Phân lập vi sinh vật nội sinh từ cây cỏ hôi ageratum conyzoides và khảo sát khả năng đối kháng với một số vi sinh vật gây bệnh

Tài liệu nghiên cứu Phân lập vi sinh vật nội sinh từ cây cỏ hôi ageratum conyzoides và khảo sát khả năng đối kháng với, tổng hợp lý thuyết và thực hành, cung cấp kiến thức chuyên

• Tác giả: Phạm Thị Ngọc Phượng
• Người hướng dẫn: Th.S. Dương Nhật Linh
• Trường học: Trường Đại Học Mở Tp.Hcm
• Chuyên ngành: Vi Sinh – Sinh Học Phân Tử
• Đề tài: Phân Lập Vi Sinh Vật Nội Sinh Từ Cây Cỏ Hôi Và Khả Năng Đối Kháng Với Vi Sinh Vật Gây Bệnh
• Loại tài liệu: báo cáo khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Tp. Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC HÌNH
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC BIỂU ĐỒ
• 1. PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. SƠ LƯỢC VỀ VI SINH VẬT NỘI SINH
• 1.2. TỔNG QUAN CÂY CỎ HÔI
• 1.3. TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ VI KHUẨN NGHIÊN CỨU
• 1.4. TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ VI NẤM GÂY BỆNH CHO NGƯỜI
• 1.5. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC
• 2. PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
• 2.2. Đối tượng nghiên cứu
• 2.3. Thiết bị, dụng cụ, môi trường
• 2.4. Phương pháp thí nghiệm
• 2.5. Bố trí thí nghiệm
• 2.6. Phương pháp phân lập vi sinh vật nội sinh
• 2.7. Đánh giá khả năng kháng khuẩn, kháng nấm gây bệnh của chủng vi sinh vật nội sinh phân lập
• 3. PHẦN 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả giám định tên khoa học của cây
• 3.2. Kết quả phân lập vi sinh vật nội sinh từ cây cỏ hôi
• 3.3. Kết quả đánh giá khả năng kháng khuẩn, kháng nấm gây bệnh của chủng vi sinh nội sinh phân lập từ cây cỏ hôi
• 3.4. Kết quả định danh
• 4. PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Vi Sinh Vật Nội Sinh Từ Cây Cỏ Hôi

Nghiên cứu về vi sinh vật nội sinh từ cây cỏ hôi (Ageratum conyzoides) đang thu hút sự chú ý trong lĩnh vực sinh học và y học. Cây cỏ hôi không chỉ là một loại dược liệu phổ biến mà còn là nguồn tiềm năng cho việc phát triển các sản phẩm kháng sinh tự nhiên. Vi sinh vật nội sinh có khả năng sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học, giúp bảo vệ cây khỏi các tác nhân gây bệnh. Nghiên cứu này nhằm phân lập và khảo sát khả năng đối kháng của các vi sinh vật nội sinh từ cây cỏ hôi với các vi sinh vật gây bệnh.

1.1. Khái Niệm Về Vi Sinh Vật Nội Sinh

Vi sinh vật nội sinh là những vi sinh vật sống bên trong mô thực vật mà không gây hại cho cây chủ. Chúng có thể sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học, giúp cây phát triển và chống lại bệnh tật.

1.2. Tầm Quan Trọng Của Cây Cỏ Hôi Trong Nghiên Cứu

Cây cỏ hôi được biết đến với nhiều tác dụng dược lý, bao gồm khả năng kháng viêm và kháng khuẩn. Nghiên cứu về vi sinh vật nội sinh từ cây này có thể mở ra hướng đi mới trong việc phát triển thuốc kháng sinh tự nhiên.

II. Vấn Đề Kháng Thuốc Và Thách Thức Trong Điều Trị Bệnh

Kháng thuốc đang trở thành một vấn đề nghiêm trọng trong y tế toàn cầu. Vi sinh vật gây bệnh ngày càng phát triển khả năng kháng lại các loại thuốc hiện có, dẫn đến việc điều trị trở nên khó khăn hơn. Việc tìm kiếm các nguồn kháng sinh mới từ vi sinh vật nội sinh là một giải pháp tiềm năng để đối phó với tình trạng này.

