Phân lập vi sinh vật nội sinh từ cây cỏ hôi ageratum conyzoides và khảo sát khả năng đối kháng với một số vi sinh vật gây bệnh

Nghiên cứu về vi sinh vật nội sinh từ cây cỏ hôi (Ageratum conyzoides) đang thu hút sự chú ý trong lĩnh vực sinh… 113 trang · Trường Đại Học Mở Tp.Hcm · 2016.

• Tác giả: Phạm Thị Ngọc Phượng
• Người hướng dẫn: Th.S. Dương Nhật Linh
• Trường học: Trường Đại Học Mở Tp.Hcm
• Chuyên ngành: Vi Sinh – Sinh Học Phân Tử
• Đề tài: Phân Lập Vi Sinh Vật Nội Sinh Từ Cây Cỏ Hôi Và Khả Năng Đối Kháng Với Vi Sinh Vật Gây Bệnh
• Loại tài liệu: báo cáo khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Tp. Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC HÌNH
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC BIỂU ĐỒ
• 1. PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. SƠ LƯỢC VỀ VI SINH VẬT NỘI SINH
• 1.2. TỔNG QUAN CÂY CỎ HÔI
• 1.3. TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ VI KHUẨN NGHIÊN CỨU
• 1.4. TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ VI NẤM GÂY BỆNH CHO NGƯỜI
• 1.5. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC
• 2. PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
• 2.2. Đối tượng nghiên cứu
• 2.3. Thiết bị, dụng cụ, môi trường
• 2.4. Phương pháp thí nghiệm
• 2.5. Bố trí thí nghiệm
• 2.6. Phương pháp phân lập vi sinh vật nội sinh
• 2.7. Đánh giá khả năng kháng khuẩn, kháng nấm gây bệnh của chủng vi sinh vật nội sinh phân lập
• 3. PHẦN 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả giám định tên khoa học của cây
• 3.2. Kết quả phân lập vi sinh vật nội sinh từ cây cỏ hôi
• 3.3. Kết quả đánh giá khả năng kháng khuẩn, kháng nấm gây bệnh của chủng vi sinh nội sinh phân lập từ cây cỏ hôi
• 3.4. Kết quả định danh
• 4. PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Vi Sinh Vật Nội Sinh Từ Cây Cỏ Hôi

Nghiên cứu về vi sinh vật nội sinh từ cây cỏ hôi (Ageratum conyzoides) đang thu hút sự chú ý trong lĩnh vực sinh học và y học. Cây cỏ hôi không chỉ là một loại dược liệu phổ biến mà còn là nguồn tiềm năng cho việc phát triển các sản phẩm kháng sinh tự nhiên. Vi sinh vật nội sinh có khả năng sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học, giúp bảo vệ cây khỏi các tác nhân gây bệnh. Nghiên cứu này nhằm phân lập và khảo sát khả năng đối kháng của các vi sinh vật nội sinh từ cây cỏ hôi với các vi sinh vật gây bệnh.

1.1. Khái Niệm Về Vi Sinh Vật Nội Sinh

Vi sinh vật nội sinh là những vi sinh vật sống bên trong mô thực vật mà không gây hại cho cây chủ. Chúng có thể sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học, giúp cây phát triển và chống lại bệnh tật.

1.2. Tầm Quan Trọng Của Cây Cỏ Hôi Trong Nghiên Cứu

Cây cỏ hôi được biết đến với nhiều tác dụng dược lý, bao gồm khả năng kháng viêm và kháng khuẩn. Nghiên cứu về vi sinh vật nội sinh từ cây này có thể mở ra hướng đi mới trong việc phát triển thuốc kháng sinh tự nhiên.

II. Vấn Đề Kháng Thuốc Và Thách Thức Trong Điều Trị Bệnh

Kháng thuốc đang trở thành một vấn đề nghiêm trọng trong y tế toàn cầu. Vi sinh vật gây bệnh ngày càng phát triển khả năng kháng lại các loại thuốc hiện có, dẫn đến việc điều trị trở nên khó khăn hơn. Việc tìm kiếm các nguồn kháng sinh mới từ vi sinh vật nội sinh là một giải pháp tiềm năng để đối phó với tình trạng này.

2.1. Tình Hình Kháng Thuốc Hiện Nay

Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), tỷ lệ vi khuẩn kháng thuốc đang gia tăng, đặc biệt là các chủng vi khuẩn như Escherichia coli và Staphylococcus aureus. Điều này đặt ra thách thức lớn cho ngành y tế.

2.2. Nguyên Nhân Gây Ra Kháng Thuốc

Sự lạm dụng kháng sinh trong điều trị và chăn nuôi là nguyên nhân chính dẫn đến tình trạng kháng thuốc. Việc sử dụng không đúng cách các loại thuốc kháng sinh đã tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển khả năng kháng thuốc.

III. Phương Pháp Phân Lập Vi Sinh Vật Nội Sinh Từ Cây Cỏ Hôi

Phân lập vi sinh vật nội sinh từ cây cỏ hôi được thực hiện thông qua các phương pháp nuôi cấy trong môi trường thích hợp. Các mẫu cây được thu thập và xử lý để tách biệt các vi sinh vật nội sinh, từ đó tiến hành khảo sát khả năng kháng khuẩn của chúng.

