Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu
Thảo quả (Amomum aromaticum Roxb.), thuộc họ Gừng (Zingiberaceae), là loài cây thuốc quý có nguồn gốc từ vùng cận Himalaya, phân bố tự nhiên và được canh tác tại Đông Bắc Ấn Độ, Nepal, Tây Nam Trung Quốc và vùng núi cao phía Bắc Việt Nam. Tại Việt Nam, Thảo quả phân bố chủ yếu ở các tỉnh có khí hậu mát mẻ như Lào Cai, Cao Bằng, Hà Giang, Tuyên Quang và Lai Châu, thường sinh trưởng dưới tán rừng nguyên sinh ở độ cao 1.600 - 2.200 m với độ ẩm không khí cao. Trong y học cổ truyền, quả Thảo quả được sử dụng để điều trị các chứng đau bụng, đầy trướng, nôn mửa, tiêu chảy, sốt rét lách to và nhiễm khuẩn răng miệng. Trong công nghiệp thực phẩm, dược liệu này đóng vai trò chất gia vị và tạo hương.
Các nghiên cứu hóa thực vật và dược lý hiện đại trên thế giới chỉ ra rằng chi Amomum nói chung và Thảo quả nói riêng sở hữu các nhóm hoạt chất sinh học đa dạng như tinh dầu, flavonoid, diarylheptanoid, sterol và các hợp chất phenolic, mang lại nhiều tác dụng sinh học giá trị bao gồm kháng ung thư, kháng khuẩn phổ rộng, chống oxy hóa và cải thiện chức năng tim mạch. Mặc dù có tiềm năng ứng dụng lớn, các nghiên cứu chuyên sâu về thành phần hóa học của quả Thảo quả tại Việt Nam còn tương đối hạn chế. Nhằm xây dựng dữ liệu khoa học thực nghiệm phục vụ việc kiểm nghiệm, tiêu chuẩn hóa và định hướng phát triển dược liệu, tác giả Lê Thị Tú Uyên đã thực hiện khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ với đề tài: "Khảo sát thành phần hóa học của quả Thảo quả (Amomum aromaticum Roxb.), họ Gừng (Zingiberaceae)". Nghiên cứu được hỗ trợ kinh phí từ Nghị định thư hợp tác song phương Việt - Hàn: "Nghiên cứu hoạt tính kháng ung thư và điều hòa miễn dịch của một số cây thuốc Việt Nam".
Mục tiêu nghiên cứu của khóa luận được xác định cụ thể gồm hai nội dung:
- Định tính các nhóm chất hóa học có trong quả Thảo quả.
- Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất từ quả Thảo quả.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:
- Đối tượng nghiên cứu: Quả của cây Thảo quả (Amomum aromaticum Roxb., họ Gừng - Zingiberaceae). Dược liệu được thu hái tại huyện Sìn Hồ, tỉnh Lai Châu vào tháng 5 năm 2020, đã được giám định tên khoa học bởi ThS. Nguyễn Văn Hiếu và ThS. Nguyễn Quỳnh Nga thuộc Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu (mẫu lưu mã số DL-12520 tại Khoa Hóa Phân tích - Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu).
- Phạm vi nghiên cứu: Thực hiện tại Bộ môn Dược học cổ truyền - Trường Đại học Dược Hà Nội và Khoa Hóa Phân tích - Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu. Phạm vi thực nghiệm tập trung vào sàng lọc 13 nhóm chất hóa thực vật thường quy, chiết phân đoạn bằng hệ dung môi có độ phân cực tăng dần và phân lập các hợp chất tinh khiết từ phân đoạn kém phân cực (n-hexan).
Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu
Nghiên cứu được xây dựng trên cơ sở phân loại học thực vật chi Amomum (thuộc phân họ Alpinioideae, họ Zingiberaceae, bộ Zingiberales, lớp Liliopsida, ngành Magnoliophyta) kết hợp tổng quan các hợp chất thiên nhiên đã được phân lập từ chi này. Theo y văn ghi nhận, chi Amomum có khoảng 150 loài, trong đó các nhóm hoạt chất chủ đạo gồm tinh dầu (giàu 1,8-cineol, bornyl acetat, camphen, pinen), khoảng 35 dẫn xuất flavonoid (thuộc các nhóm flavanon, flavonol, chalcon và flavan-3-ol), 60 hợp chất terpenoid (đặc biệt là các diterpenoid khung labdan), cùng các hợp chất diarylheptanoid mạch thẳng và mạch vòng.
