ĐẶT VẤN ĐỀ Trong tự nhiên có hàng nghìn cây thảo dược được con người biết đến và sử dụng từ lâu đời, các cây thảo dược này có chứa các hoạt chất dùng để bào chế các loại thuốc phục vụ cho y học, đời sống con người. Việt Nam là một trong những quốc gia có nguồn tài nguyên thực vật phong phú và đa dạng trên thế giới. Theo Viện dược liệu - Bộ y tế, Việt Nam có 5.117 loài và dưới loài, thuộc 1.823 chi, 360 họ của 8 ngành thực vật bậc cao có mạch, cùng với một số taxon thuộc nhóm rêu, tảo và nấm lớn. Trong đó có gần 90% là cây thuốc mọc tự nhiên, tập trung chủ yếu trong rừng và chỉ có hơn 10% là cây thuốc trồng (Viện dược liệu, 2016).
Cây Trâm bầu cũng là một cây dược liệu mọc tự nhiên nhưng chưa được chú trọng. Cây Trâm bầu (Combretum quadrangulare Kurz) là một trong những loài quan trọng nhất trong y học cổ truyền với các hợp chất terpenoids, flavonoid, steroid có khả năng kháng khuẩn, chống HIV, bảo vệ gan (Roy và cs. Bộ phận hạt, lá, rễ cây Trâm bầu được dùng điều chế cho thuốc trị giun, phần rễ và thân cũng được dùng chữa bệnh hoa liễu (Pongbunrods và cs. Trong dịch chiết của lá khô cây Trâm bầu có hoạt tính kháng vi khuẩn Helicobacter pylori (OHsUGI và cs.
Trong hạt cây Trâm bầu cũng có một hợp chất được tìm thấy là combertin, một loại alkaloid steroid có hoạt tính kháng Esscherichia coli ATCC 25922 và Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 mạnh hơn Staphylococcus aureus ATCC 25923 (Nantachit và cs. Năm 2018, Diale và cộng sự đã nghiên cứu vi khuẩn nội sinh từ cây Combretum molle – một loài thuộc chi Combretum cùng với cây Trâm bầu có hoạt tính kháng lại các vi khuẩn Bacillus cereus, S. coli (Diale và cs. Hiện nay, trên thế giới cũng như Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu về cao chiết cây Trâm bầu, tuy nhiên chưa có nhiều nghiên cứu công bố về vi sinh vật nội sinh của cây Trâm bầu có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm gây bệnh.
Chính vì thế, chúng tôi quyết định thực hiện nghiên cứu đề tài: “Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, SVTH: NGUYỄN THỊ MỸ DUYÊN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2 GVHD: ThS. DƯƠNG NHẬT LINH kháng nấm từ chủng vi sinh vật nội sinh phân lập được từ cây Trâm bầu (Combretum quadrangulare Kurz)”. • Mục tiêu: Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn, vi nấm nội sinh từ cây Trâm bầu (Combretum quadrangulare Kurz) có hoạt tính kháng một số vi khuẩn, vi nấm gây bệnh. • Nội dung nghiên cứu Phân lập vi khuẩn nội sinh từ cây Trâm bầu (Combretum quadrangulare Kurz).
Phân lập vi nấm nội sinh từ cây Trâm bầu (Combretum quadrangulare Kurz). Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm gây bệnh của vi khuẩn, vi nấm nội sinh từ cây Trâm bầu (Combretum quadrangulare Kurz). Định danh các chủng vi khuẩn, vi nấm có hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm cao theo phương pháp truyền thống. Khảo sát pH hoạt động của dịch nuôi cấy của chủng vi khuẩn có hoạt tính mạnh.
SVTH: NGUYỄN THỊ MỸ DUYÊN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 3 GVHD: ThS. DƯƠNG NHẬT LINH PHẦN 1. TỔNG QUAN SVTH: NGUYỄN THỊ MỸ DUYÊN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 4 GVHD: ThS. DƯƠNG NHẬT LINH 1.
