Tổng quan luận án
Biển và đại dương chiếm hơn 70% diện tích bề mặt Trái Đất, là môi trường sống của gần 300.000 loài thực vật, động vật và vi sinh vật. Nguồn tài nguyên sinh vật biển phong phú này cung cấp nguyên liệu cho nhiều ngành công nghiệp như thực phẩm, mỹ phẩm và hóa dược. Trước đây, tiềm năng cung cấp dược liệu và các hợp chất có hoạt tính sinh học cao từ sinh vật biển cho ngành hóa dược chưa nhận được sự quan tâm đúng mức. Nhờ sự phát triển của các kỹ thuật phân tích và thiết bị hiện đại, nhiều hợp chất thiên nhiên từ biển đã được phân lập, xác định cấu trúc hóa học và đánh giá hoạt tính sinh học, đóng vai trò làm mẫu hình hoặc tiền chất cho việc nghiên cứu phát triển các thế hệ thuốc mới.
Việt Nam sở hữu hơn 1 triệu km² vùng biển nhiệt đới gió mùa cùng hệ thống cửa sông dày đặc, tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển đa dạng của hệ sinh vật biển. Mặc dù các nghiên cứu về hóa học hợp chất thiên nhiên từ sinh vật biển tại Việt Nam đã bắt đầu từ những năm 1970, số lượng công trình nghiên cứu trong nước vẫn còn hạn chế và phân tán, đặc biệt là các nghiên cứu chuyên sâu về ngành Da gai (Echinodermata).
Ngành Da gai gồm năm lớp chính: Sao Biển (Asteroidea), Sao Biển Rắn (Ophiuroidea), Cầu Gai (Echinoidea), Hải Sâm (Holothuria) và Huệ Biển (Crinoidea). Trong đó, lớp Sao biển là nguồn cung cấp phong phú các hợp chất steroid phân cực có cấu trúc đa dạng và thể hiện nhiều hoạt tính sinh học như kháng vi khuẩn, kháng nấm, kháng viêm, giảm đau, giảm huyết áp, chống khối u, chống vi rút, tan máu và tác động lên sự truyền tín hiệu thần kinh. Nghiên cứu về steroid phân cực từ sao biển đã được thực hiện bởi các nhóm nghiên cứu tại Nga, Hàn Quốc, Trung Quốc, Nhật Bản và Italia. Tuy nhiên, tại Việt Nam trước thời điểm thực hiện luận án, chưa có công trình khoa học nào nghiên cứu chuyên sâu và toàn diện về lớp chất steroid phân cực từ sao biển.
Nhằm tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học từ sinh vật biển thuộc ngành Da gai phục vụ nghiên cứu và phát triển dược phẩm, luận án tập trung nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của nhóm chất steroid phân cực từ loài sao biển Archaster typicus tại vùng biển Việt Nam.
Nội dung nghiên cứu của luận án được xác định gồm ba nhiệm vụ chính:
- Phân lập các hợp chất steroid phân cực từ loài sao biển Archaster typicus của Việt Nam.
- Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được.
- Thử nghiệm một số hoạt tính sinh học của các chất phân lập được.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:
- Đối tượng nghiên cứu: Loài sao biển Archaster typicus Muller & Troschel, 1840 (thuộc giống Archaster, họ Archasteridae, bộ Valvatida, lớp Asteroidea, ngành Echinodermata).
- Phạm vi không gian: Mẫu sinh vật được thu thập tại vùng đáy cát ven biển tỉnh Quảng Ninh, Việt Nam.
- Phạm vi thời gian: Mẫu được thu thập vào tháng 08/2008.
Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án
Đặc điểm phân loại và sinh học của sao biển
Sao biển là động vật không xương sống sống ở đáy biển, cơ thể dẹp theo chiều lưng bụng, có dạng hình sao với đối xứng bậc 5 hoặc nhiều cánh tỏa ra xung quanh miệng. Chiều dài cánh dao động từ 1–1,5 cm đến 80 cm. Lớp Asteroidea hiện được chia thành 7 bộ: Brisingida, Forcipulatida, Notomyotida, Paxillosida, Spinulosida, Valvatida và Velatida, với khoảng 1.800 loài phân bố trên các đại dương thế giới, tập trung nhiều ở vùng biển Ôxtrâylia, Đông Thái Bình Dương, Bắc Mỹ và vùng biển nhiệt đới Ấn Độ – Thái Bình Dương. Tại Việt Nam, có khoảng 60 loài sao biển phân bố dọc bờ biển từ Bắc vào Nam.
Loài sao biển Archaster typicus được Lamarck mô tả năm 1816, thuộc họ Archasteridae trong bộ Valvatida. Bộ Valvatida gồm 14 họ: Acanthasteridae, Archasteridae, Asterinidae, Asterodiscididae, Chaetasteridae, Ganeriidae, Leilasteridae, Goniasteridae, Mithrodidae, Odontasteridae, Ophidiasteridae, Oreasteridae, Poraniidae và Pseudarchasteridae. Trong đó, họ Archasteridae là một họ nhỏ chỉ có một chi duy nhất là Archaster gồm 3 loài: Archaster angulatus, Archaster laevis và Archaster typicus.
