Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Ung thư vú là một trong những bệnh lý ác tính phổ biến nhất và là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu do ung thư ở phụ nữ trên toàn cầu. Theo số liệu của Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Thế giới (IARC) năm 2008, thế giới ghi nhận khoảng 1.380.000 trường hợp mắc mới (chiếm 23% tổng số các ca ung thư) và là nguyên nhân gây tử vong đứng thứ năm trong các bệnh ung thư. Tại Việt Nam, ung thư vú có tần suất mắc cao nhất ở phụ nữ tại Hà Nội và đứng thứ hai sau ung thư cổ tử cung tại Thành phố Hồ Chí Minh; ước tính toàn quốc năm 2008 có 6.830 ca mắc mới (chiếm 15,6% các ca ung thư ở nữ giới) cùng 2.423 ca tử vong. Bệnh thường tiến triển âm thầm, phần lớn chỉ được phát hiện ở giai đoạn muộn khi khối u đã xâm lấn, làm giảm hiệu quả điều trị. Do đó, việc tìm kiếm các dấu chứng sinh học phân tử (biomarkers) phục vụ tầm soát và chẩn đoán sớm có ý nghĩa quyết định đối với việc nâng cao tiên lượng sống cho bệnh nhân.

Bên cạnh các đột biến di truyền, cơ chế biến đổi biểu sinh (epigenetics) đóng vai trò then chốt trong quá trình sinh ung thư. Trong đó, hiện tượng methyl hóa quá mức (hypermethylation) các đảo CpG tại vùng promoter của các gen ức chế khối u (tumor suppressor genes) dẫn đến việc bất hoạt chức năng gen mà không làm thay đổi trình tự nucleotide. Gen RASSF1A (Ras association domain family 1 isoform A) là gen ức chế khối u quan trọng, thường xuyên bị methyl hóa bất thường ngay từ các giai đoạn sớm của ung thư vú. Xuất phát từ cơ sở khoa học này, đề tài được triển khai nhằm khảo sát tình trạng methyl hóa vùng promoter gen RASSF1A trên các mẫu mô bệnh phẩm ung thư vú tại Việt Nam.

Nhiệm vụ nghiên cứu của khóa luận được xác định cụ thể qua ba mục tiêu chính:

  1. Thiết kế các cặp mồi đặc hiệu phục vụ rà soát sự methyl hóa trên các vùng promoter của gen RASSF1A.
  2. Xây dựng và tối ưu hóa quy trình thực nghiệm kỹ thuật Methylation-Specific PCR (MSP) dựa trên các cặp mồi đã thiết kế cho gen RASSF1A.
  3. Phân tích tình trạng methyl hóa ở vùng promoter của gen RASSF1A trên các mẫu bệnh phẩm thu nhận từ bệnh nhân ung thư vú.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Mức độ methyl hóa tại các đảo CpG thuộc vùng promoter của gen RASSF1A.
  • Phạm vi vật liệu và không gian: 27 mẫu mô vú cố định đúc trong paraffin (FFPE) từ các bệnh nhân ung thư vú được phẫu thuật cắt bỏ khối u tại Bệnh viện Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh (Bộ môn Giải phẫu bệnh); các thí nghiệm sinh học phân tử được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử, Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh.
  • Phạm vi thời gian: Đề tài thu nhận mẫu và tiến hành nghiên cứu thực nghiệm từ năm 2010 đến tháng 07 năm 2011.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận dựa trên nền tảng lý thuyết về cơ chế biểu sinh (epigenetics) và vai trò ức chế khối u của gen RASSF1A. Về mặt sinh học phân tử, hiện tượng methyl hóa DNA ở người xảy ra chủ yếu thông qua việc gắn nhóm methyl (-CH3) vào vị trí C5 của cytosine đứng trước guanine trong các cặp dinucleotide CpG nhờ hệ enzyme DNA methyltransferase (DNMT1 đóng vai trò duy trì sự methyl hóa; DNMT3A và DNMT3B thực hiện methyl hóa mới de novo), sử dụng S-adenosylmethionine (SAM) làm chất cung cấp gốc methyl. Biến đổi này phối hợp cùng các biến đổi histone (như sự deacetyl hóa do HDACs xúc tác) làm cuộn xoắn chất nhiễm sắc, ngăn cản các yếu tố phiên mã tiếp cận promoter và làm tắt biểu hiện gen. Gen RASSF1A định vị tại dải 3p21.3 trên nhiễm sắc thể số 3 của người, có kích thước khoảng 18 kb gồm 8 exon và 7 intron, mã hóa chuỗi polypeptide 340 amino acid (trọng lượng phân tử 38,8 kDa). Protein RASSF1A liên kết với các sợi thoi vô sắc ở kỳ trung gian và phân bào, tương tác với protein Rb kìm hãm cyclin D1 (chặn chu trình tế bào ở pha G1/S), gắn với Cdc20 điều hòa phức hợp APC, đồng thời kết hợp với các kinase MST1/MST2 và NORE1A kích hoạt quá trình tự chết của tế bào (apoptosis) theo con đường phụ thuộc Ras.