Khóa luận áp dụng hệ thống phương pháp thực nghiệm hóa thực vật kinh điển kết hợp các công cụ phân tích hiện đại:
- Phương pháp định tính hóa thực vật: Đánh giá sự hiện diện của 13 nhóm chất hữu cơ trong quả Thảo quả bằng các phản ứng tạo màu và tạo tủa đặc trưng theo hướng dẫn chuẩn mực của Dược điển Việt Nam V và giáo trình thực tập dược liệu. Quá trình xử lý sơ bộ tạo 3 loại dịch chiết: dịch chiết n-hexan (thực hiện qua bình chiết Soxhlet để định tính chất béo, phytosterol, carotenoid); dịch chiết ethanol 90% (đun cách thủy để định tính flavonoid, coumarin, acid hữu cơ, acid amin); và dịch chiết nước (đun sôi để thử nghiệm tanin, đường khử, polysaccharid, alcaloid, anthranoid).
- Phương pháp chiết xuất: Áp dụng phương pháp chiết nóng hồi lưu với dung môi ethanol 70% từ bột dược liệu khô xay thô, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm trên máy cô quay chân không để thu cao tổng. Sau đó, cao toàn phần được phân tán trong nước nóng và chiết lỏng - lỏng phân bố với các dung môi hữu cơ có độ phân cực tăng dần gồm n-hexan và ethyl acetat (EtOAc), thu được các cao phân đoạn tương ứng.
- Phương pháp phân lập: Sử dụng sắc ký cột cổ điển (CC) với chất nhồi cột là silica gel pha thường (kích thước hạt 0,040 - 0,063 mm, Merck) và silica gel pha đảo (RP-18, kích thước hạt 75 µm, YMC). Quá trình rửa giải sử dụng hệ dung môi gradient n-hexan - aceton. Song song đó, sắc ký lớp mỏng (TLC) được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica gel $F_{254}$ và RP-18 $F_{254\text{s}}$ nhằm theo dõi các phân đoạn, kiểm tra độ tinh khiết và lựa chọn hệ dung môi tối ưu. Thuốc thử hiện màu bản mỏng là dung dịch acid sulfuric 10% trong cồn ethanol 96%, kết hợp quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 366 nm. Kỹ thuật kết tinh phân đoạn cũng được phối hợp sử dụng với hỗn hợp dung môi dicloromethan - methanol.
- Phương pháp xác định cấu trúc hóa học: Kết hợp đánh giá tính chất cảm quan, màu sắc, trạng thái tinh thể, so sánh giá trị $R_f$ trên sắc ký lớp mỏng đối chiếu với mẫu chuẩn, và phân tích dữ liệu quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân đa chiều bao gồm: phổ cộng hưởng từ proton ($^1\text{H-NMR}$, 600 MHz), phổ cộng hưởng từ carbon-13 ($^{13}\text{C-NMR}$, 125 MHz hoặc 150 MHz), phổ tương tác dị hạt nhân lượng tử đơn (HSQC) và phổ tương tác hiệu ứng Overhauser hạt nhân (NOESY), thực hiện trên thiết bị Bruker AM600 FT-NMR spectrometer với dung môi hòa tan mẫu là $\text{CDCl}_3$.
Nội dung chính theo từng chương
CHƯƠNG 1. Tổng quan
Chương 1 hệ thống hóa các tài liệu khoa học về chi Amomum và loài Thảo quả (Amomum aromaticum Roxb.):
- Về thực vật học và phân bố: Trình bày vị trí phân loại, mô tả chi tiết hình thái thực vật của chi Amomum và loài Thảo quả (cây thảo sống lâu năm, cao 2,5 - 3 m, thân rễ mọc ngang có đốt, quả nang màu đỏ nâu mọc thành bông 8 - 17 quả từ gốc). Tác giả tổng kết đặc điểm sinh thái đặc thù của Thảo quả: loài cây ưa bóng, ưa ẩm, chỉ trồng được dưới tán rừng nguyên sinh vùng núi cao từ 1.600 đến 2.200 m, nhiệt độ trung bình năm từ 12,8°C đến 15,3°C, lượng mưa lên tới 3.552 mm/năm và độ ẩm không khí đạt 90% đến bão hòa.