Tình hình nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học lớp chất steroid phân cực từ sao biển
Đến nay, trên thế giới có khoảng 80 loài sao biển đã được nghiên cứu về thành phần hóa học, phân lập được hơn 200 hợp chất; trong đó trên 50% là steroid, trên 20% là ceramide/cerebroside, bên cạnh ancaloit và axit béo. Lớp chất steroid phân cực từ sao biển được chia thành bốn nhóm cấu trúc chính:
- Polyhydroxy steroid.
- Steroid sulfate.
- Glycoside polyhydroxy steroid.
- Asterosaponine.
| STT |
Hoạt tính sinh học |
Nhóm chất |
Sao biển chứa hợp chất có hoạt tính |
Tài liệu trích dẫn |
| 1 |
Hoạt tính gây độc tế bào |
Polyhydroxy steroid; Steroid sulfate; Glycoside polyhydroxy steroid; Asterosaponine |
Certonardoa semiregularis; Hippasteria phrygiana; Luidia quinaria; Anthenea chinensis |
[16], [21], [62], [79], [102], [108-111] |
| 2 |
Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm |
Polyhydroxy steroid; Steroid sulfate; Glycoside polyhydroxy steroid; Asterosaponine |
Certonardoa semiregularis; Anasterias minuta |
[12], [13], [110], [111] |
| 3 |
Hoạt tính tán huyết |
Polyhydroxy steroid; Glycoside polyhydroxy steroid; Asterosaponine |
Henricia leviuscula; Culcita novaeguineae |
[33], [40], [67], [101] |
| 4 |
Hoạt tính neuritogenic |
Glycoside polyhydroxy steroid |
Linckia laevigata |
[23], [24], [46], [81], [85-87] |
Các hướng nghiên cứu và công trình tiêu biểu trên thế giới được điểm lại gồm:
- Nhóm nghiên cứu của Wang và cộng sự (2002, 2003, 2004, Hàn Quốc): Phân lập từ loài Certonardoa semiregularis 13 hợp chất polyhydroxy steroid mới certonardosterol A–M (1–13), 23 polyhydroxy steroid mới (14–36), bao gồm các hợp chất nhóm tetrol hiếm gặp (14, 15, 19–21) và các steroid chứa nhóm xeton tại C-8 (25–31); phân lập các glycoside certonardoside A–J (80–89) và certonardoside K–N (90–93). Nhóm đã thử nghiệm độc tính tế bào in vitro của các hợp chất 1–36 trên 5 dòng tế bào ung thư người (A549, SK-OV-3, KS-MEL-2, XF498, HCT15), thử hoạt tính kháng khuẩn trên 20 chủng vi khuẩn và hoạt tính kháng virut (HIV, HSV, CoxB, EMCV, VSV).
- Nhóm nghiên cứu của Levina, Stonik, Kicha, Ivanchina và cộng sự (2001–2007, Viện Hóa sinh hữu cơ Thái Bình Dương - PIBOC, LB Nga): Phân lập hàng loạt dẫn xuất polyhydroxy steroid, steroid sulfate và glycoside từ các loài sao biển vùng Viễn Đông:
- Hợp chất polyhydroxy steroid gắn triseramide (37) từ Astropecten triseriatus.
- Các hợp chất 38–39 từ Henricia sanguinolenta và H. leviuscula; hợp chất 40–41 từ Henricia tumida; phrygiasterol (42) từ Hippasteria phrygiana; các polyhydroxy steroid 43–45.
- Các dẫn xuất cholesterol sulfate (47–49) từ Leptasterias alaskensis asiatica và L. fisheri; các cặp ion alkaloid steroid (50–52) và muối sulfate (53–58) từ Lethasterias nanimensis chelifera.
- Các monosulfate và disulfate steroid (62–79) từ các loài Ctenodiscus crispatus, Hippasteria kurilensis, Pteraster pulvillus, Pteraster obscurus, Asteronyx loveni, Plazaster borealis, Diplopteraster multiples.
- Các hợp chất glycoside: lysastroside A (132) từ Lysastrosoma anthosticta; sanguinoside A–C (133–135); phrygioside A–B (136–137); asperoside A–B (138–139); tumidoside A–B (140–141); trofoside A–B (148–149); leviusculoside J (150); fuscaside A–B (151–152); kurilensoside A–D (163–166); linckoside L1–L7 (123–129) từ loài Linckia laevigata thu tại Việt Nam.
- Nhóm nghiên cứu của Jianhua Qi và cộng sự (2002–2006, Nhật Bản): Phân lập 16 glycoside linckoside A–K, M–Q (106–121) và granulatoside A (122) từ loài Linckia laevigata, phát hiện khả năng kích thích biệt hóa tế bào u thần kinh PC12 ở chuột khi có mặt nhân tố tăng trưởng thần kinh (NGF).