3.1. Quy Trình Thu Thập Mẫu Cây

Mẫu cây cỏ hôi được thu thập từ các vùng khác nhau để đảm bảo tính đa dạng. Sau đó, các mẫu này được rửa sạch và xử lý để loại bỏ tạp chất trước khi tiến hành phân lập.

3.2. Kỹ Thuật Phân Lập Vi Sinh Vật

Sử dụng các môi trường nuôi cấy như TSA và PDA để phân lập vi sinh vật. Các mẫu được cấy trên môi trường và ủ trong điều kiện thích hợp để phát triển.

IV. Khả Năng Đối Kháng Của Vi Sinh Vật Nội Sinh Với Vi Sinh Vật Gây Bệnh

Khả năng đối kháng của vi sinh vật nội sinh từ cây cỏ hôi với các vi sinh vật gây bệnh được khảo sát thông qua các thí nghiệm. Kết quả cho thấy nhiều chủng vi sinh vật nội sinh có khả năng ức chế sự phát triển của các vi khuẩn và nấm gây bệnh.

4.1. Kết Quả Khảo Sát Khả Năng Kháng Khuẩn

Nghiên cứu cho thấy một số chủng vi sinh vật nội sinh có khả năng ức chế mạnh mẽ các vi khuẩn như E. coli và S. aureus. Điều này mở ra cơ hội cho việc phát triển các sản phẩm kháng sinh mới.

4.2. Khả Năng Kháng Nấm Của Vi Sinh Vật Nội Sinh

Ngoài khả năng kháng khuẩn, một số chủng vi sinh vật nội sinh cũng cho thấy khả năng kháng nấm, đặc biệt là với Trichophyton rubrum, một loại nấm gây bệnh phổ biến.

V. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Vi Sinh Vật Nội Sinh Trong Y Học

Vi sinh vật nội sinh từ cây cỏ hôi có thể được ứng dụng trong việc phát triển các sản phẩm kháng sinh tự nhiên. Những sản phẩm này không chỉ có hiệu quả trong việc điều trị bệnh mà còn an toàn cho sức khỏe con người.

5.1. Phát Triển Thuốc Kháng Sinh Từ Vi Sinh Vật Nội Sinh

Nghiên cứu cho thấy rằng các hợp chất được chiết xuất từ vi sinh vật nội sinh có thể được phát triển thành thuốc kháng sinh mới, giúp điều trị hiệu quả các bệnh nhiễm trùng.

5.2. Ứng Dụng Trong Nông Nghiệp

Vi sinh vật nội sinh cũng có thể được ứng dụng trong nông nghiệp để bảo vệ cây trồng khỏi các mầm bệnh, từ đó nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm.

VI. Kết Luận Và Tương Lai Của Nghiên Cứu Vi Sinh Vật Nội Sinh

Nghiên cứu về vi sinh vật nội sinh từ cây cỏ hôi mở ra nhiều triển vọng trong việc phát triển các sản phẩm kháng sinh tự nhiên. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị cho y học và nông nghiệp.

6.1. Tầm Quan Trọng Của Nghiên Cứu

Nghiên cứu về vi sinh vật nội sinh không chỉ giúp phát hiện các hợp chất mới mà còn góp phần vào việc giải quyết vấn đề kháng thuốc hiện nay.

6.2. Hướng Nghiên Cứu Tương Lai

Cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về các chủng vi sinh vật nội sinh khác từ cây cỏ hôi và các loại cây dược liệu khác để khai thác tiềm năng của chúng trong y học và nông nghiệp.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Bệnh nhiễm trùng là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây bệnh và tử vong trên thế giới, đặc biệt trong bối cảnh tình trạng vi sinh vật kháng thuốc và đa kháng thuốc ngày càng trở nên nghiêm trọng (Zeigler, 2005; Yala và cs, 2001). Sự suy giảm hiệu lực của các thế hệ kháng sinh hiện hành thúc đẩy nhu cầu cấp thiết tìm kiếm các hợp chất kháng sinh tự nhiên mới. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), có hơn 80% dân số thế giới dựa trên y học cổ truyền để đáp ứng nhu cầu chăm sóc sức khỏe, đặc biệt trong điều trị nhiễm trùng do vi khuẩn và vi nấm gây ra (Vashist và Jindal, 2012). Trong số các nguồn dược liệu tiềm năng, thực vật và hệ vi sinh vật nội sinh (endophytes) cư trú bên trong mô cây đang nhận được sự chú ý lớn từ giới khoa học y sinh và công nghệ sinh học (Ryan và cs, 2008).

Cây cỏ hôi (Ageratum conyzoides L., thuộc họ Cúc - Asteraceae/Compositae) là một loài cây dược liệu quen thuộc, phân bố rộng rãi tại Việt Nam. Cây có các tác dụng dược lý như kháng khuẩn, kháng viêm, giảm đau, hạ sốt và được ứng dụng trong y học dân gian để điều trị viêm xoang mũi dị ứng, rong huyết, thấp khớp và các bệnh ngoài da. Kết quả nghiên cứu lâm sàng của Đoàn Thị Nhu và cộng sự (1975) đã ghi nhận độc tính cấp LD-50 đường uống của cỏ hôi là 82 g/kg, đồng thời liều bán mãn trong 30 ngày không làm biến đổi bất thường chức năng gan, thận. Tận dụng tiềm năng từ hệ vi sinh vật sống trong mô cây cỏ hôi, khóa luận tốt nghiệp thực hiện đề tài nhằm xây dựng cơ sở dữ liệu và tuyển chọn các chủng vi sinh vật có hoạt tính sinh học ức chế tác nhân gây bệnh.