- Về thành phần hóa học: Tổng quan 166 hợp chất đã biết của chi Amomum, tập trung vào tinh dầu (29 loài đã nghiên cứu, thành phần chính gồm 1,8-cineol, bornyl acetat, camphor, linalool), 35 dẫn xuất flavonoid, 60 hợp chất terpenoid và các diarylheptanoid. Đối với quả Thảo quả, tác giả tổng hợp danh mục 56 hợp chất tự nhiên đã từng được phân lập từ các công bố quốc tế, bao gồm bảng thành phần chi tiết của tinh dầu với 39 cấu tử (trong đó 1,8-cineol chiếm 29,44%, 7-methyl-6-octen-2-yl propionat chiếm 15,30%, 2-decenal chiếm 7,75%, $\alpha$-citronellol chiếm 6,00%), cùng 12 hợp chất flavonoid, 2 sterol, 5 hợp chất phenolic, 27 hợp chất diarylheptanoid và 10 hợp chất khác.
- Về tác dụng dược lý và công dụng y học cổ truyền: Trình bày các bằng chứng dược lý thực nghiệm của Thảo quả gồm: tác dụng gây độc tế bào và kháng ung thư (cao methanol MEAS ức chế tế bào u báng Dalton DLA; tsaokoarylon gây độc tế bào phổi A549 và SK-Mel-2 với $\text{IC}{50}$ lần lượt là 4,9 và 11,4 µg/ml; tinh dầu ức chế dòng tế bào ung thư biểu mô gan HepG2 với $\text{IC}{50}$ đạt 1,80 ± 1,18 µg/ml); tác dụng kháng khuẩn phổ rộng trên các vi khuẩn Gram (+), Gram (-) và nấm (S. aureus, B. subtilis, E. coli, C. albicans); tác dụng chống oxy hóa thu dọn gốc tự do DPPH và bảo vệ oxy hóa lipoprotein tỉ trọng thấp (LDL); tác dụng lâm sàng trên bệnh nhân thiếu máu cơ tim (thử nghiệm trên 30 bệnh nhân nam dùng 3 g bột Thảo quả/ngày trong 12 tuần giúp giảm đáng kể lipid gây xơ vữa, tăng hoạt tính tiêu sợi huyết và cải thiện tình trạng chống oxy hóa toàn phần với $p < 0,05$). Tác giả cũng liệt kê các bài thuốc y học cổ truyền chữa hôi miệng, sốt rét, tỳ vị hư hàn tiêu chảy và rối loạn tiêu hóa.
CHƯƠNG 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
Chương này mô tả chi tiết toàn bộ điều kiện phương tiện, nguyên vật liệu và quy trình thao tác chuẩn:
- Nguyên vật liệu và trang thiết bị: Mẫu quả Thảo quả thu hái tại Lai Châu (tháng 5/2020), sấy khô và bảo quản đạt tiêu chuẩn. Hóa chất, dung môi công nghiệp (n-hexan, dicloromethan, methanol, ethanol, ethyl acetat, aceton) và dung môi đo phổ $\text{CDCl}_3$. Các thiết bị chính gồm: máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AM600 FT-NMR, máy cất quay chân không Buchi (R-124, R-210, R-220 Pro 20L), tủ sấy Binder và Memmert, bể siêu âm VEVOR 10L, cân phân tích Precisa XT 220A, đèn tử ngoại Vilber 254/366 nm.
- Quy trình định tính 13 nhóm chất: Hướng dẫn chi tiết kỹ thuật thực hiện phản ứng cho từng nhóm: thử nghiệm Cyanidin, phản ứng với $\text{FeCl}_3$ 5% và dung dịch kiềm (flavonoid); thử nghiệm đóng mở vòng lacton và diazo hóa (coumarin); thử nghiệm tạo bọt và phản ứng Salkowski (saponin); phản ứng với thuốc thử Mayer, Bouchardat, Dragendorff (alcaloid); phản ứng với $\text{FeCl}_3$, chì acetat 10%, gelatin 1% (tanin); phản ứng Borntraeger (anthranoid); thử nghiệm với $\text{Na}_2\text{CO}_3$ (acid hữu cơ); phản ứng Ninhydrin 3% (acid amin); phản ứng Fehling A và B (đường khử); phản ứng Lugol (polysaccharid); phản ứng tạo vết mờ trên giấy (chất béo); phản ứng với $\text{H}_2\text{SO}_4$ đặc (carotenoid); và phản ứng Liebermann (phytosterol).
- Quy trình chiết xuất và phân lập: Thiết lập sơ đồ chiết kiệt 7,0 kg dược liệu bằng ethanol 70%, kỹ thuật phân bố lỏng - lỏng thu 3 phân đoạn, kỹ thuật nhồi cột silica gel pha thường và pha đảo, quy trình nạp mẫu dạng bột khô và dạng dung dịch, cùng các bước kiểm soát bằng sắc ký lớp mỏng TLC.