- Nhóm nghiên cứu của Tang H.F. và cộng sự (2005, 2009, 2010, Trung Quốc): Phân lập các asterosaponine novaeguinoside A, I, II (167–169), novaeguinosides A–D (1–4), hợp chất 170–173 từ Culcita novaeguineae; 10 hợp chất anthenoside B–K từ Anthenea chinensis, đánh giá độc tính trên dòng tế bào ung thư K-562 và BEL-7402 cùng hoạt tính tán huyết.
- Nhóm nghiên cứu của De Marino và cộng sự: Phân lập luidiaquinoside (176) từ Luidia quinaria và psilasteroside (177) từ Psilaster cassiope.
| Hợp chất |
Dòng A549 ($IC_{50}$, µM) |
Dòng SK-OV-3 ($IC_{50}$, µM) |
Dòng KS-MEL-2 ($IC_{50}$, µM) |
Dòng XF498 ($IC_{50}$, µM) |
Dòng HCT15 ($IC_{50}$, µM) |
| 14 |
0,15 |
0,08 |
0,09 |
0,07 |
0,01 |
| 16 |
0,82 |
0,90 |
0,40 |
0,43 |
1,25 |
| 19 |
0,48 |
0,83 |
0,28 |
0,40 |
1,26 |
| 20 |
0,54 |
0,69 |
0,40 |
0,33 |
0,73 |
| 21 |
1,75 |
1,51 |
0,48 |
1,22 |
1,25 |
| 22 |
0,15 |
0,16 |
<0,10 |
0,08 |
0,25 |
| 30 |
0,43 |
0,22 |
0,17 |
0,12 |
0,48 |
| Doxorubicin |
0,04 |
0,12 |
0,05 |
0,12 |
0,18 |
Tình hình nghiên cứu trên loài sao biển Archaster typicus
Trên thế giới:
- Riccio và cộng sự (1986) phân lập 9 hợp chất polyhydroxy steroid từ Archaster typicus: 27-nor-5α-cholestane-3β,4β,5,6α,7β,8,14,15α,24α-nonaol (1), dẫn xuất 6α-sulphate của nó (2), 27-nor-5α-cholestane-3β,4β,5,6α,8,14,15α,24α-octaol (3), 3β,4β,5,6α,8,14,15α-heptahydroxy-27-nor-5α-choles24-one (4), (24E)-5α-cholest-24-ene-3β,6α,8,14,15α,26-hexaol 15-sulphate (5a), dạng không sulfate (5b), (24E)-5α-cholest-24-ene-3β,4β,5,6α,14,15α,26-heptaol 15-sulphate (6a), dạng không sulfate (6b), và (24E)-5α-cholest-24-ene-3β,4β,5,6α,7β,8,14,15α,26-nonaol 6-sulphate (7).
- Riccio và cộng sự (1989) tiếp tục phân lập thêm 3 polyhydroxy steroid: (22E,24R,25R)-24-methyl-5α-cholest-22-ene-3β,4β,5,6α,8,14,15α,25,26-nonaol (10), (24R,25R)-24-methyl-5α-cholestan-3β,4β,5,6α,8,14,15α,25,26-nonaol (11) và (22E,24S)-24-methyl-5α-cholest-22-ene-3β,4β,5,6α,8,14,15α,25,28-nonaol (12).
Tại Việt Nam:
- Châu Văn Minh và cộng sự (2007) phân lập 7 hợp chất ký hiệu SB1–SB7 gồm: Cholest-7-en-3-on (SB1), Cholesterol (SB2), Batilol (SB3), Ergost-22-en-3β,4β,5α,6α,8β,14α,15α,22E,24R,25R,26-nonol (SB4), 27-Norcholestan-3β,4β,5α,6α,8β,14α,15α,24R-octol (SB5), 27-Norcholestan-3β,4β,5α,6α,7β,8β,14α,15α,24R-nonol (SB6), và cerebroside 1-O-(β-D-galactopyranosyl)-(2S,3S,4R)-2-[(2R)-2-hydroxytertracosanoylamino]-14-methyl-pentadecne-1,3,4-triol (SB7) có hoạt tính gây độc tế bào trên 2 dòng ung thư Hep-G2 và Lu.
Khoảng trống nghiên cứu được lựa chọn giải quyết: Các công trình trước đây tại Việt Nam chỉ dừng lại ở việc khảo sát sơ bộ thành phần hóa học chung mà chưa đi sâu nghiên cứu riêng biệt và có hệ thống về lớp chất steroid phân cực của loài sao biển Archaster typicus.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu
Khung lý thuyết và tiếp cận hóa học
Luận án áp dụng phương pháp nghiên cứu thực nghiệm hóa học các hợp chất thiên nhiên biển kết hợp với hóa sinh hiện đại:
- Chiết tách và phân đoạn làm giàu nhóm chất phân cực bằng phương pháp sắc ký hấp phụ loại muối.
- Tinh chế bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC).
- Xác định cấu trúc hóa học bằng các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân đa chiều (NMR 1D và 2D) kết hợp khối phổ phân giải cao (HR ESI-MS) và phân mảnh đa cấp (ESI-MS/MS).