TỔNG QUAN VỀ VI SINH VẬT NỘI SINH Sơ lược về vi sinh vật nội sinh Vi sinh vật nội sinh (Endophyte) là những vi sinh vật (chủ yếu là nấm và vi khuẩn) sống trong mô thực vật khỏe mạnh (Stoltzfus và cs, 2000; Wellington và cs., 2004) mà không gây ra tác hại trên cây kí chủ nó đang tồn tại và đã được chứng minh là nguồn sản phẩm tự nhiên có hoạt tính sinh học phong phú (Li và cs, 2008; Tan, 2001). Những vi sinh vật này thường xâm chiếm vào vùng không gian ở giữa các tế bào, chúng có thể được phân lập từ tất cả các bộ phận của cây, bao gồm cả hạt giống (Posada và cs, 2005). Vi sinh vật nội sinh thực vật được tìm thấy trong hầu hết ở các loài thực vật sống trên Trái đất, giữa chúng hình thành một loạt các mối quan hệ khác nhau như cộng sinh, tương hỗ, cộng sinh dinh dưỡng, hội sinh… (Strobel và cs, 2003). Hầu hết các dạng nội sinh này bắt đầu xuất hiện từ vùng rễ hay bề mặt lá, tuy nhiên cũng có một số loài có thể nội sinh trong hạt.
Vi sinh vật nội sinh thúc đẩy thực vật tăng trưởng, tăng năng suất và đóng một vai trò là tác nhân điều hòa sinh học (Võ Thị Ngọc Mỹ, 2016). Bằng chứng về mối quan hệ giữa vi sinh vật và thực vật được tìm thấy trong các mô hóa thạch của thân và lá đã chứng minh rằng các mối quan hệ giữa vi sinh vật nội sinh và thực vật có thể đã tiến hóa từ thời thực vật bậc cao được ưu tiên xuất hiện trên trái đất (Redecker và cs. Sự tồn tại của nấm bên trong các cơ quan của thực vật mà không gây triệu chứng đã được biết đến ở cuối thế kỉ 19 và thuật ngữ “endophyte” lần đầu tiên được De Bary đề xuất vào năm 1866 (De Bary, 1866). Kể từ khi vi sinh vật nội sinh được mô tả lần đầu tiên trong cây cỏ mọc lẫn cây lúa (Lolium temulentum) (Freeman, 1904).
Vi sinh vật nội sinh có thể được phân lập từ các cơ quan khác nhau của các loài thực vật khác nhau (Arnold, 2007) và tất cả các loài thực vật đã nghiên cứu đều thấy ít nhất một vi sinh vật nội sinh.000 loài thực vật tồn tại trên trái đất, mỗi loài là một cây chủ cho một đến nhiều các dạng nội sinh cư trú. Chỉ có một số loài thực vật được nghiên cứu hoàn chỉnh về các mối quan hệ nội sinh của chúng. Do đó, cơ hội nghiên cứu và tìm ra các dạng nội sinh mới và có lợi trong sự đa dạng sinh học của các hệ sinh thái SVTH: NGUYỄN THỊ MỸ DUYÊN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 5 GVHD: ThS. DƯƠNG NHẬT LINH khác nhau là đáng kể (Strobel và cs.
Hiện nay, thuật ngữ vi sinh vật nội sinh bao gồm tất cả các sinh vật có toàn bộ hoặc một phần thời gian của chu kỳ sống của chúng sống bên trong mô thực vật mà không tạo ra bất kỳ triệu chứng nào (Khan, 2007). Vi sinh vật nội sinh được chia thành hai loại chính đó là vi sinh vật nội sinh bắt buộc và vi sinh vật nội sinh tùy ý (Baldani và cs. Vi sinh vật nội sinh tùy ý có khả năng tồn tại trong đất, trên bề mặt cây trồng, bên trong thực vật cũng như trên các chất dinh dưỡng nhân tạo (Baldani và cs., 1997) và vi sinh vật sống bên trong mô thực vật trong suốt vòng đời của chúng được gọi là vi sinh vật nội sinh bắt buộc (Stoltzfus và cs. Vi sinh vật nội sinh tùy ý được phân bố rộng rãi trên toàn giới thực vật và có thể được phân lập từ các loài thực vật khác nhau.
