ĐẶT VẤN ĐỀ Tại Việt Nam, theo thống kê của Globocan 2012, ung thư vòm họng (UTVH) được xếp là một trong năm loại ung thư phổ biến ở nam giới. Ung thư vòm họng là một khối u biểu mô của khoang mũi - họng, hiếm gặp ở hầu hết các khu vực trên thế giới, với tỷ lệ mắc bệnh hằng năm, trên toàn cầu ít hơn 1/100,000 người. Tuy nhiên, UTVH lại phổ biến ở khu vực phía Nam Trung Quốc, Nam Á với tỷ lệ mắc bệnh hằng năm là 30 - 50 người trên 100,000 người. Hiện nay, trên thế giới có nhiều công trình nghiên cứu cho thấy sự phát triển của UTVH là một quá trình gồm nhiều giai đoạn, liên quan đến nhiều yếu tố như sự xâm nhiễm của virus Epstein - Barr, các yếu tố môi trường và di truyền.
Các công trình nghiên cứu chủ yếu tiếp cận hướng phân tích sự methyl hóa bất thường ở vùng promoter của các gen ức chế khối u như p16Ink4a, Rb, RBSP3, Blu, RASSF1A và sử dụng nó như một dấu chứng sinh học cho việc chẩn đoán UTVH. Đã có rất nhiều công trình nghiên cứu phân tích sự methyl hóa bất thường tại vùng promoter của gen RASSF1A trong UTVH. Một số công trình nghiên cứu tiêu biểu như Kwok- Wai Lo và cộng sự (2001), Fendri A. và cộng sự (2009), Nawaz I.
và cộng sự (2015), … Qua các nghiên cứu tiêu biểu này, cho thấy tần số methyl hóa của gen RASSF1A khá cao trong UTVH. Sự methyl hóa ở vùng promoter đóng một vai trò thiết yếu trong việc làm mất chức năng của các gen ức chế khối u. Đáng chú ý, sự mất biểu hiện hoặc sự biểu hiện bất thường của gen RASSF1A có liên quan đến sự methyl hóa bất thường tại đảo CpG thuộc vùng promoter và có liên quan đến sinh bệnh học của nhiều loại ung thư, bao gồm ung thư vòm họng, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư phổi không tế bào nhỏ, ung thư vú và các ung thư khác. Trong tế bào bình thường, gen RASSF1A là một gen ức chế khối u, nó mã hóa tạo ra protein RASSF1A, có khả năng điều chỉnh một loạt các chức năng sinh học quan trọng trong tế bào như điều hòa các vi ống, duy trì sự ổn định của bộ gen, kiểm soát chu kì tế bào và điều hòa apoptosis, … Theo Wang T.
(2009), qua nghiên cứu in vitro cho thấy RASSF1A có thể ức chế sự hình thành khối u thông qua sự NGUYỄN THỊ HƯƠNG Trang x KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ngưng chu kì tế bào ở pha G0/G1 và gây ra apoptosis theo con đường phụ thuộc Ras. Tuy nhiên, ở các tế bào ung thư, gen RASSF1A bị methyl hóa vượt mức tại đảo CpG thuộc vùng promoter, làm quá trình phiên mã của gen RASSF1A im lặng, dẫn đến RASSF1A không được tạo thành và làm mất chức năng điều hòa các con đường tín hiệu, tăng sinh của tế bào và dẫn đến sự tạo u. Do đó, tính trạng methyl hóa của gen RASSF1A được xem là một dấu chứng sinh học rất hữu ích cho chẩn đoán sớm và tiên lượng UTVH đầy tiềm năng. Thế nhưng, ở Việt Nam, chưa có công trình nghiên cứu tiêu biểu nào liên quan đến việc sử dụng sự methyl hóa bất thường tại đảo CpG thuộc vùng promoter của gen RASSF1A vào trong chẩn đoán sớm ung thư vòm họng.