- Xác định cấu hình lập thể tuyệt đối của khung steroid và mạch nhánh bằng phương pháp Mosher biến tính; xác định cấu hình tuyệt đối của gốc đường bằng phương pháp hóa học kết hợp sắc ký khí (GC).
- Đánh giá hoạt tính sinh học in vitro và trên mô hình sinh vật biển thực nghiệm.
Phương pháp phân lập và tinh chế
- Sắc ký lớp mỏng (TLC): Thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica gel 60 $F_{254}$ (Merck) và bản mỏng tráng sẵn của Nga ($4,5\text{ cm} \times 6,0\text{ cm}$, hạt $5\text{ }\mu\text{m} \div 17\text{ }\mu\text{m}$, Sorbpolimer, Krasnodar, Russia). Hiện hình bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc phun dung dịch $H_2SO_4/\text{EtOH } 5%$, sấy khô và hơ nóng trên bếp điện.
- Sắc ký cột khử muối Polychrome: Dịch chiết cồn sau khi cô đặc được hòa tan trong nước cất và nạp lên cột Polychrome ($\Phi = 70\text{ mm}$, $L = 260\text{ mm}$). Dung môi rửa giải ban đầu là nước cất (11 lít) để loại bỏ toàn bộ muối khoáng (kiểm tra dịch nước bằng dung dịch $AgNO_3\text{ 1N}$ đến khi không còn kết tủa trắng). Sau đó, dùng ethanol (7 lít) để rửa giải và thu nhận các phân đoạn steroid phân cực.
- Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC): Tiến hành trên hệ thống Agilent 1100, sử dụng cột Diasfer-110-C18 ($10\text{ }\mu\text{m}$, kích thước bán điều chế $15 \times 250\text{ mm}$ hoặc phân tích $0,4 \times 250\text{ mm}$), tốc độ dòng 2,5 ml/phút, hệ dung môi rửa giải đẳng dòng hoặc gradient gồm $\text{EtOH/H}_2\text{O}$ hoặc $\text{EtOH/H}_2\text{O/1N NH}_4\text{OAc}$ ở các tỷ lệ thể tích khác nhau.
Phương pháp xác định cấu trúc hóa học
- Phổ khối lượng phân giải cao (HR ESI-MS & ESI-MS/MS): Đo trên máy Agilent 6510 Q-TOF LC/MS tại Viện Hóa sinh hữu cơ Thái Bình Dương (PIBOC), Phân viện Viễn Đông – Viện Hàn lâm Khoa học LB Nga.
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Đo trên máy Bruker DRX 500 (500 MHz cho phổ $^1H\text{-NMR}$ và 125,8 MHz cho phổ $^{13}C\text{-NMR}$) tại PIBOC, sử dụng chất chuẩn nội Tetramethylsilan (TMS). Các kỹ thuật ghi phổ gồm:
- Phổ một chiều: $^1H\text{-NMR}$, $^{13}C\text{-NMR}$, DEPT $90^\circ$, DEPT $135^\circ$.
- Phổ hai chiều: HSQC, HMBC, $^1H\text{-}^1H\text{ COSY}$, TOCOSY, NOESY.
- Dung môi đo phổ: $CD_3OD$, $CDCl_3$, Pyridin-$d_5$.
- Sắc ký khí (GC): Thực hiện trên máy Agilent 6580, khí mang He (1,7 ml/phút), cột mao quản HP-5 MS ($30\text{ m} \times 0,25\text{ mm}$), chương trình nhiệt độ: $100^\circ\text{C}$ (giữ 5 phút) $\rightarrow$ tăng $5^\circ\text{C}$/phút $\rightarrow$ $250^\circ\text{C}$ (giữ 30 phút), nhiệt độ buồng tiêm $280^\circ\text{C}$.
- Năng suất quay cực ($[\alpha]_D$): Đo trên phân cực kế Perkin-Elmer polarimeter Model 343.
- Phương pháp Mosher xác định cấu hình tuyệt đối nhóm hydroxyl: Mẫu thử nghiệm hòa tan trong $CH_2Cl_2$, bổ sung DMAP và $(R)\text{-MTPA}$ clorua hoặc $(S)\text{-MTPA}$ clorua để tạo thành $(S)\text{-MTPA}$ este hoặc $(R)\text{-MTPA}$ este qua đêm ở nhiệt độ phòng. Sản phẩm được tinh chế bằng TLC điều chế (hệ n-hexan/EtOAc 4:1) và phân tích phổ $^1H\text{-NMR}$ để tính toán giá trị $\Delta\delta = \delta_S - \delta_R$.
- Thủy phân và xác định cấu hình tuyệt đối của gốc đường: Hợp chất glycoside (1,0 mg) được thủy phân bằng 1 ml axit trifluoroacetic (TFA) 2M ở $100^\circ\text{C}$ trong 2 giờ. Dịch sau thủy phân chiết loại aglycon bằng $CHCl_3$, phần nước cô khô rồi cho phản ứng với 0,5 ml $(-)\text{-2-octanol}$ và 1 giọt TFA đậm đặc ở $130^\circ\text{C}$ trong 6 giờ. Sản phẩm được acetyl hóa bằng hỗn hợp pyridin/anhydrit axetic (1:1) trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng, sau đó phân tích trên GC so sánh thời gian lưu ($t_R$) với các mẫu đường chuẩn D và L tương ứng.
Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học
- Phương pháp thử độc tính tế bào (MTS assay):
- Dòng tế bào ung thư cổ tử cung người (HeLa) và ung thư biểu mô chuột (JB6 Cl 41).
- Môi trường nuôi cấy: MEM hoặc RPMI bổ sung 5% huyết thanh phôi bò (FBS), 2 mM L-glutamine, 100 U/ml penicillin, 100 $\mu\text{g/ml}$ streptomycin ở $37^\circ\text{C}$, 5% $CO_2$.
- Tế bào nuôi trên phiến 96 giếng (12 giờ), ủ với chất thử ở các nồng độ khác nhau trong 22 giờ, thêm 20 $\mu\text{l}$ tác nhân MTS ủ tiếp 2 giờ. Đo độ hấp thụ huỳnh quang trên máy $\mu\text{Quant}$ microplate reader ở bước sóng 492 nm và 690 nm.
$$% \text{ ức chế} = \frac{% \text{FI mẫu trắng} - % \text{FI chất thử}}{% \text{FI mẫu trắng}} \times 100%$$
- Phương pháp đánh giá hoạt tính phiên mã NF-$\kappa$B và p53:
- Dòng tế bào biểu bì chuột JB6 Cl 41 được biến nạp gen chỉ thị JB6-Luc NF-$\kappa$B hoặc JB6-Luc p53 (PG-13).
- Tế bào nuôi cấy với mật độ $8 \times 10^3$ tế bào/100 $\mu\text{l}$/giếng, sau 24 giờ biến nạp được xử lý với chất thử ở nồng độ 6,25; 12,5; 25,0; 50,0 $\mu\text{M}$ trong 24 giờ.
- Giải ly tế bào bằng dung dịch đệm (0,1 M $K_3PO_4$ pH 7,8; 1% Triton X-100; 1 mM DTT; 2 mM EDTA) trong 1 giờ. Đo hoạt tính phát quang luciferase bằng máy Luminoscan Ascent Type 392 với dung dịch cơ chất chứa 0,47 mM D-luciferin, 20 mM Tricin, 1,27 mM CoA, 0,1 mM EDTA (pH 7,8).
$$% \text{ Hoạt tính} = \frac{% \text{FI chất thử}}{% \text{FI đối chứng}} \times 100%$$
- Phương pháp đánh giá ức chế thụ tinh và phát triển phôi cầu gai Strongylocentrotus intermedius:
- Thu nhận giao tử bằng cách tiêm dung dịch KCl 5% vào khoang bụng cầu gai đực và cái.
- Thử ức chế thụ tinh: Tinh trùng xử lý với chất thử (5, 10, 25, 50 $\mu\text{M}$ trong 1% DMSO) trong 15 phút, bổ sung dịch trứng ($1.000\text{ tế bào/ml}$), để 15 phút rồi cố định bằng formandehit 2%. Đếm số lượng trứng có màng thụ tinh hoàn thiện dưới kính hiển vi đảo ngược.
- Thử ức chế phân chia phôi bào: Trứng đã thụ tinh được ủ cùng chất thử ở $18\text{--}20^\circ\text{C}$ đến khi mẫu chứng đạt giai đoạn 8 phôi bào; đếm số lượng phôi đạt chuẩn dưới kính hiển vi đảo ngược. Tính toán giá trị $EC_{50}$ và $EC_{100}$ bằng phần mềm SigmaPlot 3.02.
Nội dung chính theo từng chương
CHƯƠNG I – TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Chương I trình bày hệ thống phân loại, phân bố địa lý và hình thái sinh học của lớp Sao biển (Asteroidea) nói chung và loài Archaster typicus nói riêng; tổng hợp có hệ thống các công trình nghiên cứu về thành phần hóa học của 80 loài sao biển trên thế giới.
Nội dung chương phân tích chi tiết bốn phân nhóm cấu trúc của steroid phân cực:
- Nhóm polyhydroxy steroid: Các dẫn xuất nhân cholestane mang từ 4 đến 9 nhóm hydroxyl phân bố ở nhân và mạch nhánh, các cấu trúc đặc biệt chứa nhóm xeton tại C-8 hoặc C-15, liên kết đôi $\Delta^{8(14)}$, hoặc vòng xyclopropan.
- Nhóm steroid sulfate: Các monosulfate, disulfate gắn nhóm sulfoxy tại các vị trí C-3, C-6, C-15, C-21 hoặc mạch nhánh; các cấu trúc dạng muối alkaloid-steroid hoặc muối tyrammonium.
- Nhóm glycoside polyhydroxy steroid: Các hợp chất mono-, di- hoặc triglycoside chứa các đơn vị đường đặc trưng như D-xylose, 2-O-methyl-xylose, quinovose, fucose, arabinose gắn vào aglycon steroid tại C-3 hoặc C-24/C-26.