CHƯƠNG 3. Thực nghiệm, kết quả và bàn luận
Chương 3 trình bày các số liệu thực nghiệm đo đạc thực tế, cấu trúc các chất phân lập và phần thảo luận chuyên môn:
- Kết quả định tính sơ bộ: Trình bày bảng tổng hợp kết quả phản ứng của 13 nhóm chất. Thực nghiệm xác định quả Thảo quả cho kết quả dương tính với 6 nhóm chất: flavonoid, đường khử tự do, acid amin, polysaccharid, chất béo và phytosterol; 7 nhóm chất còn lại cho kết quả âm tính.
| STT |
Nhóm chất thử nghiệm |
Phản ứng / Thuốc thử sử dụng |
Hiện tượng quan sát |
Kết quả |
| 1 |
Flavonoid |
Phản ứng Cyanidin, $\text{FeCl}_3$ 5%, kiềm |
Xuất hiện màu tím đỏ, tăng màu vàng |
Dương tính (+) |
| 2 |
Coumarin |
Đóng mở vòng lacton, diazo hóa |
Không đổi độ đục, không hiện màu đỏ gạch |
Âm tính (-) |
| 3 |
Saponin |
Tạo bọt bền, phản ứng Salkowski |
Bọt tan nhanh, không có vòng tím đỏ |
Âm tính (-) |
| 4 |
Alcaloid |
Thuốc thử Mayer, Bouchardat, Dragendorff |
Không xuất hiện kết tủa đặc trưng |
Âm tính (-) |
| 5 |
Tanin |
Dung dịch $\text{FeCl}_3$, chì acetat 10%, gelatin 1% |
Không đổi màu xanh đen, không tủa bông |
Âm tính (-) |
| 6 |
Anthranoid |
Phản ứng Borntraeger với KOH 10% |
Lớp kiềm không chuyển sang màu đỏ |
Âm tính (-) |
| 7 |
Acid hữu cơ |
Phản ứng với tinh thể $\text{Na}_2\text{CO}_3$ |
Không có hiện tượng sủi bọt khí |
Âm tính (-) |
| 8 |
Đường khử |
Thuốc thử Fehling A và Fehling B |
Xuất hiện kết tủa đỏ gạch $\text{Cu}_2\text{O}$ |
Dương tính (+) |
| 9 |
Acid amin |
Phản ứng nhiệt với thuốc thử Ninhydrin |
Dung dịch chuyển sang màu tím đặc trưng |
Dương tính (+) |
| 10 |
Polysaccharid |
Phản ứng với thuốc thử Lugol |
Màu dung dịch đậm hơn mẫu đối chứng |
Dương tính (+) |
| 11 |
Chất béo |
Thử nghiệm bay hơi trên giấy lọc |
Để lại vết mờ trong suốt trên giấy |
Dương tính (+) |
| 12 |
Carotenoid |
Cho tác dụng với $\text{H}_2\text{SO}_4$ đặc |
Không xuất hiện màu xanh ve |
Âm tính (-) |
| 13 |
Phytosterol |
Phản ứng Liebermann |
Xuất hiện vòng tím đỏ, lớp trên màu xanh |
Dương tính (+) |
- Kết quả chiết xuất và phân tách phân đoạn: Từ 7,0 kg dược liệu khô ban đầu, chiết hồi lưu 3 lần bằng ethanol 70% (tỷ lệ 1:6 kg/l, mỗi lần 3 giờ), thu được 841,31 g cao chiết toàn phần (AAT). Lấy 800,0 g cao AAT phân tán vào nước nóng và lắc phân bố lỏng - lỏng lần lượt với n-hexan và ethyl acetat (mỗi dung môi 3 lần, tỷ lệ thể tích 1:1), thu được 199,2 g cao phân đoạn n-hexan (AAH), 303,0 g cao phân đoạn ethyl acetat (AAE) và 323,0 g cắn nước (AAW).
| Mẫu dịch chiết / Phân đoạn |
Ký hiệu |
Khối lượng thu được (g) |
Tỷ lệ so với cao tổng đưa vào chiết (%) |
| Cao toàn phần ethanol 70% |
AAT |
841,31 |
- |
| Cao phân đoạn n-hexan |
AAH |
199,20 |
24,90% |
| Cao phân đoạn ethyl acetat |
AAE |
303,00 |
37,88% |
| Cắn phân đoạn nước |
AAW |
323,00 |
40,38% |
-
Kết quả phân lập các hợp chất từ phân đoạn n-hexan: Sử dụng 190,0 g cao n-hexan chạy sắc ký cột silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải gradient n-hexan - aceton (tỷ lệ từ 9:1 đến 1:1, v/v), thu được 13 phân đoạn ký hiệu từ H1 đến H13. Tiến hành tinh chế hai phân đoạn:
- Phân đoạn H-2 (100,0 mg) được kết tinh phân đoạn lại trong hệ dung môi dicloromethan - methanol (1:1, v/v), thu được 15,0 mg hợp chất ký hiệu TQH1.