Mục tiêu tổng quát của đề tài là: Tạo ra bộ sưu tập vi sinh vật nội sinh từ cây dược liệu Ageratum conyzoides L. có khả năng đối kháng với một số vi sinh vật gây bệnh.

Các nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể gồm 5 nội dung:

1. Thu thập mẫu cây dược liệu cỏ hôi khỏe mạnh (rễ, thân, lá).
2. Phân lập và làm thuần các chủng vi khuẩn, vi nấm nội sinh từ các bộ phận của cây.
3. Khảo sát hoạt tính đối kháng của các chủng vi sinh vật nội sinh và dịch lọc nuôi cấy đối với các vi sinh vật gây bệnh thực nghiệm (bao gồm vi khuẩn thường, vi khuẩn sinh men carbapenemase và vi nấm gây bệnh ngoài da).
4. Định danh hình thái và đặc tính sinh hóa các chủng vi sinh vật nội sinh có hoạt tính kháng sinh học nổi trội.
5. Tổng hợp, đánh giá kết quả và lập báo cáo khóa luận.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng: Mẫu rễ, thân, lá của cây cỏ hôi (Ageratum conyzoides L.) sinh trưởng tự nhiên, không sâu bệnh; các chủng vi khuẩn chỉ thị gây bệnh (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi, Staphylococcus aureus), vi khuẩn đa kháng sinh carbapenemase (Acinetobacter spp., Klebsiella spp.) và vi nấm gây bệnh ngoài da (Trichophyton rubrum).
• Phạm vi không gian: Phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh, Trường Đại học Mở TP. Hồ Chí Minh (Cơ sở 3, 68 Lê Thị Trung, TP. Thủ Dầu Một, tỉnh Bình Dương). Mẫu thực vật thu hái tại TP. Thủ Dầu Một (Bình Dương) và quận Thủ Đức (TP. Hồ Chí Minh). Chủng thử nghiệm đa kháng được tiếp nhận từ Khoa Xét nghiệm, Trường Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh.
• Phạm vi thời gian: Đề tài được triển khai từ tháng 10/2015 đến tháng 05/2016.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận được xây dựng dựa trên cơ sở lý thuyết về vi sinh vật nội sinh thực vật, đặc điểm thực vật học và dược lý của cây cỏ hôi họ Cúc, cùng đặc tính sinh học của các chủng vi sinh vật gây bệnh mục tiêu:

• Khung lý thuyết vi sinh vật nội sinh: Khái niệm "endophytic" chỉ các vi sinh vật tồn tại và phát triển bên trong các mô thực vật bậc cao mà không gây triệu chứng bệnh cho cây chủ (Li và cs., 2008; Tan và Zou, 2001). Vi sinh vật nội sinh được chia thành nội sinh bắt buộc và nội sinh tùy ý (Baldani và cs., 1997; Stoltzfus và cs.). Chúng có khả năng sinh tổng hợp nhiều chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính kháng khuẩn, kháng virus, chống nấm và hỗ trợ tăng trưởng thực vật (Strobel, 2003; Christina và cs., 2013).
• Phân loại thực vật học: Cây cỏ hôi có tên khoa học là Ageratum conyzoides L., thuộc chi Ageratum, họ Asteraceae (Compositae), bộ Asterales, lớp Magnoliopsida. Thành phần hóa học chứa nhiều hợp chất alkaloid, flavonoid, coumarin, dẫn xuất chromene và tinh dầu chứa precocene, beta-caryophyllene, demethoxy-ageratochromen.
• Vi sinh vật kiểm định: Gồm trực khuẩn Gram âm đường ruột và cơ hội (E. coli, P. aeruginosa, S. typhi), cầu khuẩn Gram dương (S. aureus), các chủng vi khuẩn bệnh viện sinh carbapenemase (Acinetobacter spp., Klebsiella spp.) và vi nấm sợi ký sinh da cạn Trichophyton rubrum (thuộc chi Trichophyton, họ Gymnoascaceae, bộ Plectascales).

Mẫu cây cỏ hôi (Rễ, Thân, Lá) 

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

1. Xử lý và khử trùng bề mặt mẫu: Mẫu rễ, thân, lá được rửa sạch dưới vòi nước chảy, tráng nước cất vô trùng, cắt thành đoạn nhỏ (1–2 cm đối với thân/rễ, $1 \times 1\text{ cm}$ đối với lá). Mẫu được khử trùng tuần tự bằng cồn $70^\circ$ trong 1 phút, dung dịch Sodium hypochlorite 2,5% trong 4 phút, tráng cồn trong 30 giây và rửa lại 4 lần bằng nước cất vô trùng (Costa và cs.). Nước rửa lần 4 được hút 200 µL trải lên đĩa TSA, ủ ở 37°C trong 24 giờ để kiểm tra vô trùng bề mặt.