- Nhóm asterosaponine: Các saponin đặc trưng của sao biển mang mạch oligoglycoside gồm 4 đến 5 đơn vị đường và nhóm sulfate gắn tại nhân steroid.
Chương này cũng tổng hợp các dữ liệu hoạt tính sinh học của steroid phân cực: độc tính tế bào in vitro trên các dòng ung thư người (A549, SK-OV-3, KS-MEL-2, XF498, HCT15, K-562, BEL-7402, MT-4, RBL-23, HeLa); hoạt tính kháng nấm (Cladosporium cucumerinum, Aspergillus flavus); hoạt tính kháng virut (HSV, CoxB, HIV); hoạt tính kích thích biệt hóa tế bào thần kinh (neuritogenic trên dòng tế bào PC12 và C-1300); hoạt tính ức chế thụ tinh cầu gai và hoạt tính tán huyết hồng cầu chuột ở $37^\circ\text{C}$ và $40^\circ\text{C}$.
Chương I khép lại bằng việc điểm lại toàn bộ các công trình nghiên cứu về loài sao biển Archaster typicus của Riccio và cộng sự (1986, 1989) trên thế giới và của Châu Văn Minh cùng cộng sự (2007) tại Việt Nam, từ đó xác định mục tiêu và nhiệm vụ của đề tài.
CHƯƠNG II – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Chương II mô tả xuất xứ mẫu sinh vật: Mẫu sao biển Archaster typicus được thu thập tại vùng biển Quảng Ninh vào tháng 08/2008, được PGS. TS Đỗ Công Thung (Viện Tài nguyên và Môi trường biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) giám định tên khoa học và lưu giữ tiêu bản.
Chương này trình bày chi tiết các thông số kỹ thuật của thiết bị và điều kiện thực nghiệm:
- Quy trình sắc ký cột khử muối Polychrome với 11 lít nước cất và 7 lít ethanol.
- Thông số phân tích HPLC Agilent 1100, cột Diasfer-110-C18, tốc độ dòng 2,5 ml/phút.
- Thông số máy đo khối phổ HR ESI-MS Agilent 6510 Q-TOF và máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker DRX 500.
- Quy trình điều chế dẫn xuất este $(S)\text{-MTPA}$ và $(R)\text{-MTPA}$ theo phương pháp Mosher.
- Quy trình thủy phân glycoside bằng TFA 2M, dẫn xuất hóa với $(-)\text{-2-octanol}$ và acetyl hóa để phân tích trên hệ thống GC Agilent 6580.
- Quy trình chuẩn hóa của ba mô hình thử nghiệm sinh học: thử nghiệm MTS trên tế bào HeLa và JB6 Cl 41; thử nghiệm gen chỉ thị Luciferase đo hoạt tính phiên mã NF-$\kappa$B và p53; thử nghiệm ức chế thụ tinh và ức chế phân chia phôi bào ở giai đoạn 8 tế bào trên cầu gai Strongylocentrotus intermedius.
CHƯƠNG III – THỰC NGHIỆM
Chương III trình bày quá trình chiết tách thực nghiệm từ 7 kg mẫu sao biển tươi Archaster typicus:
- Mẫu tươi thái nhỏ ngâm chiết 3 lần với ethanol (15 lít/lần, mỗi lần 1 tuần) ở nhiệt độ phòng. Gộp dịch chiết và cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được dịch cô A (120 g).
- Hòa tan dịch cô A trong 1 lít nước cất, nạp lên cột sắc ký Polychrome ($\Phi = 70\text{ mm}$, $L = 260\text{ mm}$), rửa bằng 11 lít nước cất để loại muối khoáng, sau đó rửa giải bằng 7 lít ethanol, thu được ba phân đoạn: phân đoạn 1 (29,7 g), phân đoạn 2 (1,2 g) và phân đoạn 3 (1,7 g).
Tiến hành sắc ký lỏng cao áp pha đảo (RP-HPLC) trên các phân đoạn thu được các hợp chất tinh khiết:
- Từ phân đoạn nhỏ 131 (15 mg): Rửa giải với $\text{EtOH/H}_2\text{O}$ (65:35) thu được hợp chất AT4 (1,5 mg).
- Từ phân đoạn nhỏ 134 (50 mg): Tách thu được 7 phân đoạn nhỏ (134-3 đến 134-10); phân đoạn 134-5 (3,5 mg) rửa giải với $\text{EtOH/H}_2\text{O/1N NH}_4\text{OAc}$ (55:40:5) cho hợp chất A12 (1,5 mg); phân đoạn 134-7 (6 mg) rửa giải với $\text{EtOH/H}_2\text{O}$ (55:45) cho hợp chất A1 (2,5 mg).
- Từ phân đoạn nhỏ 135 (50 mg): Rửa giải với $\text{EtOH/H}_2\text{O}$ (65:35) cho hợp chất A13 (7,0 mg); các phân đoạn liên quan qua HPLC với các hệ dung môi $\text{EtOH/H}_2\text{O/1N NH}_4\text{OAc}$ tỷ lệ 65:34:1, 50:49:1, 55:44:1 thu được A6 (1,0 mg), A9 (72,3 mg), A7 (1,5 mg), A8 (6,0 mg).
