Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu
Bệnh tim mạch (CVDs) là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới, chiếm khoảng 30% tổng số ca tử vong toàn cầu. Theo số liệu của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), năm 2016 có khoảng 17,9 triệu người tử vong do bệnh tim mạch, trong đó biến cố nhồi máu cơ tim và đột quỵ chiếm tới 85%. Tại Việt Nam, đột quỵ chiếm 21,7% tổng số ca tử vong (WHO, 2005). Nồng độ cholesterol trong máu tăng cao, đặc biệt là LDL-cholesterol (lipoprotein tỷ trọng thấp), là yếu tố nguy cơ trực tiếp thúc đẩy quá trình hình thành mảng xơ vữa động mạch, dẫn đến hẹp lòng mạch và tăng nguy cơ tai biến. Khảo sát năm 2015 cho thấy tỷ lệ người Việt Nam trong độ tuổi 25–64 có hàm lượng cholesterol máu cao chiếm tới 32%.
Mặc dù các nhóm thuốc ức chế tổng hợp cholesterol như Statin được sử dụng phổ biến trong điều trị lâm sàng, việc dùng thuốc dài ngày có thể gây ra nhiều tác dụng phụ không mong muốn như rối loạn tiêu hóa, đau cơ, tăng men gan, suy giảm trí nhớ và tạo gánh nặng kinh tế cho người bệnh. Do đó, việc ứng dụng các chủng vi khuẩn lactic (Lactic Acid Bacteria - LAB) có hoạt tính enzyme Bile Salt Hydrolase (BSH) và khả năng hấp phụ/liên kết cholesterol qua bề mặt màng tế bào đang được quan tâm nghiên cứu như một giải pháp sinh học an toàn nhằm hỗ trợ kiểm soát cholesterol máu.
Mục tiêu nghiên cứu:
Phân lập và tuyển chọn được một số chủng vi khuẩn lactic từ sữa mẹ và phân su có khả năng loại bỏ cholesterol, làm cơ sở khoa học cho các nghiên cứu ứng dụng tạo chế phẩm sinh học probiotic.
Nhiệm vụ nghiên cứu (5 nội dung thực hiện):
- Thu thập mẫu và phân lập các chủng vi khuẩn lactic từ nguồn phân su và sữa mẹ.
- Khảo sát khả năng chịu acid, dung nạp muối mật (Oxgall) và acid mật (Cholic acid, Taurocholic acid).
- Định tính khả năng sinh tổng hợp enzyme Bile Salt Hydrolase (BSH).
- Khảo sát khả năng loại bỏ cholesterol thông qua cơ chế liên kết bề mặt tế bào (định tính bằng SEM và định lượng bằng HPLC).
- Định danh phân tử xác định tên chủng vi khuẩn tiềm năng dựa trên đoạn gen 16S rRNA.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:
- Đối tượng nghiên cứu: Các chủng vi khuẩn lactic phân lập từ 30 mẫu lâm sàng (gồm 15 mẫu phân su và 15 mẫu sữa mẹ).
- Địa điểm thu mẫu: Khoa Hậu sản, Bệnh viện Nguyễn Tri Phương, Thành phố Hồ Chí Minh.
- Thời gian và địa điểm thực hiện: Từ tháng 03/2023 đến tháng 07/2023 tại Phòng Công nghệ sinh học Thực phẩm, Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp
Khung lý thuyết và cơ chế chuyển hóa
- Đặc điểm vi khuẩn lactic: Là nhóm vi sinh vật Gram dương, không tạo bào tử, phản ứng Catalase và Oxydase âm tính, kị khí tùy ý, có khả năng lên men chuyển hóa carbohydrate thành acid lactic, cư trú tự nhiên trong đường ruột người và có độ an toàn sinh học cao.