2.1. Tình Hình Kháng Thuốc Hiện Nay

Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), tỷ lệ vi khuẩn kháng thuốc đang gia tăng, đặc biệt là các chủng vi khuẩn như Escherichia coli và Staphylococcus aureus. Điều này đặt ra thách thức lớn cho ngành y tế.

2.2. Nguyên Nhân Gây Ra Kháng Thuốc

Sự lạm dụng kháng sinh trong điều trị và chăn nuôi là nguyên nhân chính dẫn đến tình trạng kháng thuốc. Việc sử dụng không đúng cách các loại thuốc kháng sinh đã tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển khả năng kháng thuốc.

III. Phương Pháp Phân Lập Vi Sinh Vật Nội Sinh Từ Cây Cỏ Hôi

Phân lập vi sinh vật nội sinh từ cây cỏ hôi được thực hiện thông qua các phương pháp nuôi cấy trong môi trường thích hợp. Các mẫu cây được thu thập và xử lý để tách biệt các vi sinh vật nội sinh, từ đó tiến hành khảo sát khả năng kháng khuẩn của chúng.

3.1. Quy Trình Thu Thập Mẫu Cây

Mẫu cây cỏ hôi được thu thập từ các vùng khác nhau để đảm bảo tính đa dạng. Sau đó, các mẫu này được rửa sạch và xử lý để loại bỏ tạp chất trước khi tiến hành phân lập.

3.2. Kỹ Thuật Phân Lập Vi Sinh Vật

Sử dụng các môi trường nuôi cấy như TSA và PDA để phân lập vi sinh vật. Các mẫu được cấy trên môi trường và ủ trong điều kiện thích hợp để phát triển.

IV. Khả Năng Đối Kháng Của Vi Sinh Vật Nội Sinh Với Vi Sinh Vật Gây Bệnh

Khả năng đối kháng của vi sinh vật nội sinh từ cây cỏ hôi với các vi sinh vật gây bệnh được khảo sát thông qua các thí nghiệm. Kết quả cho thấy nhiều chủng vi sinh vật nội sinh có khả năng ức chế sự phát triển của các vi khuẩn và nấm gây bệnh.

4.1. Kết Quả Khảo Sát Khả Năng Kháng Khuẩn

Nghiên cứu cho thấy một số chủng vi sinh vật nội sinh có khả năng ức chế mạnh mẽ các vi khuẩn như E. coli và S. aureus. Điều này mở ra cơ hội cho việc phát triển các sản phẩm kháng sinh mới.

4.2. Khả Năng Kháng Nấm Của Vi Sinh Vật Nội Sinh

Ngoài khả năng kháng khuẩn, một số chủng vi sinh vật nội sinh cũng cho thấy khả năng kháng nấm, đặc biệt là với Trichophyton rubrum, một loại nấm gây bệnh phổ biến.

V. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Vi Sinh Vật Nội Sinh Trong Y Học

Vi sinh vật nội sinh từ cây cỏ hôi có thể được ứng dụng trong việc phát triển các sản phẩm kháng sinh tự nhiên. Những sản phẩm này không chỉ có hiệu quả trong việc điều trị bệnh mà còn an toàn cho sức khỏe con người.

5.1. Phát Triển Thuốc Kháng Sinh Từ Vi Sinh Vật Nội Sinh

Nghiên cứu cho thấy rằng các hợp chất được chiết xuất từ vi sinh vật nội sinh có thể được phát triển thành thuốc kháng sinh mới, giúp điều trị hiệu quả các bệnh nhiễm trùng.

5.2. Ứng Dụng Trong Nông Nghiệp

Vi sinh vật nội sinh cũng có thể được ứng dụng trong nông nghiệp để bảo vệ cây trồng khỏi các mầm bệnh, từ đó nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm.

VI. Kết Luận Và Tương Lai Của Nghiên Cứu Vi Sinh Vật Nội Sinh

Nghiên cứu về vi sinh vật nội sinh từ cây cỏ hôi mở ra nhiều triển vọng trong việc phát triển các sản phẩm kháng sinh tự nhiên. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị cho y học và nông nghiệp.

6.1. Tầm Quan Trọng Của Nghiên Cứu

Nghiên cứu về vi sinh vật nội sinh không chỉ giúp phát hiện các hợp chất mới mà còn góp phần vào việc giải quyết vấn đề kháng thuốc hiện nay.