2. Phân lập và làm thuần:

   • Vi khuẩn nội sinh: Mẫu sau xử lý được cấy đặt lên môi trường Trypticase Soy Agar (TSA), ủ ở 30°C trong 48 giờ. Các khuẩn lạc khác nhau được cấy ria nhiều lần trên thạch Nutrient Agar (NA) ở 28°C để làm thuần, sau đó bảo quản trên thạch nghiêng NA ở 4°C.
   • Vi nấm nội sinh: Phân lập trên môi trường Potato Dextrose Agar (PDA) bổ sung kháng sinh chloramphenicol 0,05%, bọc parafilm ủ ở $27 \pm 2^\circ\text{C}$. Cấy truyền sang PDA mới để thu nhận sợi nấm thuần khiết.

3. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính đối kháng:

   • Vi khuẩn nội sinh kháng vi khuẩn: Sử dụng kỹ thuật khuếch tán giếng thạch (well diffusion) trên môi trường NA/Mueller Hinton. Vi khuẩn nội sinh nuôi tăng sinh trong Nutrient Broth (NB) từ 3–5 ngày, ly tâm 8000 vòng/phút trong 15 phút thu dịch nổi; thử nghiệm đồng thời dịch nuôi cấy thô và dịch lọc qua màng lọc vi sinh 0,45 µm. Nồng độ vi khuẩn kiểm định được chuẩn hóa về mức $10^6\text{ CFU/mL}$ (tương đương chuẩn 0,5 McFarland pha loãng). Giếng thạch đường kính 7 mm được nạp 80–100 µL dịch thử nghiệm, ủ ở 37°C trong 18–24 giờ và đo đường kính vòng kháng khuẩn.
   • Vi khuẩn nội sinh kháng vi nấm T. rubrum: Trải dịch huyền phù nấm ($10^6\text{ CFU/mL}$, đo $\text{OD}_{530} = 0,08 - 0,12$ có chứa 0,05% Tween 80) lên môi trường PDA, nạp dịch khuẩn nội sinh vào giếng thạch 7 mm, ủ ở 25°C trong 5–7 ngày.
   • Vi nấm nội sinh kháng vi khuẩn: Dùng ống đục lấy khoanh thạch nấm (đường kính 7 mm từ đĩa nấm 7–12 ngày tuổi trên PDA) đặt lên đĩa thạch NA đã trải vi khuẩn gây bệnh, ủ 37°C/24 giờ; vòng ức chế $> 9\text{ mm}$ được ghi nhận là dương tính (Powthong, 2013).
   • Vi nấm nội sinh kháng nấm bệnh T. rubrum: Dùng phương pháp nuôi cấy kép (dual culture) trên môi trường PDA. Hút 10 µL dịch nấm nội sinh và 10 µL dịch nấm bệnh ($1 - 2 \times 10^8\text{ CFU/mL}$) cấy vào 2 điểm cách nhau 50 mm, ủ ở 30°C trong 10 ngày để tính hiệu suất ức chế $I (%)$.

4. Phương pháp định danh sinh hóa: Tiến hành định danh các chủng vi khuẩn nội sinh tiềm năng theo khóa phân loại Cowan và Steel (Feltham và Barrow, 1993) qua hệ thống chỉ tiêu sinh hóa: nhuộm Gram, phản ứng catalase ($H_2O_2\text{ 5%}$), khảo sát khả năng di động trên môi trường thạch bán lỏng bổ sung TTC 1%, khả năng sinh trưởng ở 50°C, khả năng chịu muối 10% NaCl, hô hấp kỵ khí trong thạch sâu, khả năng sử dụng nguồn carbon (Glucose, Mannose, D-Xylose, Salicin, D-Cellobiose, D-Melibiose, Raffinose), thử nghiệm Simmon's Citrate, thử nghiệm Urease, phản ứng Indol (thuốc thử Kovac's), phản ứng Voges-Proskauer (VP), phản ứng khử Nitrate thành Nitrite (thuốc thử Gress A, Gress B và bột kẽm), thử nghiệm thủy phân tinh bột (amylase) và casein.

5. Xử lý số liệu: Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại ($n=3$). Số liệu được tính toán trung bình, sai số chuẩn ($\text{Mean} \pm \text{SE}$) và xử lý phương sai ANOVA một yếu tố bằng phần mềm Microsoft Excel 2010 và Statgraphics Plus 3.0.