Vì vậy, chuyên đề khóa luận tốt nghiệp được thực hiện với tên đề tài: “Khảo sát sự methyl hóa tại đảo CpG thuộc vùng promoter của gen RASSF1A bằng phương pháp MSP trong mẫu bệnh ung thư biểu mô vòm họng ở người Việt Nam”. Kết quả đề tài sẽ cung cấp cơ sở lý thuyết khoa học trên cả in silico và thực nghiệm về đặc điểm đảo CpG và vùng promoter của gen RASSF1A, vị trí bắt cặp tốt nhất cho các cặp mồi dùng cho phản ứng MSP, xây dựng quy trình MSP. Đặc biệt là xác định tần số methyl hóa của gen RASSF1A trong các mẫu bệnh phẩm UTVH ở Việt Nam. Đóng góp của đề tài sẽ là bước khởi đầu cho một nghiên cứu lớn, nhằm tìm ra dấu chứng sinh học tiềm năng cho chẩn đoán sớm và tiên lượng bệnh UTVH ở Việt Nam.
Trong giới hạn của đề tài, nghiên cứu tập trung thực hiện những mục tiêu chính sau: − Khảo sát in silico, thu nhận vùng promoter của gen RASSF1A và xác định được các vị trí CpG “hot spot” mà sự methyl hóa tại các vị trí này sẽ ảnh hưởng đến quá trình phiên mã của gen RASSF1A. − Kế thừa và đánh giá lại cặp mồi methyl và unmethyl đặc hiệu cho phản ứng MSP giúp đánh giá mức độ methyl hóa tại các vị trí CpG thuộc vùng promoter gen RASSF1A. − Xây dựng quy trình tách chiết DNA từ mẫu mô bệnh UTVH và quy trình MSP để đánh giá mức độ methyl hóa gen RASSF1A trên các mẫu bệnh UTVH ở Việt Nam. NGUYỄN THỊ HƯƠNG Trang xi KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 1 TỔNG QUAN.1 TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ VÒM HỌNG.1 Giải phẫu vòm họng Họng là ngã tư của đường ăn và đường thở, nối liền với mũi ở phía trên, với miệng ở phía trước, với thanh quản và thực quản ở phía dưới [58].
Họng được chia làm 3 phần: họng mũi (vòm mũi họng) - mũi hầu, miệng hầu, hạ hầu. Họng mũi là phần cao nhất của họng hầu, ở sau dưới của hai lỗ mũi sau. Thành sau họng mũi hợp với thành trên và hai thành bên làm thành hình vòm. Phía dưới của họng - mũi được thở thông với họng – miệng [58].
Cấu tạo họng [61].2 Định nghĩa, triệu chứng, phân loại ung thư vòm họng 1.1 Định nghĩa, triệu chứng Ung thư vòm họng (UTVH) là một khối u biểu mô ác tính, khởi phát từ niêm mạc của khoang mũi họng [8, 53]. Những bệnh nhân ở giai đoạn đầu của bệnh thường không có triệu chứng bị bệnh hoặc xuất hiện với các triệu chứng bình thường [8]. Triệu chứng phổ biến nhất trong ung thư vòm họng là hạch cổ (neck lump). Ngoài ra, UTVH còn có các triệu chứng ở mũi như: đờm có lẫn máu, ngạt mũi, chảy dịch mũi và những triệu chứng ở tai như ù tai, viêm tai, mất khả năng nghe.
Đồng thời, thường xuyên đau đầu [35]. NGUYỄN THỊ HƯƠNG Trang 1 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Hố Rosenmuller của vòm họng và vòi Eustachian là vị trí khởi đầu phổ biến nhất của ung thư vòm họng [8, 35]. UTVH thường lan truyền bằng mạch bạch huyết đến các hạch bạch huyết ở cổ. UTVH có thể lan truyền thông qua đường máu để đến những vị trí xa như xương, phổi và gan [8].2 Phân loại ung thư vòm họng.
Ung thư vòm họng là một loại ung thư đặc biệt của ung thư cổ và đầu [35]. Năm 1978, Tổ chức Y Tế Thế Giới (WHO) đã đưa ra sự phân loại dựa vào mô bệnh học, phân chia ung thư vòm họng thành 3 loại. Loại I là ung thư biểu mô tế bào vảy hóa sừng (keratinizing squamous cell carcinoma). Loại II là ung thư biểu mô không hóa sừng (nonkeratinizing carcinoma) và loại III là ung thư biểu mô không biệt hóa (undifferentiated carcinoma) [9, 12, 35].