6.2. Hướng Nghiên Cứu Tương Lai

Cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về các chủng vi sinh vật nội sinh khác từ cây cỏ hôi và các loại cây dược liệu khác để khai thác tiềm năng của chúng trong y học và nông nghiệp.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ SVTT: PHẠM THỊ NGỌC PHƯỢNG 1 BÁ O CÁ O KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Bệnh nhiễm trùng là một trong những nguyên nhân hàng đầu mắc phải và tử vong trên toàn thế giới, đặc biệt là ở các nước phát triển (Zeigler, 2005; Yala và cs, 2001). Vào thế kỉ XX, kháng sinh đã trở thành một trong những thứ vũ khí hữu hiệu nhất trong việc chống lại vi khuẩn và các bệnh nhiễm khuẩn do chúng gây ra. Theo tổ chức y tế thế giới (WHO) hơn 80% dân số thế giới dựa trên y học cổ truyền để đáp ứng nhu cầu chăm sóc sức khỏe cho chính mình (Vashist và Jindal, 2012) đặc biệt là trong điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn, vi nấm gây ra. Vấn đề hiện nay là vi sinh vật kháng thuốc và đa kháng thuốc ngày càng phổ biến và nghiêm trọng.

Vì vậy, việc tìm ra nguồn thuốc mới thay thế cho các thuốc đang sử dụng trở nên cấp thiết trong đó thực vật và vi sinh vật nội sinh là những nguồn đầy tiềm năng đang được quan tâm. Vi sinh vật nội sinh thực vật được tìm thấy trong hầu hết các loài thực vật, chúng cư trú ở trong mô của thực vật và giữa chúng hình thành một loạt các mối quan hệ khác nhau như cộng sinh tương hỗ, cộng sinh dinh dưỡng, hội sinh (Compant và cs. Và một số nghiên cứu trước đây đã cho thấy rằng, vi sinh vật nội sinh cây dược liệu có khả năng sinh ra các chất có khả năng ứng dụng để sản xuất kháng sinh, đó là nguồn chất kháng khuẩn, kháng nấm có tiềm năng quan trọng dùng cho việc phòng trị các loại vi nấm và vi khuẩn gây bệnh (Ryan và cs, 2008). Cây cỏ hôi (Ageratum conyzoides) là dược liệu phổ biến ở nước ta.

Các công trình nghiên cứu về tác dụng dược lý của cây cỏ hôi cho thấy loài cây này có tác dụng kháng viêm, kháng khuẩn, làm giảm đau và hạ sốt. Năm 1965, Điều Ngọc Thực ở Phú Thọ đã ứng dụng cây cỏ hôi chữa viêm xoang mũi dị ứng cho bản thân và một số người khác thấy có kết quả tốt. Trên cơ sở thực tế kết quả lâm sàng, Đoàn Thị Nhu và cộng sự (1975) đã xác định độc tính cấp LD-50 bằng đường uống là 82g/kg. Với liều độ bán mãn dùng trong 30 ngày không thấy gây những biến đổi bất thường đối với các hằng số sinh hóa trong một số xét nghiệm về chức năng gan và thận.

Từ những lợi ích nêu trên của cây cỏ hôi và các ứng dụng rộng lớn của vi sinh vật nội sinh, nên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “PHÂN LẬP VI SINH VẬT NỘI SINH TỪ CÂY CỎ HÔI (AGERATUM CONYZOIDES) VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG VỚI MỘT SỐ VI SINH VẬT GÂY BỆNH” SVTT: PHẠM THỊ NGỌC PHƯỢNG 2 BÁ O CÁ O KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Mục tiêu: Tạo ra bộ sưu tập vi sinh vật nội sinh cây dược liệu Ageratum conyzoides có khả năng đối kháng với một số vi sinh vật gây bệnh. Nội dung thực hiện đề tài: Thu thập mẫu cây dược liệu (lá, thân cây cỏ hôi). Phân lập và làm thuần các vi sinh vật nội sinh phân lập được trên cây dược liệu. Khảo sát khả năng đối kháng với một số vi sinh vật gây bệnh.

Định danh những chủng vi sinh vật nội sinh. Kết luận, nhận xét, đánh giá kết quả và viết báo cáo. SVTT: PHẠM THỊ NGỌC PHƯỢNG 3 BÁ O CÁ O KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU SVTT: PHẠM THỊ NGỌC PHƯỢNG 4 BÁ O CÁ O KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 1. SƠ LƯỢC VỀ VI SINH VẬT NỘI SINH 1.

