Đặt vấn đề Theo tổ chức y tế thé giới (WHO), bệnh tim mạch (CDVs) đã, đang và sẽ là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong trên toàn thế giới. CDVs chiếm 30% ca tử vong trên thế giới, cướp đi sinh mạng của hàng triệu người mỗi năm. Ước tính năm 2016 có 17,9 triệu người tử vong do CDVs, trong đó nhồi máu cơ tim và đột quy là hai biến có chiếm đến 85% tổng số. Đột quy cũng là nguyên nhân chính gây tử vong ở Việt Nam, chiếm 21,7% (WHO, 2005) với tỷ lệ tử vong hàng năm là 150.
Hàm lượng cholesterol cao trong cơ thé từ lâu đã được ghi nhận là yếu tố làm gia tăng và đây nhanh quá trình xơ vữa động mạch (Bronner va ctv, 1995; Warlow va ctv, 1996; Gorelick và ctv, 1997) và tăng nguy cơ đột quy (Neaton va ctv, 1992). Lượng LDL — cholesterol tăng nhiều trong máu dẫn đến sự dé dàng lắng đọng ở thành mạch máu (nhất là ở tim và não) tạo nên các mảng xơ vữa động mạch. Mảng xơ vữa này làm thu hẹp các động mạch, khiến máu khó lưu thông hơn, nếu có sự hình thành cục máu đông làm máu ngừng lưu thông có thé dan đến cơn đau tim hoặc đột quy. Vào năm 2015, tỷ lệ người Việt Nam từ 25 đến 64 tuổi có hàm lượng cholesterol máu cao là 32% (Tuan và Hoang, 2018).
Nguyên nhân dẫn đến gia tăng lượng LDL — cholesterol trong máu chủ yếu đến từ yếu tô gia đình, chế độ dinh dưỡng, các thói quen có hại như hút thuốc lá, uống nhiều bia rượu, ít vận động và các bệnh lý liên quan như tăng huyết áp, đái tháo đường,. Hiện nay chiến lược điều trị dé hạn chế tăng cholesterol là thực hiện chế độ ăn uống lành mạnh, luyện tập thé dục thé thao kết hợp sử dụng dược lý. Statin là thuốc ức chế tổng hợp cholesterol được sử dụng rộng rãi trong điều trị tăng cholesterol máu, xơ vữa động mạch, giảm nguy cơ nhồi máu cơ tim nhưng nó cũng đem lại nhiều tác dụng phụ không mong muốn cho người điều trị như rối loạn tiêu hoá, suy thận, mắt trí nhớ, tiểu đường. Vào những năm 1970, sữa lên men có chứa chủng Lactobacillus hoang da đã được báo cáo có tác dụng hạ cholesterol trong máu người (Mann và Spoerry, 1974).
Ké từ đó, nhiều nghiên cứu đã được tiến hành trong điều kiện in vitro va in vivo dé khảo sát kha nang làm giảm cholesterol của các chủng vi khuẩn lactic (LAB). Điển hình là các chủng vi khuẩn lactic có khả năng làm giảm lượng cholesterol nhờ khả năng sinh enzyme bile salt hydrolase (BSH) và cơ chế giảm cholesterol thông qua liên kết với bề mặt tế bảo. Ở Việt Nam, hướng đi này vẫn chưa có nhiều nghiên cứu và chủ yếu chỉ ở dừng ở bước đánh giá in vitro, vì vậy cân có thêm nhiêu đánh giá invitro khác nham tạo nguồn chủng dé đánh giá in vivo và ứng dụng tạo các sản phâm probiotics hướng làm giảm cholesterol. Mục tiêu đề tài Phân lập và tuyển chọn được một số vi khuẩn lactic từ sữa mẹ và phân su có khả năng loại bỏ cholesterol để làm cơ sở cho các ứng dụng tạo các sản phâm probiotics.
Nội dung thực hiện Nội dung 1: Thu thập mẫu và phân lập vi khuẩn lactic từ phân su và sữa mẹ Nội dung 2: Khảo sát khả năng chịu acid, dung nạp muối mật và acid mật Nội dung 3: Định tính khả năng sinh enzyme BSH Nội dung 4: Khảo sát khả năng loại bỏ cholesterol Nội dung 5: Định danh xác định tên chủng CHUONG 2. TONG QUAN TÀI LIEU 2. Vi khuẩn lactic (LAB) 2. Khái niệm và đặc điểm chung Theo khoá phân loại Bergey 1994, vi khuẩn lactic (LAB) thuộc các chi khác nhau bao gồm Bifidobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus va Streptococcus.