Phương pháp nghiên cứu kết hợp giữa công cụ tin sinh học (in silico) và thực nghiệm sinh học phân tử (in vitro):

  • Phương pháp phân tích in silico: Khai thác trình tự gen RASSF1A từ cơ sở dữ liệu GenBank (NCBI, mã số truy cập NC_000003); sử dụng công cụ MethPrimer để định vị các đảo CpG và thiết kế mồi MSP; dùng chương trình TFSEARCH (với ngưỡng điểm 76,0) nhận diện vị trí gắn của các nhân tố điều hòa phiên mã; kiểm tra tính đặc hiệu của mồi bằng MethBLAST; phân tích vị trí bắt cặp bổ sung bằng phần mềm Annhyb 4.944; khảo sát các thông số vật lý của mồi (nhiệt độ nóng chảy Tm, tỷ lệ %GC) và cấu trúc thứ cấp (hairpin loop, homo dimer, hetero dimer thông qua biến đổi năng lượng tự do ΔG) bằng phần mềm IDT SciTools OligoAnalyzer.
  • Phương pháp thực nghiệm in vitro:
    • Xử lý loại bỏ sáp paraffin của 27 mẫu mô bệnh phẩm bằng dung môi hữu cơ xylene và rửa lại bằng ethanol 100%.
    • Tách chiết DNA tổng số theo phương pháp biến tính màng và chiết tách phenol/chloroform, sau đó tủa DNA bằng dung dịch NH4OAc 5M cùng ethanol tuyệt đối lạnh ở -20°C.
    • Định lượng nồng độ và đánh giá độ tinh sạch của DNA thông qua phép đo quang phổ hấp thụ UV ở bước sóng 260 nm và tỷ số A260/A280.
    • Kiểm tra tính toàn vẹn của DNA tách chiết bằng phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen chứng nội tại DcR1 có kích thước 127 bp (theo cặp mồi mô tả bởi Lê và cộng sự, 2010).
    • Xử lý biến đổi hóa học DNA bằng sodium bisulfite thông qua bộ kít thương mại EpiTect Bisulfite Kit (Qiagen, Cat. No. 59104) để chuyển đổi toàn bộ cytosine không methyl hóa thành uracil trong khi vẫn giữ nguyên các 5-methylcytosine.
    • Khuếch đại đặc hiệu phân đoạn promoter bằng kỹ thuật MSP (Methylation-Specific PCR) sử dụng các cặp mồi WT1 (đặc hiệu methyl) và WT2 (đặc hiệu unmethyl).
    • Phân tích sản phẩm khuếch đại bằng điện di trên gel agarose trong đệm TAE 1X, nhuộm ethidium bromide (10 mg/ml) và quan sát hình ảnh dưới bàn đèn tia cực tím (UV) ở bước sóng 312 nm cùng thang chuẩn DNA 100 bp.