- Cơ chế giảm cholesterol của enzyme BSH: BSH (EC 3.5.1.24) là enzyme nội bào xúc tác phản ứng khử liên hợp của muối mật (glycine/taurine-conjugated bile salts) trong chu trình tuần hoàn ruột - gan (Enterohepatic Circulation - EHC). Acid mật tự do sau khi khử liên hợp có độ hòa tan kém, ít được tái hấp thu ở hồi tràng và bị đào thải qua phân. Để bù đắp lượng mật hao hụt, gan phải tăng cường huy động cholesterol nội sinh để tổng hợp acid mật mới, làm giảm nồng độ cholesterol trong huyết thanh.
- Cơ chế liên kết màng tế bào: Khung peptidoglycan và các thành phần lipid trên màng tế bào vi khuẩn lactic có khả năng liên kết vật lý hoặc đồng hóa cholesterol vào cấu trúc màng trong quá trình tăng trưởng, hỗ trợ loại bỏ trực tiếp cholesterol khỏi môi trường tiêu hóa.
Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm
- Phân lập và tuyển chọn sinh hóa: Phân lập vi khuẩn theo phương pháp pha loãng trên đĩa thạch De Man, Rogosa and Sharpe (MRS) có bổ sung 1% $\text{CaCO}_3$, ủ kị khí ở 37°C trong 24–48 giờ (hệ thống GasPak). Đánh giá khả năng sinh acid qua vòng tan $\text{CaCO}_3$, kiểm tra hình thái qua nhuộm Gram, thử nghiệm Catalase bằng dung dịch $\text{H}_2\text{O}_2$ 3% và thử nghiệm Oxydase bằng giấy lọc tẩm hóa chất chỉ thị.
- Định tính enzyme BSH: Phương pháp khuếch tán trực tiếp trên đĩa thạch MRS có bổ sung 0,5% muối natri taurodeoxycholate (hoặc natri taurocholate) và 0,37 g/L $\text{CaCl}_2$, ủ kị khí ở 37°C trong 72 giờ. Phản ứng dương tính được xác định khi xuất hiện vòng kết tủa trắng xung quanh khuẩn lạc.
- Khảo sát khả năng chịu acid: Nuôi cấy tế bào trong môi trường MRS lỏng được điều chỉnh về pH 2,0 bằng HCl (đối chứng pH 6,8), ủ kị khí 37°C trong 4 giờ. Đo mật độ quang $\text{OD}_{620}$ ở các thời điểm 0, 1, 2, 4 giờ và tính tỷ lệ sống sót (%) dựa trên mật độ khuẩn (CFU/ml).
- Khảo sát khả năng dung nạp muối mật: Đánh giá độ bền sinh trưởng của vi khuẩn trong môi trường MRS có bổ sung 0,3% Oxgall, 0,3% Cholic acid (CA) hoặc 0,3% Taurocholic acid (TCA) ở các mốc thời gian 0, 6, 20 giờ nuôi cấy.
- Định tính liên kết cholesterol bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM): Tế bào vi khuẩn nuôi trong môi trường có và không bổ sung 100 mg/L cholesterol được thu sinh khối, cố định mẫu với glutaraldehyde 20% và osmic acid 1%, khử nước qua thang cồn (30°, 50°, 70°, cồn tuyệt đối), phủ khí argon và quan sát bề mặt trên hệ thống SEM ZEISS (Đức).
- Định lượng cholesterol bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): Nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường chứa 300 µg/ml cholesterol trong 36 giờ. Sinh khối sau đông khô được xà phòng hóa (12% KOH trong cồn ở 80°C), chiết bằng Butyl Hydroxy Toluen (BHT)/n-Hexan và phân tích trên hệ thống HPLC với cột silica ($4{,}6 \times 250\text{ mm}$, cỡ hạt $5\text{ }\mu\text{m}$), đầu dò UV-VIS ở bước sóng 202 nm, tốc độ dòng 1 ml/phút.
- Định danh phân tử 16S rRNA: Tách chiết DNA tổng số bằng bộ kít QIAquick PCR Purification. Khuếch đại gen 16S rRNA bằng cặp mồi chuyên biệt 20F (5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3') và 1500R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'). Điện di kiểm tra trên gel agarose 1,5%, giải trình tự Sanger, so sánh mức độ tương đồng trên cơ sở dữ liệu GenBank (NCBI) bằng công cụ BLAST và thiết lập cây phát sinh loài bằng phần mềm MEGA 6.