---

Nội dung chính theo từng phần của khóa luận

Phần 1: Tổng quan tài liệu

Tác giả hệ thống hóa các công trình nghiên cứu cơ bản về vi sinh vật nội sinh và cây cỏ hôi:

• Tổng kết vai trò sinh thái và tiềm năng ứng dụng của vi sinh vật nội sinh trong nông nghiệp (kiểm soát sinh học bệnh rụng lá cao su - Gazis và cs., 2009) và y dược (sản xuất kháng sinh, kháng oxy hóa, chống ung thư - Christina và cs., 2013).
• Phân tích các nghiên cứu thành phần hóa học của cây cỏ hôi tại Việt Nam (Nguyễn Xuân Dũng và cs. xác định 3 thành phần chính trong tinh dầu gồm beta-caryophyllene, demethoxy-ageratochromen và ageratochromen) và tác dụng ức chế miễn dịch, kháng histamin (Đỗ Bích Huy và cs., 2004).
• Điểm lại các nghiên cứu quốc tế về khả năng kháng khuẩn S. aureus từ dịch chiết cỏ hôi (Duradola, 1977; Almagboul và cs., 1985), tác dụng giãn cơ, giảm đau khớp (Achola và cs., 1994; Marques Neto và cs., 1988), cũng như hoạt tính diệt tuyến trùng và ức chế cỏ dại trong nông nghiệp (Shabana và cs., 1990; Jha và Dhakal, 1990).
• Tổng quan bệnh học về 6 nhóm vi khuẩn kiểm định (Acinetobacter, E. coli, Klebsiella, P. aeruginosa, S. typhi, S. aureus) và vi nấm gây bệnh ngoài da Trichophyton rubrum.

Phần 2: Vật liệu và phương pháp

Trình bày chi tiết danh mục hóa chất, môi trường nuôi cấy (NA, NB, PDA, SDA, TSA, Christensen's Urea, Simmon's Citrate...), thiết bị phòng thí nghiệm và quy trình thao tác chuẩn từ khâu xử lý mẫu thực vật, kỹ thuật nuôi cấy phân lập, quy trình đánh giá đối kháng đến các phản ứng sinh hóa phục vụ định danh vi khuẩn theo Cowan và Steel.

Phần 3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Chương này tập trung công bố và thảo luận các nhóm kết quả thực nghiệm:

• Giám định mẫu cây và kết quả phân lập: Xác nhận mẫu thực vật thu thập là loài Ageratum conyzoides L. Từ các bộ phận rễ, thân, lá của cây, đề tài đã phân lập thành công nhiều chủng vi khuẩn và vi nấm nội sinh trên môi trường chọn lọc TSA và PDA.

Đối tượng vi sinh vật	Môi trường phân lập	Điều kiện nuôi cấy	Bộ phận thực vật thu nhận
Vi khuẩn nội sinh	Trypticase Soy Agar (TSA)	$30^\circ\text{C}$, 48 giờ, có chiếu sáng	Rễ, Thân, Lá
Vi nấm nội sinh	Potato Dextrose Agar (PDA) + Chloramphenicol 0,05%	$27 \pm 2^\circ\text{C}$, bọc parafilm	Rễ, Thân, Lá

• Khảo sát hình thái đại thể và vi thể: Ghi nhận sự đa dạng về hình thái khuẩn lạc (màu sắc, kích thước, mép khuẩn lạc, độ lồi) và cấu trúc vi thể qua nhuộm Gram (trực khuẩn, cầu khuẩn, trạng thái bắt màu tím/hồng) đối với vi khuẩn; cấu trúc sợi nấm có vách ngăn, bào tử đính và màu sắc mặt trên/mặt dưới thạch đối với vi nấm.
• Hoạt tính đối kháng của vi khuẩn nội sinh: Các chủng vi khuẩn nội sinh (đặc biệt là chủng HL6 phân lập từ lá và HR2 phân lập từ rễ) thể hiện hoạt tính kháng khuẩn rõ rệt đối với các vi khuẩn gây bệnh kiểm định (E. coli, P. aeruginosa, S. aureus, S. typhi) và các chủng kháng kháng sinh sinh men carbapenemase (Acinetobacter spp., Klebsiella spp.). Hoạt tính được duy trì cả ở dạng dịch nuôi cấy toàn phần và dịch lọc qua màng 0,45 µm, chứng minh hoạt chất kháng sinh được tiết ngoại bào. Chủng vi khuẩn nội sinh cũng tạo vòng ức chế sự phát triển của vi nấm Trichophyton rubrum.
• Hoạt tính đối kháng của vi nấm nội sinh: Các chủng vi nấm nội sinh (tiêu biểu như H3, H5) thể hiện khả năng kháng vi khuẩn sinh carbapenemase trên phương pháp khoanh thạch và đạt tỷ lệ ức chế sinh trưởng cao đối với nấm bệnh Trichophyton rubrum trên môi trường nuôi cấy kép.
• Kết quả định danh chủng vi khuẩn HR2 và HL6: Căn cứ vào khóa phân loại sinh hóa Cowan và Steel, hai chủng có hoạt tính đối kháng mạnh nhất được định danh chi tiết qua các phản ứng:

Phép thử nghiệm sinh hóa	Chủng vi khuẩn HL6 (Lá)	Chủng vi khuẩn HR2 (Rễ)	Ý nghĩa sinh hóa
Nhuộm Gram & Hình thái	Trực khuẩn	Trực khuẩn	Phân loại cấu trúc vách tế bào
Phản ứng Catalase	Dương tính (+)	Dương tính (+)	Thủy phân $H_2O_2$ giải phóng $O_2$
Khả năng di động (TTC 1%)	Khảo sát thực nghiệm	Khảo sát thực nghiệm	Xác định tiêm mao di động
Mọc ở 50°C & 10% NaCl	Dương tính (+)	Dương tính (+)	Thử sức chịu nhiệt và nồng độ muối cao
Khả năng hô hấp kỵ khí	Thạch sâu	Thạch sâu	Phân biệt hiếu khí / kỵ khí tùy nghi
Lên men đường (Glucose, Mannose, Xylose...)	Đổi màu phenol red	Đổi màu phenol red	Khả năng sử dụng các nguồn carbon
Simmon's Citrate	Chuyển màu xanh	Chuyển màu xanh	Sử dụng citrate làm nguồn carbon duy nhất
Urease	Khảo sát thực nghiệm	Khảo sát thực nghiệm	Phân giải urea sinh $NH_3$
Phản ứng VP & Nitrate	Đổi màu đặc trưng	Đổi màu đặc trưng	Tạo acetyl methyl carbinol / Khử $NO_3^-$
Thủy phân Amylase & Casein	Tạo vòng phân giải	Tạo vòng phân giải	Khả năng tiết enzyme ngoại bào

Phần 4: Kết luận và đề nghị

Đánh giá tổng quan hiệu quả phân lập, khẳng định cỏ hôi là nguồn cư trú phong phú của các chủng vi khuẩn và vi nấm nội sinh có khả năng sinh chất kháng sinh chống lại vi khuẩn đa kháng và nấm da; kiến nghị các định hướng nghiên cứu sâu hơn về tinh sạch hợp chất.

---

Kết quả và đóng góp

Kết quả chính

• Đã phân lập và làm thuần thành công tập hợp các chủng vi khuẩn và vi nấm nội sinh từ các bộ phận rễ, thân, lá của cây cỏ hôi (Ageratum conyzoides L.) khỏe mạnh thu hái tại Bình Dương và TP. Hồ Chí Minh.
• Đánh giá được phổ kháng khuẩn và kháng nấm của các chủng phân lập:
  • Các chủng vi khuẩn nội sinh (tiêu biểu như HL6 từ lá và HR2 từ rễ) có hoạt tính ức chế mạnh đối với các vi khuẩn kiểm định (E. coli, P. aeruginosa, S. typhi, S. aureus), ức chế các chủng vi khuẩn kháng thuốc sinh carbapenemase (Acinetobacter spp., Klebsiella spp.) và ức chế nấm da Trichophyton rubrum.
  • Chứng minh được hoạt tính đối kháng tồn tại trong dịch lọc qua màng 0,45 µm của vi khuẩn nội sinh, khẳng định các hợp chất kháng sinh được tiết ra môi trường ngoại bào.
  • Tuyển chọn được các chủng vi nấm nội sinh (như H3, H5) có khả năng đối kháng với vi khuẩn sinh carbapenemase và ức chế vi nấm T. rubrum trong thử nghiệm nuôi cấy kép.
• Định danh được đặc tính sinh học, hình thái và bộ chỉ tiêu sinh hóa hoàn chỉnh của hai chủng vi khuẩn nội sinh tiềm năng nhất (HL6 và HR2) theo khóa phân loại Cowan và Steel.

Đề xuất và kiến nghị của tác giả

• Tiếp tục nghiên cứu định danh chính xác các chủng vi sinh vật nội sinh tiềm năng (HR2, HL6, H3, H5) ở cấp độ loài bằng phương pháp sinh học phân tử (giải trình tự gen 16S rRNA đối với vi khuẩn và vùng ITS đối với vi nấm).
• Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy (thành phần môi trường, pH, nhiệt độ, thời gian lên men) nhằm nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp hợp chất kháng sinh.
• Tiến hành chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc hóa học các hợp chất kháng sinh ngoại bào có trong dịch nuôi cấy của các chủng nội sinh này.

Đóng góp của đề tài

• Cung cấp dẫn liệu khoa học thực nghiệm đầu tiên về thành phần và hoạt tính sinh học của hệ vi sinh vật nội sinh sống trong cây cỏ hôi (Ageratum conyzoides L.) tại khu vực phía Nam Việt Nam.
• Mở rộng nguồn tài nguyên vi sinh vật hữu ích có khả năng đối kháng với các chủng vi khuẩn sinh enzyme carbapenemase — nhóm tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện có mức độ kháng thuốc rất cao.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế

• Mức độ định danh vi sinh vật trong phạm vi khóa luận mới dừng lại ở việc quan sát hình thái đại thể, vi thể và thực hiện các thử nghiệm sinh hóa theo khóa Cowan và Steel, chưa thực hiện giải trình tự sinh học phân tử (16S rRNA / ITS).
• Chưa tiến hành phân tách, tinh sạch và định danh cấu trúc hóa học cụ thể của các hợp chất kháng khuẩn/kháng nấm trong dịch lọc nuôi cấy.
• Các thử nghiệm hoạt tính mới thực hiện in vitro (trong điều kiện phòng thí nghiệm), chưa đánh giá độc tính tế bào và hiệu lực in vivo trên mô hình động vật thực nghiệm.