Vi sinh vật nội sinh Thuật ngữ “endophytic” bao gồm các vi sinh vật phát triển bên trong các mô của thực vật bậc cao, không gây ra tác hại trên cây kíchủ mà nó đang tồn tại và đã được chứng minh là nguồn sản phẩm tự nhiên phong phú có hoạt tính sinh học (Li và cs., 2008; Tan và Zou, 2001). Tương tác hỗ sinh giữa vi sinh vật và cây chủ đem đến lợi ích cho cả hai bên (Kogel và cs. Các vi sinh vật này có thể sản xuất một loạt các hợp chất khác nhau nhằm cung cấp, bảo vệ và là điều kiện sống của cây chủ. Các hợp chất được cô lập có thể có tiềm năng sử dụng trong nông nghiệp, công nghiệp và y tế (Strobel, 2003).

Năm 2000, Kobayashi và Palumbo đã biên soạn một danh sách 55 giống và 144 loài nội sinh phân lập từ rễ, thân, hoa, hạt, quả của nhiều loài thực vật (Kobayashi và Palumbo, 2000). Các vi sinh vật nội sinh thường gặp nhất là nấm và vi khuẩn (bao gồm cả xạ khuẩn). Cả vi khuẩn nội sinh và nấm nội sinh có thể cùng tồn tại trong một cây chủ duy nhất (Ting và cs. Vi sinh vật nội sinh được coi là một tập con của quần thể vi sinh vật (Germida và cs.

Vi sinh vật nội sinh hiện đang được nghiên cứu rộng rãi như là nguồn sản phẩm hoạt tính sinh học mới, mở ra một cơ hội để khám phá các hợp chất mới và các nguồn lực công nghệ sinh học có tiềm năng có thể khai thác (Sivaramakrishnan và cs., 2006) và có tiềm năng sử dụng của chúng trong nhiều lĩnh vực (Strobel, 2003). Một số vai trò của vi sinh vật nội sinh Vi sinh vật nội sinh sống trong mô thực vật được tìm thấy ở vùng rễ, rễ, thân, lá, quả của thực vật. Vùng rễ là nơi xuất phát nhiều vi khuẩn nội sinh chui vào rễ, thân, lá để sống nội sinh; sau khi xâm nhập vào cây chủ có thể tập trung tại vị tríxâm nhập hoặc di chuyển đi khắp nơi trong cây đến các hệ mạch của rễ, thân, lá, hoa (Zinniel và cs, 2002), thúc đẩy các quá trình chuyển hóa trong cây, sự phát triển lông rễ một cách mạnh mẽ và giảm sự kéo dài rễ (Harari và cs, 1988). Sau khi đã cư trú trong các mô thực vật, vi sinh vật nội sinh sẽ sản xuất các sản phẩm tự nhiên đa dạng mà có thể là một nguồn tiềm năng của thuốc kháng sinh mới.

SVTT: PHẠM THỊ NGỌC PHƯỢNG 5 BÁ O CÁ O KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Các sản phẩm tự nhiên thu được từ vi khuẩn nội sinh là các chất kháng khuẩn, kháng virus, chống ung thư, chống oxy hóa, tiểu đường và ức chế miễn dịch. (Christina và cs., 2013) Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng vi sinh vật nội sinh có khả năng kiểm soát mầm bệnh trên thực vật. Năm 2009, Gazis và cộng sự đã phân lập vi khuẩn nội sinh mới kiểm soát sinh học chống lại các tác nhân gây bệnh rụng lá trên cây cao su (Hevea brasiliensis) tại Peru. Trong một số trường hợp chúng đẩy mạnh tốc độ nảy mầm của hạt, thúc đẩy sự hình thành cây con trong điều kiện bất lợi và nâng cao khả năng tăng trưởng của thực vật (Chanway, 1997).