Nội dung chính theo từng chương
Chương 1: Mở đầu
Chương này tổng quan về tính cấp thiết của việc tìm kiếm các giải pháp sinh học phòng ngừa bệnh tim mạch và kiểm soát tăng cholesterol máu. Trình bày chi tiết mục tiêu nghiên cứu nhằm phân lập, sàng lọc và tuyển chọn các chủng LAB có hoạt tính BSH và khả năng loại bỏ cholesterol từ mẫu phân su và sữa mẹ; đồng thời liệt kê 5 nội dung thực nghiệm cụ thể làm khung định hướng cho toàn bộ đề tài.
Chương 2: Tổng quan tài liệu
Tác giả hệ thống hóa các kiến thức lý thuyết về phân loại vi khuẩn lactic theo khóa phân loại Bergey (1994); cấu trúc phân tử và con đường sinh tổng hợp cholesterol qua chu trình Mevalonate; vai trò sinh lý của muối mật trong hệ tiêu hóa và tuần hoàn ruột - gan. Chương này làm rõ 3 cơ chế làm giảm cholesterol của LAB gồm:
- Hoạt tính thủy phân giải phóng acid mật tự do của enzyme BSH (chứa gốc Cys-1 ở đầu N);
- Cơ chế hấp phụ và gắn kết cholesterol lên bề mặt thành tế bào peptidoglycan;
- Khả năng chuyển hóa cholesterol thành coprostanol đào thải qua phân.
Đồng thời, chương 2 tổng hợp các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế về vi khuẩn sinh BSH (như các nghiên cứu của Gilliland, Liong & Shah, O'Flaherty, La Thị Lan Anh, Nguyễn Minh Thái).
Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Mô tả chi tiết nguồn gốc 30 mẫu lâm sàng thu nhận tại Bệnh viện Nguyễn Tri Phương và quy trình bảo quản ở 4°C. Trình bày các bước thao tác chuẩn cho từng quy trình thực nghiệm: từ kỹ thuật phân lập trên môi trường chọn lọc MRS có $\text{CaCO}_3$, định tính enzyme BSH trên đĩa thạch natri taurodeoxycholate/taurocholate, khảo sát khả năng sống sót ở pH 2,0 và các nồng độ muối mật 0,3%, quy trình chuẩn bị tiêu bản chụp SEM ZEISS, điều kiện chạy sắc ký HPLC định lượng cholesterol, đến phản ứng chu nhiệt PCR khuếch đại đoạn gen 16S rRNA (~1500 bp) và xử lý dữ liệu phát sinh loài.
Chương 4: Kết quả và thảo luận
- Phân lập và đặc điểm hình thái: Từ 30 mẫu ban đầu đã phân lập được 10 chủng vi khuẩn (ký hiệu PS06, PS19, PS22, PS24, PS26 từ phân su; SMB17, SMB33, SMB34, SMB41, SMB58 từ sữa mẹ). Toàn bộ 10 chủng đều là vi khuẩn Gram dương, hình cầu hoặc que, Catalase (-), Oxydase (-) và tạo vòng tan $\text{CaCO}_3$.
- Khả năng sinh BSH: Sàng lọc định tính ghi nhận 5/10 chủng (PS19, PS22, PS24, SMB33, SMB58) tạo vòng kết tủa trắng đặc trưng trên môi trường chứa muối mật.
- Khả năng dung nạp muối mật và acid:
- Trong môi trường bổ sung 0,3% Oxgall, sau 20 giờ nuôi cấy, các chủng SMB33, PS22, PS24 và PS19 duy trì mật độ tế bào cao, đạt xấp xỉ hoặc vượt $10^8\text{ CFU/ml}$ (tăng từ 0,8 đến 0,61 log CFU/ml sau 6 giờ).
- Trong môi trường acid pH 2,0 sau 4 giờ, các chủng đều duy trì tỷ lệ sống sót từ 94% trở lên, trong đó các chủng SMB34, SMB33 và PS24 đạt tỷ lệ sống sót lên tới 99%.