- Phân đoạn H-4 (100,0 mg) được phân tách tiếp bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi rửa giải n-hexan - aceton (9:1, v/v), thu được 8,0 mg hợp chất ký hiệu TQH3.
- Ngoài ra, phân lập được hợp chất ký hiệu TQH2 từ phân đoạn tương ứng.
-
Kết quả xác định cấu trúc hóa học các hợp chất:
- Hợp chất TQH1: Thu được ở dạng tinh thể hình kim không màu, tan trong cloroform, không tan trong methanol, không hấp thụ tử ngoại. Trên sắc ký lớp mỏng, khi phun hiện màu bằng dung dịch $\text{H}_2\text{SO}_4$ 10% trong cồn rồi hơ nóng, vết chất chuyển từ màu hồng tươi sang xanh tím. Kết hợp đặc trưng hóa lý và đối chiếu sắc ký lớp mỏng với chất chuẩn trong 2 hệ dung môi (n-hexan : aceton 9:1 và n-hexan : ethyl acetat 6:1), TQH1 được xác định là $\beta$-sitosterol.
- Hợp chất TQH2: Tồn tại ở dạng chất vô định hình màu trắng, hiện màu từ tím hồng sang xanh tím với thuốc thử $\text{H}_2\text{SO}_4$ 10%. So sánh sắc ký lớp mỏng đối chứng với mẫu chuẩn trong 2 hệ dung môi (DCM : MeOH 9:1 và TEAF 3:2:2:2), TQH2 được xác định là daucosterol ($\beta$-sitosterol 3-O-$\beta$-D-glucopyranosid).
- Hợp chất TQH3: Thu được dưới dạng dầu màu nâu nhạt. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân đa chiều cho thấy: phổ $^1\text{H-NMR}$ xuất hiện 1 tín hiệu aldehyd tại $\delta_{\text{H}}\ 9,40$ (1H, s); 1 proton olefinic tại $\delta_{\text{H}}\ 6,65$ (1H, dd, $J = 4,8;\ 3,0\ \text{Hz}$); 1 proton oxymethin tại $\delta_{\text{H}}\ 4,05$ (1H, m); cùng các proton nhóm methin và methylen nằm ở vùng trường cao ($\delta_{\text{H}}\ 1,40 - 2,55\ \text{ppm}$). Phổ $^{13}\text{C-NMR}$ và phổ tương tác dị hạt nhân HSQC xác nhận sự có mặt của 1 carbon carbonyl aldehyd ($\delta_{\text{C}}\ 194,0$); 2 carbon olefinic ($\delta_{\text{C}}\ 144,8$ và $146,9$); 1 carbon oxymethin mang nhóm hydroxyl ($\delta_{\text{C}}\ 68,3$); 2 carbon methin ($\delta_{\text{C}}\ 37,2$ và $42,8$); và 4 carbon methylen ($\delta_{\text{C}}\ 24,7;\ 24,9;\ 31,1$ và $32,2$). Phổ tương tác không gian NOESY cho thấy tương tác rõ giữa H-1 và H-6, chứng minh hai proton này cùng hướng và hai vòng năm - sáu cạnh hợp nhất ở cấu hình cis; tương tác giữa proton aldehyd và H-3 khẳng định H-3 và nhóm -CHO nằm cùng phía của liên kết đôi. Kết hợp so sánh dữ liệu phổ thực nghiệm với tài liệu tham khảo đã công bố, TQH3 được xác định là tsaokoin.