UTVH có khác biệt rõ ràng về sự phân bố địa lý và theo dân tộc [35]. UTVH phân bố ở hầu hết các khu vực trên thế giới, nhưng phổ biến nhiều ở các khu vực như Đông Nam Á, các nước Bắc Phi (Algeria, Morocco và Tunisia) và vùng phía Bắc của Bắc Mỹ và Greenland (Đan Mạch) [7, 53]. Ở Đông Nam Á, dân cư gồm nhiều loại khác nhau và có nguy cơ mắc bệnh UTVH khác nhau. Giống như các nước khác trong khu vực Đông Nam Á, Trung Quốc là nước có nhiều loại người chung sống với nhau như người Hokkien và nhiều loại người khác của Trung Quốc có nguồn gốc từ tỉnh Fujian.
Những vùng đặc hữu như phía Nam Trung Quốc, theo thống kê của WHO, UTVH loại III chiếm hơn 97% [35]. Tỉnh Quảng Đông có nguy cơ mắc UTVH cao gấp 2 lần so với các tỉnh khác ở Trung Quốc và các nước khác. So với Trung Quốc, các nước như Thái Lan, Việt Nam, Malaysia và Philippin cũng được biết là các nước có nguy cơ mắc UTVH ở mức trung bình đến mức cao, có khoảng biến thiên của xuất độ chuẩn hóa theo tuổi (ASR) từ 2,5 đến 15 đối với nam giới [7]. NGUYỄN THỊ HƯƠNG Trang 2 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 1.3 Tình trạng ung thu vòm họng trên thế giới và ở Việt Nam Theo thống kê của Globocan năm 2012, trên toàn thế giới, ung thư vòm họng có 86691 trường hợp mắc bệnh, chiếm 0,6% và xuất độ chuẩn hóa theo tuổi là 1,2.
Tỷ lệ tử vong là 50831 trường hợp, chiếm 0,6% và ASR là 0,7. Ước tính đến năm 2017, số ca mắc bệnh tăng lên tới 228698 ca ở cả nam và nữ trên toàn thế giới, chiếm 0,7%. Tại Việt Nam, UTVH được xếp là một trong năm loại ung thư phổ biến ở nam giới theo thống kê của Globocan 2012. Trong đó, số ca mắc bệnh là 3301 ca, chiếm 4,7%, có chỉ số ASR 7,7 và có 1931 ca tử vong, chiếm 3,3%, có ASR là 4,8.
Ở nữ giới, số ca tử vong là 954 ca, chiếm 2,7% và có ASR là 2. Có 1630 trường hợp mắc bệnh, chiếm 3% và ASR là 3,4.4 Nguyên nhân gây ung thư vòm họng Sự phát triển của UTVH là một quá trình gồm nhiều giai đoạn, liên quan đến nhiều yếu tố gây bệnh, trong đó có 3 yếu tố chính: yếu tố môi trường, sự xâm nhiễm của Epstein – Barr virus, di truyền [9, 12, 35, 50].1 Yếu tố môi trường Nhiều nghiên cứu cho thấy, ở Trung Quốc, Greenland và Tunisia, điều kiện kinh tế xã hội thấp (nơi ở đông đúc, thiếu sự thông khí, vệ sinh kém, lối sống) có sự liên kết với bệnh UTVH [9]. Đáng chú ý nhất là lối sống, việc sử dụng cá muối và các thực phẩm truyền thống bảo quản lâu ngày có chứa hợp chất N-nitrosamine - một yếu tố gây UTVH chủ yếu [9, 35]. Ở Việt Nam, đặc biệt ở các vùng có thói quen sử dụng nhiều cá muối, cá khô, tương và các thực phẩm muối chua lâu ngày (nhất là miền Nam) đều có nguy cơ mắc UTVH cao, do các loại thực phẩm này chứa nhiều hợp chất N-nitrosamine – chất gây ung thư.
Hơn nữa, độ tuổi sử dụng cá muối, cách chế biến và loại cá sử dụng là những yếu tố quan trọng liên quan đến nguy cơ mắc UTVH [35]. NGUYỄN THỊ HƯƠNG Trang 3 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Qua thử nghiệm cho thấy việc sự dụng cá muối ở giai đoạn thiếu nhi làm tăng nguy cơ bị UTVH ở Nam Trung Quốc, trong khi sự tiêu thụ cá muối ở giai đoạn người trưởng thành thì không tăng nguy cơ bị UTVH [9, 35].