- Khảo sát dung nạp acid mật đơn lẻ cho thấy các chủng sinh trưởng trong môi trường 0,3% Taurocholic acid (TCA) tốt hơn đáng kể so với 0,3% Cholic acid (CA). Chủng SMB33 đạt mật độ $8{,}68\text{ log CFU/ml}$ sau 20 giờ trong môi trường TCA.
- Định tính và định lượng loại bỏ cholesterol: Ảnh chụp kính hiển vi điện tử quét (SEM) trên 4 chủng ưu tú (SMB33, PS19, PS22, PS24) xác nhận sự hiện diện rõ rệt của các hạt cholesterol bám dày đặc trên bề mặt tế bào so với mẫu đối chứng. Phân tích HPLC cho thấy chủng SMB33 có khả năng loại bỏ cholesterol cao nhất, đạt $107{,}33\text{ }\mu\text{g/ml}$ sau 36 giờ nuôi cấy (vượt trội so với PS19 đạt $36{,}33\text{ }\mu\text{g/ml}$, PS22 đạt $34{,}38\text{ }\mu\text{g/ml}$, PS24 đạt $43{,}58\text{ }\mu\text{g/ml}$).
- Định danh phân tử: Sản phẩm PCR gen 16S rRNA của chủng SMB33 cho vạch điện di kích thước xấp xỉ 1500 bp. Kết quả giải trình tự và BLAST trên GenBank cho thấy trình tự gen của chủng SMB33 tương đồng 100% với loài Enterococcus faecalis (chủng tham chiếu FEMAM086).
Chương 5: Kết luận và đề nghị
Đưa ra kết luận tổng hợp về 10 chủng LAB phân lập được và khẳng định chủng Enterococcus faecalis SMB33 là chủng tiềm năng nhất đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn in vitro về hoạt tính BSH, sức chống chịu điều kiện tiêu hóa giả định và khả năng loại bỏ cholesterol. Tác giả đề xuất các hướng thử nghiệm in vivo tiếp theo trên mô hình động vật.
Kết quả và đóng góp
Số liệu thực nghiệm chính
| Tên chủng |
Nguồn phân lập |
Hình thái tế bào |
Hoạt tính BSH |
Tỷ lệ sống sót sau 4h ở pH 2,0 (%) |
Mật độ sau 20h trong 0,3% Oxgall (log CFU/ml) |
Mật độ sau 20h trong 0,3% TCA (log CFU/ml) |
Lượng cholesterol loại bỏ qua HPLC ($\mu\text{g/ml}$) |
| PS06 |
Phân su |
Cầu khuẩn, cụm nhỏ |
(-) |
95 |
$7{,}54 \pm 0{,}02$ |
- |
- |
| PS19 |
Phân su |
Cầu khuẩn, song cầu/cụm |
(+) |
95 |
$7{,}90 \pm 0{,}03$ |
$8{,}00 \pm 0{,}01$ |
36,33 |
| PS22 |
Phân su |
Cầu khuẩn, liên cầu/song cầu |
(+) |
94 |
$8{,}04 \pm 0{,}01$ |
$8{,}07 \pm 0{,}01$ |
34,38 |
| PS24 |
Phân su |
Cầu khuẩn, cụm nhỏ |
(+) |
99 |
$8{,}04 \pm 0{,}02$ |
$8{,}05 \pm 0{,}02$ |
43,58 |
| PS26 |
Phân su |
Cầu khuẩn, liên cầu/song cầu |
(-) |
95 |
$7{,}76 \pm 0{,}02$ |
- |
- |
| SMB17 |
Sữa mẹ |
Cầu khuẩn, độc lập/cụm |
(-) |
96 |
$7{,}69 \pm 0{,}04$ |
- |
- |
| SMB33 |
Sữa mẹ |
Cầu khuẩn, cụm nhỏ |
(+) |
99 |
$8{,}84 \pm 0{,}08$ |
$8{,}68 \pm 0{,}07$ |
107,33 |
| SMB34 |
Sữa mẹ |
Trực khuẩn, phân bố cặp |
(+) |
99 |
$7{,}36 \pm 0{,}08$ |
- |
- |
| SMB41 |
Sữa mẹ |
Cầu khuẩn, cụm |
(-) |
95 |
$7{,}74 \pm 0{,}01$ |
- |
- |
| SMB58 |
Sữa mẹ |
Cầu khuẩn, cụm |
(+) |
95 |
$7{,}71 \pm 0{,}06$ |
- |
- |
Đóng góp khoa học và giải pháp đề xuất
- Đóng góp của đề tài: Khóa luận đã phân lập và xác lập được bộ dữ liệu thực nghiệm in vitro hoàn chỉnh về các chủng vi khuẩn lactic có nguồn gốc từ người (phân su trẻ sơ sinh và sữa mẹ) tại Việt Nam. Đặc biệt, đã sàng lọc và định danh được chủng Enterococcus faecalis SMB33 sở hữu đồng thời hoạt tính BSH, khả năng chịu đựng pH 2,0 và muối mật cao, cùng năng lực liên kết loại bỏ $107{,}33\text{ }\mu\text{g/ml}$ cholesterol khỏi môi trường.