Nội dung chính theo từng chương

Phần I: Tổng quan

Chương Tổng quan hệ thống hóa các vấn đề bệnh học ung thư vú, cơ chế biểu sinh và gen mục tiêu. Tác giả trình bày bức tranh dịch tễ học toàn cầu và tại Việt Nam dựa trên dữ liệu của IARC và Globocan (2008); phân tích các yếu tố nguy cơ (kinh nguyệt sớm, mãn kinh muộn, bức xạ, đột biến di truyền) và hệ thống phân loại TNM (giai đoạn 0 đến 4). Nội dung tiếp theo giải thích bản chất hiện tượng methyl hóa DNA, sự phân bố các đảo CpG ở vùng 5' đầu gen, vai trò của hệ enzyme DNMTs cùng sự phối hợp giữa methyl hóa DNA và biến đổi histone trong việc bất hoạt biểu hiện gen ức chế khối u.

Về đối tượng gen nghiên cứu, chương này mô tả chi tiết vị trí 3p21.3, cấu trúc 8 exon và các con đường sinh học mà protein RASSF1A tham gia (điều hòa thoi phân bào, kìm hãm tích lũy cyclin D1 ở pha G1/S, liên kết phức hợp Cdc20-APC và tương tác NORE1A/MST1 để kích hoạt apoptosis). Tổng hợp các công trình trước đó (Lehmann et al., 2002; Fackler et al., 2003; Rykova et al., 2004; cơ sở dữ liệu Pubmeth) chỉ ra rằng tần số methyl hóa promoter gen RASSF1A trong ung thư vú dao động từ 60% đến 80% (trung bình 72%), chứng minh đây là biến cố xảy ra sớm và là dấu chứng sinh học phân tử tiềm năng. Cuối chương, tác giả so sánh nguyên lý chuyển đổi bisulfite cùng ba kỹ thuật phát hiện methyl hóa phổ biến: MSP, Q-MSP (Real-time MSP) và BSP (Bisulfite Sequencing PCR).

Phần II: Vật liệu và phương pháp

Chương này trình bày chi tiết các nguyên liệu sinh học, hóa chất, phần mềm và quy trình thực nghiệm. Nguồn mẫu gồm 27 khối mô vú đúc paraffin được bảo quản ở -30°C và DNA chứng chuẩn từ Qiagen. Quy trình in silico được mô tả theo từng bước thu nhận chuỗi NC_000003, xác định đảo CpG qua MethPrimer, sàng lọc vị trí gắn yếu tố phiên mã qua TFSEARCH và đánh giá độ bền liên kết thứ cấp (ΔG) của mồi trên IDT.

Quy trình thực nghiệm được chuẩn hóa qua 5 giai đoạn liên tiếp: (1) Tách chiết DNA bằng xylene và phenol/chloroform; (2) Đo quang phổ UV xác định nồng độ và tỷ số A260/A280; (3) PCR kiểm tra chất lượng DNA với cặp mồi DcR1 (thành phần 15 µl, 40 chu kỳ, ủ ở 66°C trong 30 giây, kéo dài ở 72°C); (4) Biến đổi sodium bisulfite bằng kít EpiTect Bisulfite theo chu trình biến tính và ủ nhiệt kéo dài (95°C và 60°C qua các khoảng thời gian 5, 25, 85 và 175 phút); (5) Phản ứng MSP với cặp mồi methyl hóa WT1 (nhiệt độ bắt cặp 55°C) và unmethyl WT2 (nhiệt độ bắt cặp 53°C) trong 40 chu kỳ, sau đó điện di trên gel agarose để đọc kết quả.