- Từ phân đoạn nhỏ 142 (250 mg): Phân đoạn 142-5 (6,0 mg) cho hợp chất A3 (1,4 mg); phân đoạn 142-4 (43,9 mg) cho hợp chất A4 (3,0 mg).
- Từ phân đoạn nhỏ 143 (80 mg): Phân đoạn 143-1 (22 mg) cho hợp chất A10 (4,6 mg); phân đoạn 143-6 (22 mg) rửa giải với $\text{EtOH/H}_2\text{O}$ (70:30) cho hợp chất A5 (2,0 mg).
- Từ phân đoạn 15 (80 mg): Phân đoạn nhỏ 15-7 (5,7 mg) rửa giải với $\text{EtOH/H}_2\text{O/1N NH}_4\text{OAc}$ (70:29:1) cho hợp chất A2 (2,5 mg).
- Từ phân đoạn 17: Phân đoạn 17-13 cho A14 (Archasteroside A); phân đoạn 17-12 (6,0 mg) cho A15 (Archasteroside B); phân đoạn 17-10 (12,8 mg) cho A16 (Archasteroside C).
| Mã hợp chất |
Tên hóa học / Đặc điểm cấu trúc |
Dạng tồn tại |
Công thức phân tử |
Khối lượng phân tử ($M$) |
Dữ liệu khối phổ chính ($m/z$) |
| AT4 (Mới) |
(24R)-27-nor-5α-cholestane-3β,6α,8,14,15α,24-hexaol |
Rắn, vô định hình |
$C_{26}H_{45}O_6$ |
454 |
Tính toán lý thuyết: 453,3222 |
| A1 (Mới) |
(24R)-27-nor-5α-cholestane-3β,4β,6α,8,14,15α,24-heptaol |
Rắn, vô định hình |
$C_{26}H_{46}O_7$ |
470 |
HR-ESIMS: 493,3138 $[M+Na]^+$; ESIMS/MS $m/z$ 469: 451, 433, 415, 397, 379 |
| A2 |
Glycoside steroid (chứa đơn vị D-glucose) |
Rắn, vô định hình |
$C_{32}H_{56}O_{14}$ |
664 |
HR-ESI-MS: 687,3575 $[M+Na]^+$; MS/MS: 669, 525, 507, 489 |
| A3 (Mới) |
(24R)-5α-cholestane-3β,4β,5,6α,8,14,15α,24,26-nonaol |
Rắn, vô định hình |
$C_{27}H_{48}O_9$ |
516 |
HR-ESI-MS: 539,3191 $[M+Na]^+$ (tính toán: 539,3191) |
| A4 (Mới) |
Muối natri (24S)- & (24R)-5α-cholest-25(27)-ene-3β,6α,8,14,15α,24,26-heptaol 15-O-sulfate |
Rắn, vô định hình |
$C_{27}H_{45}O_{10}SNa$ |
584 |
HR-ESI-MS: 607,2535 $[M+Na]^+$; (-)ESIMS: 561 $[M-Na]^-$; $[\alpha]_D^{25} = +85^\circ$ |
| A5 (Mới) |
Muối natri (23E)-27-Nor-25-oxo-5α-cholest-23-ene-3β,6α,8,14,15α-pentaol 15-O-sulfate |
Rắn, vô định hình |
- |
- |
- |
| A14 |
Archasteroside A |
Rắn, vô định hình |
- |
- |
- |
| A15 |
Archasteroside B |
Rắn, vô định hình |
- |
- |
- |
| A16 |
Archasteroside C |
Rắn, vô định hình |
- |
- |
- |
Dữ liệu thực nghiệm xác định cấu hình tuyệt đối tiêu biểu:
- Dẫn xuất Mosher của hợp chất A1:
- 3,6,24-tri-(S)-MTPA este của A1 ($^1H\text{-NMR}$, 500 MHz, $CD_3OD$): $\delta$ 0,77 (3H, d, $J=6,5\text{ Hz}$, $H_3$-21), 0,92 (1H, m, H-22), 0,93 (3H, t, $J=7,5\text{ Hz}$, $H_3$-26), 1,08 (3H, s, $H_3$-18), 1,27 (1H, m, H-20), 1,28 (3H, s, $H_3$-19), 1,33 (1H, m, $H'$-22), 1,39 (1H, m, H-5), 1,45 (1H, m, H-23), 1,52 (1H, m, H-16), 1,67 (1H, m, $H'$-23), 1,69 (2H, m, H-25), 1,72 (1H, m, H-7), 1,76 (1H, m, $H'$-16), 1,90 (1H, m, H-17), 2,41 (1H, dd, $J=4,5, 13,0\text{ Hz}$, $H'$-7), 4,29 (1H, brs, H-4), 4,40 (1H, dd, $J=4,2, 9,5\text{ Hz}$, H-15), 4,86 (1H, m, H-3), 4,97 (1H, m, H-24), 5,53 (1H, td, $J=4,5, 11,2\text{ Hz}$, H-6).