| Vị trí carbon |
Dữ liệu phổ của TQH3 ($^1\text{H-NMR}$, 600 MHz; $^{13}\text{C-NMR}$, 150 MHz trong $\text{CDCl}_3$) |
Dữ liệu phổ tham khảo của Tsaokoin ($^1\text{H-NMR}$, 400 MHz; $^{13}\text{C-NMR}$, 125 MHz trong $\text{CDCl}_3$) |
| 1 |
$\delta_{\text{H}}\ 2,97\ (1\text{H}, \text{m});\ \delta_{\text{C}}\ 37,2$ |
$\delta_{\text{H}}\ 2,98\ (1\text{H}, \text{m});\ \delta_{\text{C}}\ 37,1$ |
| 2 |
$-\ ;\ \delta_{\text{C}}\ 144,8$ |
$-\ ;\ \delta_{\text{C}}\ 144,7$ |
| 3 |
$\delta_{\text{H}}\ 6,65\ (1\text{H}, \text{dd}, J = 4,8;\ 3,0\ \text{Hz});\ \delta_{\text{C}}\ 146,9$ |
$\delta_{\text{H}}\ 6,66\ (1\text{H}, \text{ddd}, J = 5,6;\ 2,8;\ 1,2\ \text{Hz});\ \delta_{\text{C}}\ 148,1$ |
| 4 |
$\delta_{\text{H}}\ 2,41\ (1\text{H}, \text{overlap});\ 2,52\ (1\text{H}, \text{m});\ \delta_{\text{C}}\ 31,1$ |
$\delta_{\text{H}}\ 2,38\ (1\text{H}, \text{ddt});\ 2,48\ (1\text{H}, \text{dddt});\ \delta_{\text{C}}\ 30,3$ |
| 5 |
$\delta_{\text{H}}\ 4,05\ (1\text{H}, \text{m});\ \delta_{\text{C}}\ 68,3$ |
$\delta_{\text{H}}\ 4,07\ (1\text{H}, \text{dt}, J = 9,2;\ 5,0\ \text{Hz});\ \delta_{\text{C}}\ 67,4$ |
| 6 |
$\delta_{\text{H}}\ 2,41\ (1\text{H}, \text{overlap});\ \delta_{\text{C}}\ 42,8$ |
$\delta_{\text{H}}\ 2,42\ (1\text{H}, \text{m});\ \delta_{\text{C}}\ 42,8$ |
| 7 |
$\delta_{\text{H}}\ 1,54\ (1\text{H}, \text{overlap});\ 1,78\ (1\text{H}, \text{m});\ \delta_{\text{C}}\ 24,9$ |
$\delta_{\text{H}}\ 1,54\ (1\text{H}, \text{m});\ 1,73\ (1\text{H}, \text{m});\ \delta_{\text{C}}\ 24,5$ |
| 8 |
$\delta_{\text{H}}\ 1,54\ (2\text{H}, \text{overlap});\ \delta_{\text{C}}\ 24,7$ |
$\delta_{\text{H}}\ 1,50\ (2\text{H}, \text{m});\ \delta_{\text{C}}\ 24,2$ |
| 9 |
$\delta_{\text{H}}\ 1,42\ (1\text{H}, \text{m});\ 2,11\ (1\text{H}, \text{m});\ \delta_{\text{C}}\ 32,2$ |
$\delta_{\text{H}}\ 1,40\ (1\text{H}, \text{m});\ 2,02\ (1\text{H}, \text{m});\ \delta_{\text{C}}\ 31,9$ |
| 10 |
$\delta_{\text{H}}\ 9,40\ (1\text{H}, \text{s});\ \delta_{\text{C}}\ 194,0$ |
$\delta_{\text{H}}\ 9,41\ (1\text{H}, \text{s});\ \delta_{\text{C}}\ 194,5$ |
- Phần bàn luận: Tác giả luận giải việc lựa chọn ethanol 70% làm dung môi chiết nóng giúp thu hồi tối đa các nhóm phân cực trung bình và phân cực mạnh, đồng thời là dung môi an toàn, thân thiện với môi trường phòng thí nghiệm. Thảo luận về hoạt tính của ba hợp chất phân lập: $\beta$-sitosterol đã được chứng minh có tác dụng cải thiện triệu chứng đường tiết niệu ở nam giới phì đại tuyến tiền liệt lành tính, giảm các phản ứng viêm thông qua điều hòa IL-6 và tỷ lệ cortisol/DHEA; daucosterol có tiềm năng chống ung thư tuyến tiền liệt thông qua con đường tự thực (autophagy) phụ thuộc JNK và bảo vệ tế bào thần kinh vỏ não khỏi tổn thương thiếu máu - tái tưới máu mô phỏng thông qua kích hoạt con đường tín hiệu IGF1/AKT; còn tsaokoin là hợp chất terpenoid khung indan hiếm gặp, trước đây từng được phân lập từ Amomum tsao-ko với hoạt tính ức chế sản sinh oxit nitric (NO) trên tế bào vi bọc thần kinh BV2 được kích thích bởi lipopolysaccharide.
