Đặt vấn đề Khoai tây là loài cây nông nghiệp ngắn ngày, trồng lấy củ chứa tinh bột. Chúng là loại cây trồng lấy củ rộng rãi nhất thế giới và là loại cây trồng phổ biến thứ tư về mặt sản lượng tươi - xếp sau lúa, lúa mì và ngô. Khoai tây có vai trò chính trong việc đảm bảo an ninh lương thực toàn cầu. Nó là lương thực chính cho hàng tỷ người trên toàn cầu, bao gồm hàng triệu người nghèo ở miền đông Ấn Độ, Bangladesh và các khu vực miền núi của Trung Quốc.
Ở Việt Nam, khoai tây được trồng khá rộng rãi vào vụ đông ở miền Bắc và đóng vai trò làm thực phẩm là chủ yếu. Việc trồng khoai tây ở Việt Nam đang được chú trọng cả về sản lượng và chất lượng. Vì thế việc nghiên cứu nhằm tăng khả năng sinh trưởng, phát triển cho cây khoai tây cũng được chú trọng. Hệ vi sinh vật nội sinh trong cây khoai tây đóng một vai trò quan trọng trong quá trình phát triển của cây khoai tây.
Do vậy, việc nghiên cứu hệ vi sinh sinh vật nội sinh, đặc biệt là nhóm vi sinh vật nội cộng sinh trong cây khoai tây có thể góp phần đưa ra giải pháp trồng trọt tốt hơn. Hiện nay, các chỉ thị phân tử như RAPD, ISSR, SSR. Chỉ thị phân tử RAPD và ISSR được sử dụng khá phổ biến để đánh giá đa dạng di truyền giúp bảo tồn và phát triển nguồn gen, chọn tạo giống, phát triển các giống. Chỉ thị phân tử RAPD và ISSR được sử dụng rộng rãi trong đánh giá đa dạng di truyền bởi các ưu điểm như quy trình nhanh chóng, đơn giản, hiệu quả, tự động, yêu cầu lượng DNA nhỏ, tính đa hình cao.
Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi tiến hành đề tài: “Phân tích đa dạng di truyền của một số chủng vi sinh vật nội sinh trong cây khoai tây”. Mục đích nghiên cứu và yêu cầu đề tài 1. Mục đích nghiên cứu Phân lập và phân tích đa dạng di truyền của các mẫu giống vi sinh vật nội sinh trong cây khoai tây. Yêu cầu đề tài - Phân lập được vi sinh vật nội sinh trong cây khoai tây, khảo sát và lựa chọn một số mẫu VSV phục vụ đánh giá đa dạng di truyền.
- Xác định quy trình tách chiết DNA phù hợp cho DNA ít đứt gãy, tinh sạch đảm bảo tiêu chuẩn làm khuôn chạy PCR. - Xác định quy trình chạy PCR phù hợp để có tính lặp lại cao, băng vạch sắc nét, rõ ràng. - Sử dụng các chỉ thị RAPD và ISSR để đánh giá đa dạng di truyền một số mẫu giống vi sinh vật nội sinh trong cây khoai tây. 2 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.
Giới thiệu chung về cây khoai tây 2. Khái quát chung về khoai tây Khoai tây được trồng từ lâu đời ở Nam Mỹ. Được đưa vào châu Âu từ thế kỷ XVI. Ở nước ta, người Pháp đem vào trồng vào cuối thế kỷ XIX và ngày nay, khoai tây được trồng rộng rãi trong vụ đông ở các tỉnh phía Bắc và vùng núi cao ở miền Bắc và miền Nam.
Ở nước ta, giống khoai tây ruột vàng là giống trồng phổ biến hiện nay đã được chọn lọc, nhân và giữ giống từ lâu nay. Phân loại thực vật: Khoai tây thuộc họ Solanaceae, chi Solanum.1: Hình ảnh cây khoai tây 2. Đặc điểm hình thái cây khoai tây Rễ cây khoai tây có thể là rễ cọc hoặc rễ chùm. Khoai tây trồng từ hạt có cả rễ cọc và rễ chùm còn khoai tây từ củ chỉ phát triển rễ chùm.
