, Pyricularia grisea, …. Nồng độ nhỏ nhất ức chế sự phát triển thay đổi từ 10 – 5000 ppm.
Nhìn chung, chitosan ở nồng độ 1000 ppm làm giảm sự phát triển của các loại nấm trừ Zygomycetes vì chitosan là một thành phần cấu tạo trong thành tế bào của chúng [2, 29]. Nghiên cứu hiệu quả kháng nấm mốc gây hư hỏng quả của chitosan nồng độ 0,5; 1; 1,5 và 2% cho thấy chitosan có tác dụng kháng nấm ở các giai đoạn phát triển khác nhau (sự tăng trưởng của sợi nấm, sự nảy mầm của bào tử) của cả Colettochitrum musae phân lập từ chuối, Colettochitrum gloeosporioides phân lập từ đu đủ và thanh long [30]. Kết quả này cũng tương tự như kết quả của Bautista- Baños và cs.