Phần III: Kết quả và thảo luận

Chương Kết quả và thảo luận trình bày dữ liệu từ hai khâu nghiên cứu:

  • Kết quả phân tích in silico: Phân tích chuỗi promoter và 5'UTR của gen RASSF1A cho thấy sự hiện diện của hai đảo CpG riêng biệt: đảo thứ nhất dài 133 bp nằm hoàn toàn trong promoter; đảo thứ hai dài 636 bp kéo dài từ promoter qua exon 1 (bao gồm 89 bp promoter trước điểm bắt đầu phiên mã và 132 bp vùng 5'UTR). Công cụ TFSEARCH nhận diện nhiều vị trí gắn của các nhân tố phiên mã quan trọng như Sp1, MZF1, p300, AML-1a, Elk-1, GATA-2, CREB, Max, CDP CR, c-Myc và E2F. Tác giả chọn vùng từ nucleotide -77 đến +130 để thiết kế mồi do tập trung mật độ cao dinucleotide CpG và cytosine tự do. Kết quả thiết kế thu được cặp mồi methyl WT1 (sản phẩm 192 bp) và mồi unmethyl WT2 (sản phẩm 203 bp). Khảo sát cấu trúc thứ cấp trên IDT ghi nhận mồi xuôi Ra-M-F có ΔG homo dimer là -10,36 kcal/mol và cặp unmethyl có ΔG hetero dimer là -11,37 kcal/mol (thấp hơn ngưỡng khuyến cáo -9 kcal/mol của IDT), cho thấy mồi chưa tối ưu tuyệt đối về mặt lý thuyết nhưng kiểm tra MethBLAST khẳng định tính đặc hiệu hoàn toàn với trình tự cosmid LUCA12 vùng 3p21.3 của người.
  • Kết quả thực nghiệm:
    • Đo quang phổ 27 mẫu DNA sau tách chiết ghi nhận nồng độ dao động từ 71,10 ng/µl (mẫu Fx 10) đến 2041,2 ng/µl (mẫu Fx 22); tỷ số A260/A280 dao động trong khoảng 1,56 đến 1,89 (đa số đạt 1,65 - 1,76), đáp ứng yêu cầu biến đổi bisulfite.
    • Phản ứng PCR với gen chứng DcR1 đều khuếch đại thành công phân đoạn 127 bp, xác nhận DNA tách chiết từ mô sáp không bị phân hủy quá mức và có thể sử dụng làm khuôn.
    • Phản ứng MSP với cặp mồi methyl WT1 khuếch đại phân đoạn đặc hiệu kích thước 192 bp. Kết quả thống kê trên 27 mẫu bệnh phẩm xác định có 18 mẫu dương tính với methyl hóa và 9 mẫu âm tính. Tỷ lệ methyl hóa vùng promoter gen RASSF1A trong nghiên cứu đạt 66,7% (18/27 mẫu).
    • Thảo luận: Tỷ lệ 66,7% nằm trong biên độ thống kê chung của Pubmeth (60-80%), song thấp hơn kết quả của Shinozaki và cộng sự (2006) là 81% hay Fackler và cộng sự (2003) là 76%. Tác giả giải thích nguyên nhân có thể do cỡ mẫu nghiên cứu còn nhỏ (n = 27) và đặc điểm bệnh nhân tại Việt Nam chủ yếu được thu nhận ở giai đoạn trễ khi khối u đã xâm lấn mạnh.

Phần IV: Kết luận và đề nghị

Tác giả đúc kết các mục tiêu đã hoàn thành bao gồm: định vị thành công vùng promoter và các đảo CpG của gen RASSF1A; thiết kế các bộ mồi MSP đặc hiệu; chuẩn hóa quy trình thực nghiệm MSP từ mô đúc paraffin; và ghi nhận tỷ lệ methyl hóa bước đầu đạt 66,7% trên 27 mẫu bệnh phẩm. Đề tài đưa ra hai kiến nghị cụ thể: mở rộng quy mô nghiên cứu trên số lượng mẫu lớn hơn để nâng cao độ tin cậy thống kê; và ứng dụng kỹ thuật giải trình tự bisulfite (Bisulfite Sequencing PCR - BSP) để thẩm định độ đặc hiệu của các sản phẩm khuếch đại MSP.