Khoai tây có bộ rễ ăn nông (0-40cm), rễ liên tục phát triển trong quá trình sinh trưởng và phát triển của cây. Thân khoai tây bao gồm thân trên mặt đất và thân dưới mặt đất. Sau khi trồng 7-10 ngày, mầm từ củ giống vươn dài ra, lên khỏi mặt đất và phát triển thành thân chính mang lá. Phần thân dưới mặt đất (thân củ) thực chất do 3 sựu phình to và rút ngắn của tia củ.
Lá khoai tây hình thành và phát triển theo sự sinh trưởng của cây khoai tây. Đầu tiên là các lá nguyên đơn, dần dần hình thành các lá kép lẻ chưa hoàn chỉnh và cuối cùng lá các lá hoàn chỉnh. Hoa khoai tây có thể được thụ phấn bởi côn trùng hoặc tự thụ phấn, quả khoai tây thuộc loại quả mọng hình tròn hoặc hình trái xoan. Các giai đoạn sinh trưởng của khoai tây Thời kỳ ngủ nghỉ: Thông thường củ khoai tây mới thu hoạch không có khả năng mọc mầm; Ta gọi đó là hiện tượng ngủ nghỉ.
Thời kỳ ngủ nghỉ dài hay ngắn phụ thuộc chủ yếu vào giống bên cạnh đó các yếu tố tác động bên ngoài như sự chà sát cơ giới, tác động của hoá chất cũng là yếu tố tác động đến thời kỳ ngủ nghỉ. Sau khi hết thời kỳ ngủ nghỉ, hoặc khi được xử lý phá ngủ củ khoai tây mới có khả năng mọc mầm. Thời kỳ mọc mầm: Đây là thời kỳ đầu tiên trong chu kỳ phát triển của cây khoai tây. Đặc điểm cơ bản của thời kỳ này là mầm ở các mắt củ phát triển dần thành cây con.
Thời điểm thích hợp nhất để trồng là khi củ có nhiều mầm và mầm có sức sống cao. Thời kỳ sinh trưởng thân, lá: Sau khi trồng, mầm phát triển thành các thân. Thân chính mọc trực tiếp từ củ giống, thân phụ mọc ra từ thân chính. Sự hình thành thân ngầm: Tia củ được hình thành sau khi trồng khoảng 30-40 ngày.
Tia củ có màu trắng, phát triển theo hướng nằm ngang với mặt đất. Phần đầu tia củ có khả năng phát triển mạnh về kích thước và số lượng, tích lũy chất dinh dưỡng để hình thành củ sau này. Thời kỳ phát triển củ, ra hoa tạo quả và chín: Tiếp sau hình thành tia củ là thời kỳ tia củ phình to. Chất dinh dưỡng được vận chuyển về củ làm củ lớn nhanh.
Cùng với sự phát triển của củ thì các cụm hoa hình thành. Sau khi thụ phấn thì quả lớn dần và chuyển sang thời kỳ quả và hạt chín. Lá cây chuyển sang màu vàng và chết. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của khoai tây Nhiệt độ: Khoai tây ưa khí hậu ấm áp ôn hoà, khả năng chịu nóng và chịu rét đều không cao.
Yêu cầu nhiệt độ khác nhau ở các thời kỳ sinh trưởng phát triển. Thời kỳ sinh trưởng thân, lá nhiệt độ thích hợp: 20 - 25°C. Thời kỳ hình thành và phát triển của củ nhiệt độ thích hợp: 17 - 20°C nhưng quá trình tích luỹ tinh bột thì nhiệt độ thích hợp là 16 - 18°C. Ánh sáng: Khoai tây là cây ưa sáng, cường độ ánh sáng thích hợp cho năng suất cao từ 40.
Cây khoai tây yêu cầu ánh sáng thích hợp theo từng thời kỳ sinh trưởng phát triển. Thời kỳ hình thành tia củ và tia củ phát triển yêu cầu thời gian chiếu sáng ngày ngắn 10 -12 giờ/ngày. Nước: Khoai tây có bộ rễ ăn nông nên cần cung cấp lượng nước thường xuyên. Theo nghiên cứu cho thấy trong suốt quá trình sinh trưởng, khoai tây cần lượng nước khoảng 500-700mm với độ ẩm khoảng 60-85%.