Bên cạnh đó, vi sinh vật nội sinh còn có khả năng ngăn chặn mầm bệnh phát triển bằng cách tổng hợp các chất nội sinh trung gian, qua đó để tiếp tục tổng hợp các chất chuyển hóa và các hợp chất hữu cơ mới. Nghiên cứu chế phẩm sản sinh chất chuyển hóa mới trong sự đa dạng sinh học của vi sinh vật nội sinh có thể phát hiện các loại thuốc mới để điều trị có hiệu quả cả bệnh ở người, thực vật và động vật (Strobel và cs. Phân loại vi sinh vật nội sinh Vi sinh vật nội sinh được chia thành hai loại chính: vi sinh vật nội sinh bắt buộc và vi sinh vật nội sinh tuỳ ý. Vi sinh vật nội sinh tuỳ ý có khả năng tồn tại trong đất, trên bề mặt cây trồng, bên trong thực vật cũng như trên các chất dinh dưỡng nhân tạo (Baldani và cs., 1997) và vi sinh vật sống bên trong mô thực vật trong suốt vòng đời của chúng được gọi là vi sinh vật nội sinh bắt buộc (Stoltzfus và cs.

Vi sinh vật nội sinh tuỳ ý được phân bố rộng rãi trên toàn giới thực vật và có thể được phân lập từ các loài thực vật khác nhau. Vi sinh vật nội sinh cũng được báo cáo là có ở cả một số loài thực vật và cây con nuôi cấy in vitro. Trên thế giới có vô số loài thực vật với số lượng khổng lồ, có khoảng 300.000 loài thực vật tồn tại trên Trái Đất, mỗi loài là một ký chủ cho một đến nhiều các dạng nội sinh cư trú, do đó không thể đưa vào thí nghiệm một cách chủ quan hay ngẫu nhiên. Vìvậy, cần có nguyên tắc lựa chọn nhất định, phù hợp với mục đích để có được nguồn vi sinh vật nội sinh hữu ích, có tính ứng dụng cao (Strobel và cs.

TỔNG QUAN CÂY CỎ HÔI 1. Khái quát về họ cúc (Compositae) SVTT: PHẠM THỊ NGỌC PHƯỢNG 6 BÁ O CÁ O KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Họ Cúc (Compositae) là một trong những họ lớn nhất, phân bố rộng rãi nhất, bao gồm tới 10.000 loài phân bố trên toàn thế giới ở mọi địa hình và khí hậu khác nhau, nhất là vùng khí hậu nhiệt đới và ôn đới ở Việt Nam, có 125 chi và 350 loài phân bố khắp mọi nơi từ cực Nam đến cực Bắc của đất nước (Hoàng Thị Sản, 2003). Các cây họ Cúc thường thuộc loại thảo, ít khi là cây to, rể cây thường phồng lên thành củ, lá đơn và thường mọc so le, ít khi mọc đối, có khi thành hình hoa thị, không có lá kèm, phiến lá ít khi nguyên, thường khứa răng hay chia thùy. Cụm hoa đầu gồm nhiều hoa, mọc những kẻ ở vảy và bao bọc bởi một tổng bao lá hắc.

Hoa có thể đều hình ống hay không đều, hình lới nhỏ 5 cánh hoa liền nhau thành một tràng hình ống hay hình lỡi nhỏ. Năm nhị dưới liền nhau bởi bao phấn thành một ống. Hai lá noãn, bầu hạ một ô đựng một noãn vòi dài đầu nhụy xẻ đôi có lông thu, quả bế nhiều khi có mào lông hay có móc, hạt không có nội nhủ. Một số cây có ống nhựa mủ, một số khác có ống tiết.

Chất dự trữ trong củ là insulin (Nguyễn Thị Diễm Trang, 1973). Ở nước ta, các chi có nhiều loài nhất là Blumea, Vernonia, Latuca, Eupatoreum, Ginura, Senecio, Artemisia, Crepis và Ainsliaea. Gần đây một số chi họ Cúc ở Việt Nam đã được nghiên cứu nhiều như: Artemisia, Ageratum, Eupatorium và Blumea. Bohlman và các cộng sự đã nghiên cứu các loại thực vật họ Cúc ở Châu Âu, ở Trung và Nam Mỹ và một số vùng ở Nam Phi.

Khái quát về cây cỏ hôi (Ageratum conyzoides L) 1. Phân loại thực vật Giới (regnum) Plantae Ngành (division) Tracheophyta Lớp (class) Magnoliopsida Bộ (ordo) Asterales Họ (familia) Asteraceae Chi (genus) Ageratum Loài (species) Ageratum conyzoides L.