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đã cung cấp các thông số kỹ thuật và số liệu thực nghiệm định lượng chi tiết về gen RASSF1A trong bệnh phẩm ung thư vú tại Việt Nam:

Nhóm thông số Dữ liệu và kết quả chi tiết trích xuất từ văn bản
Đặc điểm đảo CpG (in silico) Đảo CpG 1: kích thước 133 bp (nằm hoàn toàn trong promoter); Đảo CpG 2: kích thước 636 bp (kéo dài từ promoter đến exon 1, chứa 89 bp promoter trước TSS và 132 bp 5'UTR). Vùng chọn thiết kế mồi: từ nucleotide -77 đến +130.
Cặp mồi methyl hóa WT1 Mồi xuôi Ra-M-F: 5'-CGAGAGCGCGTTTAGTTTCGTT-3' (22 bp, Tm = 58,0°C, %GC = 50,0%).
Mồi ngược Ra-M-R: 5'-CGATTAAACCCGTACTTCGCTAA-3' (23 bp, Tm = 54,8°C, %GC = 43,5%).
Kích thước sản phẩm khuếch đại: 192 bp.
Cặp mồi không methyl hóa WT2 Mồi xuôi Ra-U-F: 5'-GGGGTTTTGTGAGAGTGTGTTT-3' (22 bp, Tm = 55,7°C, %GC = 45,5%).
Mồi ngược Ra-U-R: 5'-TCACCAACAACAAAACCACA-3' (20 bp, Tm = 53,0°C, %GC = 36,0%).
Kích thước sản phẩm khuếch đại: 203 bp.
Kiểm tra DNA tách chiết PCR gen chứng hoang dại DcR1 cho sản phẩm đúng kích thước 127 bp.
Nồng độ DNA tách chiết từ 27 mẫu: 71,10 ng/µl đến 2041,2 ng/µl; tỷ số A260/A280 đạt từ 1,56 đến 1,89.
Tỷ lệ methyl hóa thực nghiệm 18/27 mẫu dương tính (chiếm 66,7%).
- 18 mẫu dương tính: Fx 3, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 13, 17, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 25, 26, 27.
- 9 mẫu âm tính: Fx 1, 2, 4, 6, 12, 14, 15, 16, 22.

Đóng góp khoa học của đề tài:

  • Là một trong những công trình đầu tiên tại Việt Nam khảo sát một cách đồng bộ từ mô hình in silico đến thực nghiệm in vitro về đặc điểm promoter, các đảo CpG và tình trạng methyl hóa của gen RASSF1A trên bệnh nhân ung thư vú trong nước.
  • Xây dựng và chuẩn hóa thành công quy trình kỹ thuật MSP hoàn chỉnh từ khâu khử sáp mô bệnh phẩm paraffin, tách chiết DNA, xử lý biến đổi sodium bisulfite cho đến điện di kiểm chứng sản phẩm đặc hiệu.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận ghi nhận các hạn chế và định hướng nghiên cứu tiếp theo dựa trên phạm vi thực tế:

  • Cỡ mẫu thực nghiệm còn hạn chế (chỉ khảo sát trên 27 mẫu bệnh phẩm), do đó tỷ lệ methyl hóa 66,7% mới dừng lại ở mức ghi nhận sơ bộ bước đầu, chưa đủ lớn để đạt ý nghĩa thống kê đại diện cho toàn bộ quần thể bệnh nhân ung thư vú tại Việt Nam.
  • Toàn bộ mẫu nghiên cứu được thu thập từ các bệnh nhân đã phẫu thuật cắt bỏ khối u tại một cơ sở y tế (Bệnh viện Đại học Y Dược TP.HCM), thuộc nhóm bệnh nhân ở giai đoạn tiến triển muộn của bệnh (khối u đã hình thành và xâm lấn), chưa có nhóm mẫu đối chứng từ mô tuyến vú bình thường hoặc giai đoạn tiền ung thư để so sánh đối chiếu.
  • Nghiên cứu chưa áp dụng phương pháp giải trình tự bisulfite (Bisulfite Sequencing PCR - BSP) để xác nhận chính xác từng vị trí nucleotide cytosine bị methyl hóa trên các sản phẩm khuếch đại thu được từ phản ứng MSP.
  • Hướng mở: Tiếp tục mở rộng khảo sát phản ứng MSP trên quy mô mẫu bệnh phẩm lớn hơn; đồng thời triển khai kỹ thuật BSP nhằm khẳng định tuyệt đối độ đặc hiệu của các phân đoạn khuếch đại.

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận này mang lại giá trị tham khảo cụ thể cho sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu thuộc các chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Sinh học Phân tử, Di truyền Y học và Y sinh học:

  • Tham khảo về phương pháp luận thiết kế mồi MSP: Báo cáo trình bày chi tiết các nguyên tắc chọn vùng giàu cytosine tự do, phân bố vị trí dinucleotide CpG tại đầu 3' của mồi và cách khắc phục sự biến đổi trình tự sau xử lý bisulfite thông qua các công cụ tin sinh học chuyên dụng (MethPrimer, TFSEARCH, MethBLAST, IDT).
  • Tham khảo quy trình kỹ thuật xử lý mẫu FFPE: Cung cấp quy trình chi tiết về kỹ thuật loại sáp bằng xylene, tách chiết DNA bằng phenol/chloroform từ mô đúc sáp lâu năm và phương pháp kiểm tra chất lượng DNA bằng PCR gen chứng nội (DcR1).
  • Tham khảo điều kiện luân nhiệt và thành phần hóa chất: Bảng thành phần phản ứng và chu trình nhiệt chuẩn hóa cho phản ứng biến đổi bisulfite (kít EpiTect) và phản ứng MSP (cặp mồi WT1, WT2) có thể áp dụng trực tiếp cho các nghiên cứu biểu sinh học trên các gen ức chế khối u khác.

Câu hỏi thường gặp

Gen RASSF1A nằm ở vị trí nào trong bộ gen người và giữ vai trò sinh học gì trong tế bào?
Gen RASSF1A định vị tại vùng 3p21.3 trên cánh ngắn của nhiễm sắc thể số 3 ở người. Trong tế bào bình thường, đây là một gen ức chế khối u (tumor suppressor gene) mã hóa protein 340 amino acid (38,8 kDa). Protein này tham gia duy trì tính ổn định của thoi vô sắc trong quá trình nguyên phân, kìm hãm sự tích lũy cyclin D1 để ngăn chặn tế bào chuyển từ pha G1 sang pha S, liên kết với Cdc20 nhằm điều hòa phức hợp APC, đồng thời tương tác với NORE1A và kinase MST1/MST2 để kích hoạt chu trình chết theo chương trình của tế bào (apoptosis) theo con đường phụ thuộc protein Ras.

Vì sao phản ứng MSP bắt buộc phải xử lý mẫu DNA bằng sodium bisulfite trước khi khuếch đại?
Sodium bisulfite có tác dụng biến đổi hóa học có chọn lọc trên mạch đơn DNA: các nucleotide cytosine không bị methyl hóa sẽ bị khử amin và chuyển đổi thành uracil, trong khi các cytosine đã bị methyl hóa (5-methylcytosine) được bảo vệ và giữ nguyên cấu trúc cytosine. Quá trình này tạo ra sự khác biệt rõ rệt về mặt trình tự nucleotide giữa alen bị methyl hóa và alen không bị methyl hóa, cho phép các cặp mồi MSP đặc hiệu bắt cặp chọn lọc để nhận biết trạng thái methyl hóa của mẫu.