Hướng nghiên cứu mở rộng

• Ứng dụng kỹ thuật PCR và giải trình tự gen để định danh chính xác tên loài của các chủng vi khuẩn (HR2, HL6) và vi nấm (H3, H5).
• Nghiên cứu động học quá trình lên men và các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh chất kháng sinh của chủng vi khuẩn nội sinh.
• Sử dụng các phương pháp sắc ký (HPLC, GC-MS) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) để cô lập, phân tích bản chất hóa học của các phân tử có hoạt tính đối kháng.

---

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo chuyên ngành hữu ích cho:

• Sinh viên, học viên ngành Công nghệ Sinh học, Vi sinh vật học, Dược học: Cung cấp quy trình thực nghiệm chuẩn về kỹ thuật phân lập vi sinh vật nội sinh thực vật, phương pháp khử trùng bề mặt mô thực vật nhiều bước và quy trình kiểm tra vô trùng mẫu.
• Người nghiên cứu về chất kháng sinh tự nhiên: Cung cấp phương pháp luận và kỹ thuật đánh giá hoạt tính kháng khuẩn giếng thạch, nuôi cấy kép đối kháng nấm và hệ thống 14 phép thử sinh hóa chuẩn theo khóa Cowan & Steel.
• Các phòng thí nghiệm nghiên cứu vi sinh y học và nông nghiệp: Cung cấp cơ sở dữ liệu về hoạt tính ức chế vi khuẩn sinh carbapenemase và nấm Trichophyton rubrum từ nguồn vi sinh vật nội sinh cây cỏ hôi.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Cây cỏ hôi được xử lý và khử trùng bề mặt bằng những hóa chất nào trước khi phân lập?

Quy trình khử trùng bề mặt mẫu gồm các bước: rửa sạch mẫu rễ, thân, lá dưới vòi nước và nước cất vô trùng, sau đó khử trùng tuần tự bằng cồn $70^\circ$ trong 1 phút, dung dịch sodium hypochlorite 2,5% trong 4 phút, tráng cồn trong 30 giây và rửa lại 4 lần bằng nước cất vô trùng. Hiệu quả khử trùng bề mặt được kiểm tra bằng cách lấy 200 µL nước rửa lần cuối trải lên đĩa TSA và ủ ở 37°C trong 24 giờ không thấy khuẩn lạc mọc.

2. Các môi trường dinh dưỡng chính nào đã được sử dụng trong quá trình phân lập và thử nghiệm?

Khóa luận sử dụng môi trường Trypticase Soy Agar (TSA) để phân lập vi khuẩn nội sinh; Potato Dextrose Agar (PDA) bổ sung chloramphenicol 0,05% để phân lập và nuôi cấy vi nấm; Nutrient Agar (NA) và Nutrient Broth (NB) để nuôi cấy làm thuần, tăng sinh vi khuẩn và thử nghiệm kháng khuẩn; Sabouraud Dextrose Agar (SDA) để hoạt hóa vi nấm kiểm định; cùng các môi trường sinh hóa như Simmon's Citrate, Christensen's Urea, Clark-Lubs, Nitrate Agar, môi trường thạch tinh bột và môi trường bán lỏng bổ sung TTC 1%.

3. Phương pháp nào được dùng để kiểm tra khả năng đối kháng của vi khuẩn nội sinh với vi khuẩn gây bệnh?

Đề tài sử dụng phương pháp khuếch tán giếng thạch trên môi trường NA. Dịch vi khuẩn nội sinh sau 3–5 ngày nuôi cấy trong NB được ly tâm 8000 vòng/phút trong 15 phút (thu dịch nổi) và lọc qua màng vi sinh 0,45 µm (thu dịch lọc). Dịch được nạp vào giếng thạch đường kính 7 mm (80–100 µL/giếng) trên đĩa thạch đã trải sẵn vi khuẩn gây bệnh ở mật độ chuẩn $10^6\text{ CFU/mL}$, ủ ở 37°C trong 18–24 giờ để xác định đường kính vòng kháng khuẩn.

4. Đề tài đã khảo sát hoạt tính đối kháng trên những nhóm vi sinh vật gây bệnh nào?

Đề tài khảo sát trên 3 nhóm tác nhân gây bệnh:

1. Vi khuẩn gây bệnh thông thường: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi, Staphylococcus aureus.
2. Vi khuẩn đa kháng thuốc sinh enzyme carbapenemase: Acinetobacter spp., Klebsiella spp.
3. Vi nấm gây bệnh ngoài da ở người: Trichophyton rubrum.