Đất, pH và dinh dưỡng: loại đất tốt nhất cho khoai tây là các loại đất có thành phần cơ giới nhẹ như đất phù sa, đất thịt, đất bãi. Độ pH thích hợp cho cây khoai tây là 5-7, thích hợp nhất là 6-6,5. Yêu cầu về dinh dưỡng cần đầy đủ các nguyên tố đa lượng (N, P, K,…) và các nguyên tố vi lượng (Mo, Ca,…) để cây sinh trưởng và phát triển tốt. Giá trị của cây khoai tây Khoai tây là một loại củ đa năng, có giá thành tương đối rẻ, dễ trồng, dễ chăm sóc và có hàm lượng chất dinh dưỡng cao, vì vậy nhiều hộ gia đình tại Việt Nam đã lựa chọn khoai tây như một món ăn chính trong các bữa ăn hàng ngày.
Giá trị dinh dưỡng Khoai tây nấu chín ở trạng thái còn nguyên vỏ là một nguồn thực phẩm cung cấp nhiều loại vitamin và khoáng chất thiết yếu cho cơ thể, ví dụ như vitamin C hoặc kali. 5 Trong khoai tây chiếm phần lớn là nước, ngoài ra các thành phần chủ yếu của khoai tây bao gồm carbs, protein và một lượng chất xơ vừa phải, đặc biệt khoai tây hầu như không có chất béo. Hiện trạng khoai tây tại Việt Nam Ông Nguyễn Như Cường – Phó Cục trưởng Cục Trồng trọt, Bộ NN&PTNT cho biết, khoai tây ở Việt Nam hiện chủ yếu phục vụ ăn tươi ở thị trường nội địa, xuất khẩu lượng nhỏ sang Indonesia. Từ tháng 6 - 9 hàng năm thường nhập khoai tây từ Trung Quốc.
Việt Nam vẫn đang phải nhập khẩu hàng năm 1 lượng lớn khoai tây cho tiêu dùng và chế biến. Tại Việt Nam, nhu cầu cho các nhà máy chế biến hiện khoảng 180.000 tấn khoai tây nguyên liệu/năm, nhưng sản xuất trong nước chỉ đáp ứng được khoảng 30 - 40%, còn lại là phải nhập khẩu từ rất nhiều nước khác nhau. Vi sinh vật nội sinh thực vật 2. Lịch sử nghiên cứu Nghiên cứu về vi khuẩn không gây bệnh cư trú bên trong mô thực vật đã bắt đầu từ năm 1926.
Kể từ năm 1940, đã có rất nhiều báo cáo về vi khuẩn nội sinh bản địa cư trú trong mô của nhiều loại thực vật khác nhau, kể cả hạt, noãn, củ, rễ, thân lá và quả (Hallmann et al. Tiếp đó, các nghiên cứu về vi khuẩn nội sinh chủ yếu tập trung vào các tác dụng có lợi và sinh thái của chúng (Ryan et al., 2008) để hiểu rõ hơn về phương thức tương tác của vi khuẩn nội sinh với kí chủ của chúng. Gần đây, các nhà khoa học lại tập trung vào việc sàng lọc các dòng vi khuẩn nội sinh và nghiên cứu hiệu quả của chúng đối với sinh trưởng, phát triển của thực vật và hạn chế ô nhiễm môi trường nhằm sản xuất các chế phẩm sinh học phục vụ nông nghiệp (Senthilkumar et al. Định nghĩa vi sinh vật nội sinh thực vật Vi khuẩn nội ký sinh thực vật (Endophytic bacteria) được tìm thấy trong hầu hết ở các loài thực vật, chúng cư trú ở trong nội mô của thực vật ký chủ và giữa chúng hình thành một loạt các mối quan hệ khác nhau như cộng sinh tương hỗ, công sinh dinh dưỡng, hội sinh …Hầu hết các dạng nội ký sinh này bắt đầu xuất hiện từ vùng rễ hay bề mặt lá, tuy nhiên, một số loại có thể ký sinh trên hạt.
Kado (1992) định nghĩa vi khuẩn nội sinh là những "vi khuẩn cư trú trong mô thực vật sống mà không làm tổn hại đáng kể hoặc đạt được lợi ích khác ngoài việc đảm bảo cư trú".