Trong phân tích in silico, vùng promoter của gen RASSF1A có cấu trúc đảo CpG như thế nào và vùng nào được chọn để thiết kế mồi?
Phân tích tin sinh học trên trình tự NC_000003 cho thấy vùng gen này chứa 2 đảo CpG: đảo thứ nhất dài 133 bp nằm hoàn toàn trong vùng promoter; đảo thứ hai dài 636 bp kéo dài từ promoter đến exon 1 (chứa 89 bp promoter trước vị trí bắt đầu phiên mã và 132 bp vùng 5'UTR). Tác giả đã lựa chọn vùng DNA định vị từ nucleotide -77 đến +130 để thiết kế mồi MSP vì vùng này tập trung nhiều vị trí CpG, chứa các vị trí nhận diện của các nhân tố phiên mã quan trọng (Sp1, c-Myc, E2F...) và tập trung nhiều cytosine tự do ngoài CpG, giúp tối đa hóa sự phân biệt giữa DNA đã biến đổi và chưa biến đổi bisulfite.

Tỷ lệ methyl hóa gen RASSF1A ghi nhận được trên các mẫu bệnh phẩm là bao nhiêu và tác giả giải thích thế nào về sự khác biệt so với y văn quốc tế?
Kết quả khảo sát bằng phản ứng MSP trên 27 mẫu mô bệnh phẩm ung thư vú ghi nhận 18 mẫu dương tính với methyl hóa, đạt tỷ lệ 66,7%. Tỷ lệ này nằm trong khoảng 60-80% được thống kê trên cơ sở dữ liệu Pubmeth, nhưng thấp hơn so với một số nghiên cứu quốc tế như Shinozaki và cộng sự (81%) hay Fackler và cộng sự (76%). Tác giả giải thích sự khác biệt này xuất phát từ cỡ mẫu khảo sát còn nhỏ (27 mẫu) và đặc điểm nguồn mẫu bệnh phẩm tại Việt Nam đều là những bệnh nhân ung thư vú ở giai đoạn trễ, khi khối u đã phát triển lớn và xâm lấn mô.

Chất lượng của DNA sau khi tách chiết từ mô paraffin được kiểm tra bằng phương pháp nào trước khi biến đổi bisulfite?
Chất lượng DNA tách chiết được đánh giá qua hai bước: đầu tiên là đo độ hấp thụ quang phổ UV ở bước sóng 260 nm và xác định tỷ số A260/A280 để kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch (độ tinh sạch đạt từ 1,56 đến 1,89); sau đó, DNA được đưa vào phản ứng PCR thực nghiệm để khuếch đại một phân đoạn dài 127 bp của gen chứng hoang dại DcR1. Sự xuất hiện của vạch sản phẩm 127 bp trên gel agarose xác nhận mạch khuôn DNA còn nguyên vẹn, đảm bảo chất lượng để tiến hành phản ứng biến đổi bisulfite.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Nguyễn Phan Cẩm Trang đã khảo sát thành công cấu trúc vùng promoter và các đảo CpG của gen ức chế khối u RASSF1A thông qua sự kết hợp giữa các công cụ tin sinh học (in silico) và thực nghiệm sinh học phân tử (in vitro). Tác giả đã thiết kế các cặp mồi đặc hiệu và chuẩn hóa quy trình kỹ thuật Methylation-Specific PCR (MSP) trên mạch khuôn DNA tách chiết từ mô ung thư vú đúc paraffin sau xử lý biến đổi sodium bisulfite. Kết quả phân tích trên 27 mẫu bệnh phẩm tại Việt Nam ghi nhận tỷ lệ methyl hóa vùng promoter gen RASSF1A đạt 66,7% (18/27 mẫu), phù hợp với phổ biến thiên trong y văn quốc tế và cung cấp dữ liệu cơ sở quan trọng cho các nghiên cứu tiếp theo về dấu chứng sinh học phân tử phục vụ tầm soát ung thư vú.