Endophyte cũng được báo cáo là có ở cả một số loài thực vật và cây con nuôi cấy in vitro. Vi sinh vật nội sinh đã nhận được sự chú ý đáng kể sau khi phát hiện được chúng có khả năng bảo vệ thực vật chống lại côn trùng, sâu bệnh, mầm bệnh và thậm chí cả động vật ăn thực vật. Hầu như tất cả các loài thực vật (khoảng 400.000) chứa một hoặc nhiều vi sinh vật nội sinh (Khan, 2007). Chúng sinh sống ở phần lớn các cây khỏe mạnh, trong các mô khác nhau, hạt, rễ, thân, cành và lá.
Thực vật ký chủ đem lại lợi ích rộng rãi bằng cách nuôi dưỡng những vi sinh vật nội sinh này và các vi sinh vật nội sinh này giúp thúc đẩy tăng trưởng, nâng cao đề kháng các tác nhân gây bệnh khác nhau bằng cách sản xuất kháng sinh cho thực vật ký chủ. Vi sinh vật nội sinh cũng sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp có tầm quan trọng trong y học hiện đại, nông nghiệp và công nghiệp. Người ta cho rằng hoạt động hỗ sinh của thực vật có sự hiện diện của vi sinh vật nội sinh như một chất “kích hoạt sinh học” (biological trigger) để kích hoạt các hệ thống phản ứng một cách nhanh hơn và mạnh mẽ hơn so với thực vật không được hỗ sinh (Bandara và cs. Nhiều vi sinh vật nội sinh có khả năng tổng hợp các chất chuyển hóa có hoạt tính sinh học khác nhau có thể trực tiếp hoặc gián tiếp được sử dụng như tác nhân điều trị chống lại nhiều bệnh ở thực vật, động vật và cả ở người (Strobel và cs.
Một số ví dụ điển hình như là thuốc kháng sinh mới ecomycins được tạo ra từ vi SVTH: NGUYỄN THỊ MỸ DUYÊN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 6 GVHD: ThS. DƯƠNG NHẬT LINH khuẩn Pseudomonas syringae (Christina và cs. Năm 1996, Strobel và cộng sự đã báo cáo rằng nấm nội sinh (Pestalotiopsis microspora) được tìm thấy trong cây Yew cũng có thể sản xuất Taxol - thuốc điều trị ung thư đầu tiên trên thế giới (Strobel và cs. Việc sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học từ vi sinh vật nội sinh đặc biệt là tạo nên những đặc tính riêng biệt cho thực vật chủ của chúng, điều này không chỉ quan trọng khi xét trên một quan điểm sinh thái mà còn là từ một quan điểm hóa sinh và phân tử.
Vì vậy, các sản phẩm tự nhiên từ vi sinh vật nội sinh không những có một tiềm năng to lớn trong ngành công nghệ dược phẩm mà còn trong ngành chế biến chế phẩm vi sinh trong nông nghiệp (Borel và cs. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Hiện nay trên thế giới, có nhiều công trình nghiên cứu về vi sinh vật nội sinh phân lập từ cây dược liệu đã được công bố và ứng dụng vào thực tiễn. Năm 1999, Miss đã phân lập và tuyển chọn một số loài vi khuẩn sống trong mô của cây cỏ có khả năng sản xuất ra L-sparaginase. Tác giã đã phân lập được 657 loài vi khuẩn từ những cây thân thảo để sản xuất L-sparaginase.
Trong đó ông tìm ra được 220 loài vi khuẩn có hiệu lực mạnh để thử nghiệm (Miss và cs. Năm 2000, Kim đã tách chất ức chế β-lactamase từ vi khuẩn sống trong mô thực vật. Tác giả đã phân lập và tuyển chọn vi khuẩn sống trong mô của 25 loài thực vật khác nhau và phân lập được 600 chủng vi khuẩn (Kim và cs. Năm 2003, Kennedia nigricans, một loại cây leo ở Úc, dân gian thường dụng áp nhựa để điều trị vết thương, sát trùng, đã được Strobel và cộng sự phân lập được chủng Streptomyces sp.
NRRL 30562 mới ứng dụng sản xuất kháng sinh (Strobel và cs.