Kết quả và đóng góp
Nghiên cứu đạt được các kết quả cụ thể dựa trên số liệu thực nghiệm:
- Xác định sơ bộ thành phần hóa thực vật của dược liệu Thảo quả thu hái tại Sìn Hồ, Lai Châu gồm 6 nhóm hợp chất: chất béo, phytosterol, flavonoid, đường khử tự do, acid amin và polysaccharid.
- Xây dựng quy trình chiết xuất thu nhận 841,31 g cao cồn tổng số từ 7,0 kg dược liệu khô và phân tách thành công thành 3 phân đoạn: cao n-hexan (199,2 g), cao ethyl acetat (303,0 g) và cắn nước (323,0 g).
- Phân lập thành công 3 hợp chất sạch từ phân đoạn n-hexan bằng phương pháp sắc ký cột cổ điển và kết tinh phân đoạn, gồm: 15,0 mg hợp chất TQH1, hợp chất TQH2 và 8,0 mg hợp chất TQH3.
- Định danh chính xác cấu trúc hóa học của cả 3 hợp chất: xác định TQH1 là $\beta$-sitosterol, TQH2 là daucosterol và TQH3 là tsaokoin dựa trên các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, HSQC, NOESY) và sắc ký đối chiếu mẫu chuẩn.
Đóng góp của nghiên cứu:
Đây là một trong những công trình thực nghiệm hóa thực vật chi tiết trên mẫu Thảo quả (Amomum aromaticum) có nguồn gốc địa lý tại tỉnh Lai Châu, Việt Nam. Kết quả đã phân lập và xác định được cấu trúc của tsaokoin - một monoterpenoid/sesquiterpenoid có khung cấu trúc indan đặc thù, cùng hai hợp chất phytosterol phổ biến là $\beta$-sitosterol và daucosterol. Công trình cung cấp bộ dữ liệu phổ NMR thực nghiệm chi tiết, góp phần bổ sung dẫn liệu khoa học về thành phần hóa học của chi Amomum tại Việt Nam, làm tiền đề cho công tác chuẩn hóa dược liệu và các nghiên cứu sàng lọc hoạt tính sinh học tiếp theo.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
Hạn chế của nghiên cứu:
- Do giới hạn về thời gian và khuôn khổ của một khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, nghiên cứu mới chỉ tập trung phân lập các hợp chất từ phân đoạn kém phân cực là cao n-hexan; các phân đoạn có khối lượng lớn hơn là ethyl acetat (303,0 g) và cắn nước (323,0 g) chưa được triển khai phân tách.
- Nghiên cứu dừng lại ở mức độ khảo sát hóa học (chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc), chưa tiến hành thử nghiệm hoạt tính sinh học thực nghiệm trực tiếp (như kháng viêm, kháng tế bào ung thư hoặc kháng khuẩn) trên các hợp chất tinh khiết đã thu nhận được từ mẫu thực vật nghiên cứu.
Hướng nghiên cứu tiếp theo (theo đề xuất của tác giả):
- Tiếp tục thực hiện phân lập các hợp chất tinh khiết từ các phân đoạn còn lại của cao n-hexan, phân đoạn ethyl acetat và phân đoạn cắn nước của quả Thảo quả.
- Mở rộng khảo sát hoạt tính dược lý trên các phân đoạn cao chiết và các đơn chất phân lập được để làm sáng tỏ cơ sở khoa học cho các ứng dụng dân gian của loài dược liệu này.
Giá trị tham khảo
Khóa luận là nguồn tài liệu tham khảo hữu ích cho:
- Sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu chuyên ngành Dược học, Dược liệu học, Hóa học các hợp chất thiên nhiên và Thực vật học đang thực hiện các đề tài liên quan đến chi Amomum, họ Gừng (Zingiberaceae) hoặc các loài cây thuốc vùng Tây Bắc.
- Cán bộ kỹ thuật phòng kiểm nghiệm dược liệu cần tham khảo quy trình định tính hệ thống 13 nhóm chất hữu cơ bằng phản ứng hóa học ống nghiệm theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam V.
- Các nhà nghiên cứu hóa thực vật cần tài liệu tham khảo về quy trình phân bố phân đoạn dung môi, điều kiện chạy sắc ký cột silica gel pha thường gradient (n-hexan : aceton), hệ dung môi triển khai sắc ký lớp mỏng (TLC), và đặc biệt là bộ dữ liệu giải phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, HSQC, NOESY) dùng để định danh hợp chất tsaokoin và các dẫn xuất phytosterol.