LAB có các đặc tinh: Gram dương, có phan ứng sinh hoá Oxydase va Catalase âm tính, hình que hay hình cầu, không tao bảo tử. Ngay trong điều kiện có oxi thì LAB cũng biến dưỡng bằng phương thức lên men nên LAB là vi khuẩn kị khí tuỳ ý. = a7 \ `` A ) e S s24 (aie NES Na A IS 7B f | ~ Hinh 2. Hình thai của Lactobacillus bulgaricus dưới kính hiển vi quang học (Shao và ctv, 2014).
LAB sinh trưởng trong môi trường có pH thấp, chuyên hoá cacbohydrat thành acid lactic do đó được sử dụng rộng rãi và phô biến trong công nghệ thực phẩm, công nghệ lên men. Trong cơ thê người, LAB cũng đóng vai trò quan trọng, chúng cư trú ở niêm mạch miệng, mũi, hong (Streptococci), ruột (Bifidobacteria, Enterococci, Lactobacilli), niêm mạc âm đạo (một số chủng Lactobacilli đặc trưng). Vì có kha năng sống sót trên con đường đi đến ống tiêu hóa dưới (GIT) nhờ hoạt tính tan máu, kháng acid và mật muối, tuân thủ niêm mạc ruột của vật chủ, khả năng sống sót trong xử ly và lưu trữ và khả năng chống lại sức nóng và áp suất thẩm thấu (FAO/WHO, 2002 ; Kumar, 2012), LAB được xem như một probiotic tiềm năng (chủ yếu thuộc về các chi Lactobacillus và Bifidobacterium) có gia trị ứng dụng cao (W. Nhiều nghiên cứu về vai trò của LAB đối với sức khoẻ được trình bày ở bảng sau: Bang 2.
Một sé vai trò của vi khuẩn lactic (LAB) đối với sức khoẻ con người Ứng dụng Nhóm nghiên cứu Bifidobacterium tạo axit lactic giúp tiêu hoa lactose, giảm thiêu các trường hợp không dung Jiang và ctv, 1996 nạp đường sữa Vi khuan lactic ức chế sự tăng trưởng của nam moc và giam sản xuât Aflatoxins đê hạn chê Haskard và ctv, 2001; Ahlberg các tác động độc hại trong thực phẩm và thức va ctv, 2015 ăn chăn nuôi Ung dung LAB vào mỹ pham dé sản xuat axit Weindl G va ctv, 2004; hyaluronic giúp cap nước cho da, tác dụng Izawa va ctv, 2014 chống oxy hoá va kiểm soát pH da. Giảm mật độ LDL-cholesterol trong huyết Xiao và ctv, 2003; Gawad va thanh ở người và động vật ctv, 2005 Tác dụng giảm cholesterol có thé do khả năng khử mudi mật từ các chủng vi khuẩn sản xuất enzyme BSH (Pereira ctv, 2002). Acid mật là tiền chất tổng hợp cholesterol. Acid mật tự do ít hòa tan và ít được tái hấp thu từ ruột hơn muối mật liên hợp và sẽ được bài tiết qua phân (Smet và ctv, 1994; Rodas và ctv, 1996; Reynier và ctv, 1981).
Khi đó, nhu cầu sử dụng cholesterol để tổng hợp acid mật đã bị bài tiết tăng, kéo theo lượng cholesterol trong huyết thanh giảm. Gilliland và ctv (1985) đã nghiên cứu quá trình đồng hoá cholesterol của Lactobacilli và kết luận rằng enzyme BSH chịu trách nhiệm cho việc khử muối mật trong quá trình tuần hoàn ruột — gan (enterohepatic). Một số vi khuân Lactic tiềm năng cho thấy hoạt động hydrolase muối mật (BSH) trong giảm cholesterol STT Vi sinh vật thi Hệ thống thi Phát hiện chính Nguồn nghiém nghiệm Sữa lên men Bộ lạc Maasai Giam cholesterol Mamn và Spoerry, ở châu Phi 1974. Lactobacillus Môi trường Loại bỏ Cholesterol Gilliland và ctv, acidophilus nuôi cay Sinh tồn tốt trong môi 1985 trường cholesterol Bifidobacterium Môi trường Loại bỏ cholesterol Tahri va ctv, 1996 nuôi cay L.