- Kiến nghị ứng dụng: Bổ sung chủng Enterococcus faecalis SMB33 vào ngân hàng chủng vi sinh vật hữu ích, làm vật liệu sinh học nền tảng cho việc nghiên cứu sản xuất các chế phẩm men vi sinh (probiotics) hỗ trợ giảm mỡ máu và phòng ngừa biến chứng tim mạch.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
-
Hạn chế:
- Nghiên cứu mới dừng lại ở phạm vi đánh giá in vitro trong phòng thí nghiệm; chưa tiến hành thử nghiệm in vivo trên mô hình động vật thực nghiệm (chuột, thỏ) để kiểm chứng sự biến động thực tế của nồng độ lipid huyết thanh và acid mật bài tiết qua phân.
- Chưa đánh giá tính an toàn sinh học chuyên sâu của loài Enterococcus faecalis (như khảo sát gen kháng kháng sinh, độc lực gây tan máu $\beta$ hoặc khả năng tạo màng sinh học sinh bệnh).
- Chưa tối ưu hóa các điều kiện lên men quy mô lớn và kỹ thuật vi bao bảo vệ tế bào vi khuẩn.
-
Hướng nghiên cứu tiếp:
- Triển khai các thử nghiệm in vivo đánh giá hiệu quả hạ cholesterol máu và đào thải muối mật của chủng SMB33 trên chuột thí nghiệm.
- Phân tích an toàn di truyền học đối với chủng Enterococcus faecalis SMB33.
- Nghiên cứu công nghệ tạo sinh khối và công thức tạo hạt vi bao nhằm nâng cao độ bền của tế bào vi khuẩn khi qua dịch vị dạ dày trước khi ứng dụng vào sản xuất chế phẩm probiotic.
Giá trị tham khảo
- Đối tượng tham khảo: Sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu thuộc các chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Vi sinh học thực phẩm, Hóa sinh học, Y Dược học và Công nghệ Thực phẩm.
- Nội dung có giá trị tham khảo cao:
- Quy trình phân lập và làm thuần LAB từ các nguồn mẫu sinh học người (sữa mẹ, phân su).
- Bộ phương pháp đánh giá sàng lọc đặc tính probiotic tiêu chuẩn: thử nghiệm đĩa thạch BSH với muối mật liên hợp, thử nghiệm động học sinh trưởng trong môi trường acid pH 2,0 và muối mật (Oxgall, Cholic acid, Taurocholic acid).
- Quy trình chuẩn bị mẫu cố định tiêu bản vi sinh vật phục vụ chụp ảnh hiển vi điện tử quét (SEM) quan sát tương tác bề mặt tế bào.
- Phương pháp xà phòng hóa và định lượng cholesterol trong sinh khối vi khuẩn bằng hệ thống sắc ký lỏng HPLC đầu dò UV-VIS ở bước sóng 202 nm.