5. Hai chủng vi khuẩn nội sinh tiềm năng nhất (HL6 và HR2) được định danh dựa trên cơ sở nào?

Chủng HL6 (phân lập từ lá) và HR2 (phân lập từ rễ) được định danh dựa trên đặc điểm hình thái tế bào (nhuộm Gram) và hệ thống các thử nghiệm sinh hóa theo khóa phân loại Cowan và Steel, bao gồm: thử nghiệm catalase, khả năng di động trên thạch bán lỏng TTC, khả năng phát triển ở 50°C và 10% NaCl, hô hấp kỵ khí thạch sâu, khả năng lên men các loại đường (Glucose, Mannose, Xylose, Salicin, Cellobiose, Melibiose, Raffinose), sử dụng citrate, urease, phản ứng Indol, VP, khử nitrate, phân giải casein và amylase.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Phạm Thị Ngọc Phượng đã thực hiện phân lập, làm thuần và xây dựng thành công bộ sưu tập vi sinh vật nội sinh (vi khuẩn và vi nấm) từ các bộ phận rễ, thân, lá của cây cỏ hôi (Ageratum conyzoides L.). Nghiên cứu đã chứng minh các chủng vi khuẩn nội sinh (tiêu biểu là HL6 và HR2) và vi nấm nội sinh (H3, H5) có khả năng sinh các hoạt chất kháng sinh ngoại bào ức chế hiệu quả nhiều chủng vi khuẩn gây bệnh, vi khuẩn sinh carbapenemase và nấm da Trichophyton rubrum. Đồng thời, đề tài đã hoàn thành việc xác định đặc tính hình thái và định danh sinh hóa chi tiết cho các chủng vi khuẩn có hoạt tính cao theo khóa phân loại Cowan và Steel, tạo tiền đề khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo về sàng lọc và khai thác kháng sinh tự nhiên.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ SVTT: PHẠM THỊ NGỌC PHƯỢNG 1 BÁ O CÁ O KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Bệnh nhiễm trùng là một trong những nguyên nhân hàng đầu mắc phải và tử vong trên toàn thế giới, đặc biệt là ở các nước phát triển (Zeigler, 2005; Yala và cs, 2001). Vào thế kỉ XX, kháng sinh đã trở thành một trong những thứ vũ khí hữu hiệu nhất trong việc chống lại vi khuẩn và các bệnh nhiễm khuẩn do chúng gây ra. Theo tổ chức y tế thế giới (WHO) hơn 80% dân số thế giới dựa trên y học cổ truyền để đáp ứng nhu cầu chăm sóc sức khỏe cho chính mình (Vashist và Jindal, 2012) đặc biệt là trong điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn, vi nấm gây ra. Vấn đề hiện nay là vi sinh vật kháng thuốc và đa kháng thuốc ngày càng phổ biến và nghiêm trọng.

Vì vậy, việc tìm ra nguồn thuốc mới thay thế cho các thuốc đang sử dụng trở nên cấp thiết trong đó thực vật và vi sinh vật nội sinh là những nguồn đầy tiềm năng đang được quan tâm. Vi sinh vật nội sinh thực vật được tìm thấy trong hầu hết các loài thực vật, chúng cư trú ở trong mô của thực vật và giữa chúng hình thành một loạt các mối quan hệ khác nhau như cộng sinh tương hỗ, cộng sinh dinh dưỡng, hội sinh (Compant và cs. Và một số nghiên cứu trước đây đã cho thấy rằng, vi sinh vật nội sinh cây dược liệu có khả năng sinh ra các chất có khả năng ứng dụng để sản xuất kháng sinh, đó là nguồn chất kháng khuẩn, kháng nấm có tiềm năng quan trọng dùng cho việc phòng trị các loại vi nấm và vi khuẩn gây bệnh (Ryan và cs, 2008). Cây cỏ hôi (Ageratum conyzoides) là dược liệu phổ biến ở nước ta.

Các công trình nghiên cứu về tác dụng dược lý của cây cỏ hôi cho thấy loài cây này có tác dụng kháng viêm, kháng khuẩn, làm giảm đau và hạ sốt. Năm 1965, Điều Ngọc Thực ở Phú Thọ đã ứng dụng cây cỏ hôi chữa viêm xoang mũi dị ứng cho bản thân và một số người khác thấy có kết quả tốt. Trên cơ sở thực tế kết quả lâm sàng, Đoàn Thị Nhu và cộng sự (1975) đã xác định độc tính cấp LD-50 bằng đường uống là 82g/kg. Với liều độ bán mãn dùng trong 30 ngày không thấy gây những biến đổi bất thường đối với các hằng số sinh hóa trong một số xét nghiệm về chức năng gan và thận.

Từ những lợi ích nêu trên của cây cỏ hôi và các ứng dụng rộng lớn của vi sinh vật nội sinh, nên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “PHÂN LẬP VI SINH VẬT NỘI SINH TỪ CÂY CỎ HÔI (AGERATUM CONYZOIDES) VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG VỚI MỘT SỐ VI SINH VẬT GÂY BỆNH” SVTT: PHẠM THỊ NGỌC PHƯỢNG 2 BÁ O CÁ O KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Mục tiêu: Tạo ra bộ sưu tập vi sinh vật nội sinh cây dược liệu Ageratum conyzoides có khả năng đối kháng với một số vi sinh vật gây bệnh. Nội dung thực hiện đề tài: Thu thập mẫu cây dược liệu (lá, thân cây cỏ hôi). Phân lập và làm thuần các vi sinh vật nội sinh phân lập được trên cây dược liệu. Khảo sát khả năng đối kháng với một số vi sinh vật gây bệnh.

Định danh những chủng vi sinh vật nội sinh. Kết luận, nhận xét, đánh giá kết quả và viết báo cáo. SVTT: PHẠM THỊ NGỌC PHƯỢNG 3 BÁ O CÁ O KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU SVTT: PHẠM THỊ NGỌC PHƯỢNG 4 BÁ O CÁ O KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 1. SƠ LƯỢC VỀ VI SINH VẬT NỘI SINH 1.