Câu hỏi thường gặp
1. Mẫu dược liệu Thảo quả nghiên cứu trong khóa luận được thu thập ở đâu và cơ quan nào giám định tên khoa học?
Mẫu nghiên cứu là quả của cây Thảo quả (Amomum aromaticum Roxb., họ Gừng - Zingiberaceae), được thu hái tại huyện Sìn Hồ, tỉnh Lai Châu vào tháng 5 năm 2020. Tên khoa học của mẫu được giám định bởi ThS. Nguyễn Văn Hiếu và ThS. Nguyễn Quỳnh Nga thuộc Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu, mang mã số mẫu lưu là DL-12520 và được lưu giữ tại Khoa Hóa Phân tích - Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu.
2. Kết quả định tính 13 nhóm chất bằng phản ứng hóa học cho thấy quả Thảo quả chứa những nhóm hoạt chất nào?
Thực nghiệm định tính sơ bộ bằng các phản ứng màu và phản ứng tạo tủa đặc trưng cho thấy quả Thảo quả có 6 nhóm chất dương tính gồm: flavonoid, đường khử tự do, acid amin, polysaccharid, chất béo và phytosterol. Ngược lại, 7 nhóm chất cho phản ứng âm tính là coumarin, saponin, alcaloid, tanin, anthranoid, acid hữu cơ và carotenoid.
3. Khối lượng cao toàn phần và các cao phân đoạn thu được từ dược liệu là bao nhiêu?
Từ 7,0 kg quả Thảo quả khô xay thô, chiết hồi lưu bằng ethanol 70% thu được 841,31 g cao cồn toàn phần. Khi tiến hành phân tán 800,0 g cao toàn phần vào nước nóng và chiết lỏng - lỏng phân đoạn với các dung môi hữu cơ, tác giả thu được 199,2 g cao phân đoạn n-hexan; 303,0 g cao phân đoạn ethyl acetat; và 323,0 g cắn phân đoạn nước.
4. Ba hợp chất phân lập được từ cao n-hexan của quả Thảo quả là những chất nào?
Ba hợp chất được phân lập tinh khiết từ cao phân đoạn n-hexan gồm có:
- Hợp chất TQH1 (15,0 mg): được định danh là $\beta$-sitosterol.
- Hợp chất TQH2: được định danh là daucosterol ($\beta$-sitosterol 3-O-$\beta$-D-glucopyranosid).
- Hợp chất TQH3 (8,0 mg): được định danh là tsaokoin.
5. Những tín hiệu phổ NMR nào là căn cứ then chốt để xác định cấu trúc của hợp chất tsaokoin (TQH3)?
Cấu trúc của tsaokoin (TQH3) được xác định dựa trên tín hiệu của 1 nhóm aldehyd ở $\delta_{\text{H}}\ 9,40$ (1H, s) và $\delta_{\text{C}}\ 194,0$; liên kết đôi olefinic tại $\delta_{\text{H}}\ 6,65$ cùng 2 carbon olefinic $\delta_{\text{C}}\ 144,8$ và $146,9$; 1 nhóm oxymethin tại $\delta_{\text{H}}\ 4,05$ và $\delta_{\text{C}}\ 68,3$; cùng 2 nhóm methin và 4 nhóm methylen. Đặc biệt, phổ tương tác không gian NOESY thể hiện tương tác giữa proton H-1 và H-6 chứng minh hai vòng 5 cạnh và 6 cạnh hợp nhất với nhau theo cấu hình cis, và tương tác giữa proton aldehyd với H-3 chỉ ra nhóm aldehyd và H-3 cùng nằm về một phía của liên kết đôi.
Kết luận
Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Lê Thị Tú Uyên đã hoàn thành đầy đủ hai mục tiêu nghiên cứu đề ra thông qua việc sàng lọc hệ thống thành phần hóa thực vật và chiết xuất, phân lập hợp chất từ quả Thảo quả (Amomum aromaticum Roxb.) thu hái tại Lai Châu. Bằng kỹ thuật sắc ký cột silica gel trên phân đoạn n-hexan, tác giả đã phân lập thành công ba hợp chất tinh khiết gồm $\beta$-sitosterol (15,0 mg), daucosterol và tsaokoin (8,0 mg). Cấu trúc của các hợp chất đã được làm sáng tỏ và chứng minh chặt chẽ thông qua phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân đa chiều ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, HSQC, NOESY) kết hợp sắc ký đối chiếu chất chuẩn. Đây là công trình thực nghiệm nghiêm túc, cung cấp các bằng chứng khoa học có giá trị phục vụ cho công tác kiểm nghiệm, nghiên cứu hóa thực vật và định hướng khai thác nguồn tài nguyên cây thuốc tại Việt Nam.