Câu hỏi thường gặp
1. Các chủng vi khuẩn lactic trong nghiên cứu được phân lập từ nguồn mẫu nào và số lượng bao nhiêu?
Tác giả đã thu thập tổng cộng 30 mẫu lâm sàng từ Khoa Hậu sản của Bệnh viện Nguyễn Tri Phương (TP. Hồ Chí Minh), bao gồm 15 mẫu phân su và 15 mẫu sữa mẹ. Từ 30 mẫu này, 10 chủng vi khuẩn mang đặc tính của vi khuẩn lactic đã được phân lập thành công.
2. Có bao nhiêu chủng vi khuẩn thể hiện hoạt tính sinh enzyme Bile Salt Hydrolase (BSH)?
Qua thử nghiệm định tính khuếch tán trên đĩa thạch MRS có bổ sung 0,5% muối natri taurodeoxycholate/taurocholate và 0,37 g/L $\text{CaCl}_2$, có 5/10 chủng xuất hiện vòng kết tủa trắng xung quanh khuẩn lạc (dương tính với BSH), gồm các chủng: PS19, PS22, PS24, SMB33 và SMB58 (cùng với chủng SMB34 ghi nhận trong bảng sàng lọc).
3. Phương pháp nào được sử dụng để chứng minh cholesterol bám dính trực tiếp lên bề mặt tế bào vi khuẩn?
Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật kính hiển vi điện tử quét (SEM - Scanning Electron Microscope) của hãng ZEISS (Đức). Kết quả hình ảnh phóng đại cho thấy trên bề mặt tế bào của các chủng nuôi trong môi trường bổ sung 100 mg/L cholesterol (như chủng SMB33) xuất hiện các hạt nhỏ bám dày đặc trên màng tế bào, trong khi mẫu đối chứng không có hiện tượng này.
4. Chủng vi khuẩn nào có khả năng loại bỏ cholesterol cao nhất và hàm lượng định lượng được là bao nhiêu?
Chủng SMB33 (phân lập từ sữa mẹ) thể hiện khả năng loại bỏ cholesterol tốt nhất qua phân tích HPLC với hàm lượng $107{,}33\text{ }\mu\text{g/ml}$ sau 36 giờ nuôi cấy trong môi trường có bổ sung 300 µg/ml cholesterol, cao hơn rõ rệt so với các chủng PS24 ($43{,}58\text{ }\mu\text{g/ml}$), PS19 ($36{,}33\text{ }\mu\text{g/ml}$) và PS22 ($34{,}38\text{ }\mu\text{g/ml}$).
5. Kết quả định danh phân tử của chủng vi khuẩn ưu tú nhất trong đề tài cho kết quả như thế nào?
Chủng vi khuẩn SMB33 được giải trình tự đoạn gen 16S rRNA khuếch đại bằng cặp mồi 20F/1500R (kích thước ~1500 bp). Đối chiếu trên hệ thống cơ sở dữ liệu GenBank (NCBI) bằng công cụ BLAST cho thấy trình tự này tương đồng 100% với loài Enterococcus faecalis (chủng Enterococcus faecalis FEMAM086).
Kết luận
Khóa luận tốt nghiệp đã phân lập và sàng lọc thành công 10 chủng vi khuẩn lactic từ 30 mẫu phân su và sữa mẹ thu nhận tại Bệnh viện Nguyễn Tri Phương. Đề tài đã tuyển chọn và định danh được chủng Enterococcus faecalis SMB33 sở hữu khả năng dung nạp tốt acid dạ dày giả định (pH 2,0 sau 4 giờ đạt tỷ lệ sống sót 99%), kháng muối mật $0{,}3%$ Oxgall và Taurocholic acid, đồng thời có khả năng sinh enzyme BSH và liên kết loại bỏ $107{,}33\text{ }\mu\text{g/ml}$ cholesterol khỏi môi trường. Đây là nguồn chủng probiotic tiềm năng từ người, cung cấp cơ sở khoa học và nguồn vật liệu sinh học quan trọng cho các nghiên cứu in vivo và phát triển các sản phẩm hỗ trợ kiểm soát mỡ máu.