acidaphilus Moi trường Đồng hoá cholesterol Lin va Chen, nuôi cấy 2000 nn Bifidobacterium Chuột, Người Giảm cholesterol Xiao va ctv, 2003 Giảm triglyceride Giảm LDL Yogurt bao gồm Chuột Giảm cholesterol Gawad va _ ctv, (B. lactics hoac Giảm triglyceride 2005 B. longum) Giảm LDL Tăng HDL L. plantarum Môi trường Đồng hoá cholesterol Kumar và ctv, nuôi cây 2010 E.
faecium Người Giảm cholesterol Klein và ctv, Giam triglyceride 2008 Giam LDL Tang HDL 2. Vi khuẩn lactic và khả năng làm giảm cholesterol Những nghiên cứu trước đây cho thấy các chủng vi khuẩn sản xuất enzyme BSH có khả năng khử muối mật, từ đó giúp làm giảm lượng cholesterol. Năm 1985, Gilliland va ctv đã báo cáo rằng việc L. acidophilus RP32 tiêu thụ thức ăn và sinh trưởng trong môi trường có cholesterol và mật đã ức chế đáng ké sự gia tăng nồng độ cholesterol trong huyết thanh của lợn được nuôi bằng chế độ ăn nhiều cholesterol.
Trong một nghiên cứu khác của Mahrous va ctv (2011), đã chứng minh rằng nồng độ cholesterol và axit mật trong huyét thanh chuột được nuôi bằng sữa chua lên men bởi L. acidophilus P106 giảm đáng kê, trong khi hàm lượng cholesterol và axit mật tăng lên trong phân chuột. Tac giả cho rằng các chi vi khuan lactic có thé đã sản xuất enzyme BSH dé thuỷ phân muối mật liên hợp trong quá trình tuần hoàn ruột gan. Protein NPC1L1 là một protein mang có vai trò trong việc hap thụ cholesterol vào ruột, có khả năng vận chuyên cholesterol vào các tế bảo thông qua nhập bào và biểu hiện cao ở tá tràng và hỗng tràng của ruột non.
Theo lý thuyết, khi giảm nồng độ protein NPC1L1 ở ruột non sẽ làm giảm mức cholesterol được hấp thu, từ đó làm giảm nồng độ cholesterol trong huyết thanh. Huang và ctv (2010) cũng đã chứng minh được điều này khi cho các con chuột đồng ăn thức ăn có chứa L. acidophilus ATCC 4356 với hàm lượng 10° CFU mỗi ngày, kết qua báo cáo cho thay nồng độ LDL-cholesterol và tong lượng cholesterol đã giảm khi tác động giảm nồng độ protein NPC1L1 trong ruột non. platarum CAAS 18008 cũng thể hiện kha năng giảm cholesterol dựa trên hoạt động của BSH, BSH đã khử liên hop muối mật trong đường ruột của chuột Hamster, làm giải phóng các axit amin và axit mật tự do.
Tống quan về cholesterol 2. Khái niệm và cau trúc đặc trưng Cholesterol là một loại steroid tìm thấy trong mô động vật, có cấu trúc đặc trưng là một vòng bốn hydrocacbon được hợp nhất và một đuôi hydrocacbon bao gồm tám chuỗi hydrocacbon. Cấu trúc của cholesterol (Westover và ctv, 2003). Trong tế bào, cholesterol tham gia vào thành phan cấu trúc của màng tế bao, có vai trò không thể thiếu trong tính lưu động của màng, phân loại protein màng, truyền tín hiệu tế bào và tham gia chu trình apoptosis.
Đối với cơ thể, cholesterol cũng đóng vai trò rất quan trọng, là một yêu tố không thể thiếu trong quá trình hoạt động của tế bào sợi thần kinh, là tiền chất của các hormone steroid bao gồm estrogen, progesterone, testosterone, cũng như vitamin D, giúp cơ thể hoạt động bình thường và khỏe mạnh. Cholesterol trong máu có 2 nguồn gốc từ thực phẩm (thức ăn có nguồn gốc từ động vật như thịt, sữa, lòng đỏ trứng, phù tạng) và được tổng hợp nội sinh từ tất cả các tế bào và mô, nhưng chủ yếu ở gan, ruột và cơ quan sinh sản (Harvey và Ferrie, 2011). Cơ thể có cơ chế điều hoà dé duy tri cân bằng nội môi cholesterol thông qua tong hợp de novo và hap thu từ chế độ ăn uống (Ikonen, 2008). Cholesterol được gan sử dung làm tiền chat dé tong hợp acid mật, acid mật là liên kết peptide với glycine hoặc taurine và tự lắp ráp thành các mixen.