- 3,6,24-tri-(R)-MTPA este của A1 ($^1H\text{-NMR}$, 500 MHz, $CD_3OD$): $\delta$ 0,80 (3H, t, $J=7,5\text{ Hz}$, $H_3$-26), 0,83 (3H, d, $J=6,5\text{ Hz}$, $H_3$-21)...
- Phân tích GC xác định phân tử đường của hợp chất A2: Thời gian lưu của mẫu A2 ($t_R$: 28,27; 28,86; 29,00; 29,38 phút) trùng khớp với thời gian lưu của mẫu D-glucose chuẩn ($t_R$: 28,27; 28,86; 29,06; 29,38 phút), khác biệt với mẫu L-glucose chuẩn ($t_R$: 28,40; 28,62; 28,72; 29,38 phút).
Kết quả và những đóng góp mới
Đóng góp mới về mặt khoa học và lý luận
- Đây là công trình đầu tiên tại Việt Nam tiến hành nghiên cứu chuyên sâu, có hệ thống về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của nhóm hợp chất steroid phân cực từ loài sao biển Archaster typicus.
- Đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học của nhiều hợp chất steroid phân cực thuộc các phân nhóm polyhydroxy steroid, steroid sulfate và glycoside steroid, trong đó phát hiện và công bố các hợp chất mới chưa từng được tìm thấy trong tự nhiên:
- Hợp chất mới AT4: (24R)-27-nor-5α-cholestane-3β,6α,8,14,15α,24-hexaol.
- Hợp chất mới A1: (24R)-27-nor-5α-cholestane-3β,4β,6α,8,14,15α,24-heptaol.
- Hợp chất mới A3: (24R)-5α-cholestane-3β,4β,5,6α,8,14,15α,24,26-nonaol.
- Hợp chất mới A4: Muối natri (24S)- & (24R)-5α-cholest-25(27)-ene-3β,6α,8,14,15α,24,26-heptaol 15-O-sulfate.
- Hợp chất mới A5: Muối natri (23E)-27-Nor-25-oxo-5α-cholest-23-ene-3β,6α,8,14,15α-pentaol 15-O-sulfate.
- Các hợp chất glycoside mới đặt tên là Archasteroside A (A14), Archasteroside B (A15) và Archasteroside C (A16).
- Ứng dụng thành công phương pháp Mosher cải tiến và phương pháp thủy phân/dẫn xuất hóa kết hợp sắc ký khí (GC) để xác định cấu hình lập thể tuyệt đối của các tâm bất đối trên khung aglycon và các gốc monosaccharide trong cấu trúc phân tử.
Đóng góp mới về mặt thực tiễn và phương pháp
- Thiết lập được quy trình tách chiết và làm giàu lớp chất steroid phân cực từ mẫu sinh vật biển có hàm lượng muối khoáng cao bằng việc kết hợp cột sắc ký Polychrome và sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC) sử dụng hệ dung môi có chứa đệm ammonium acetate ($NH_4OAc$).
- Cung cấp dữ liệu thực nghiệm về hoạt tính sinh học của các hợp chất steroid phân cực trên các mô hình in vitro (độc tế bào ung thư HeLa, JB6 Cl 41; hoạt tính phiên mã NF-$\kappa$B, p53) và mô hình sinh học biển (ức chế sự thụ tinh và phát triển phôi bào cầu gai Strongylocentrotus intermedius).
Kiến nghị và đề xuất
- Tiếp tục mở rộng nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài sinh vật khác thuộc ngành Da gai (sao biển, sao biển rắn, hải sâm, cầu gai) tại các vùng biển khác nhau của Việt Nam.
- Đẩy mạnh nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động phân tử của các hợp chất mới có hoạt tính sinh học nhằm tạo cơ sở khoa học cho việc định hướng ứng dụng trong ngành hóa dược.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
Hạn chế của nghiên cứu
- Mẫu sinh vật Archaster typicus chỉ mới được thu thập tại một địa điểm duy nhất (vùng biển tỉnh Quảng Ninh) và tại một thời điểm nhất định (tháng 08/2008), chưa đánh giá được sự biến động về thành phần hóa học và hàm lượng các hợp chất steroid phân cực theo mùa sinh học hoặc theo các vùng sinh thái biển khác nhau dọc bờ biển Việt Nam.
- Hàm lượng phân lập được của một số hợp chất mới ở mức rất nhỏ (như AT4 chỉ thu được 1,5 mg; A12 thu được 1,5 mg; phân đoạn 134-6 thu được 0,3 mg), gây khó khăn cho việc khảo sát toàn diện trên nhiều mô hình thử nghiệm sinh học khác nhau.
Hướng nghiên cứu tiếp
- Khảo sát biến động thành phần hóa học của loài Archaster typicus theo các vùng địa lý biển miền Trung và miền Nam Việt Nam.
- Tối ưu hóa quy trình chiết tách với quy mô mẫu lớn hơn hoặc nghiên cứu phương pháp bán tổng hợp/tổng hợp hóa học để thu nhận lượng mẫu đủ lớn phục vụ các thử nghiệm hoạt tính sinh học chuyên sâu in vivo.
Giá trị tham khảo
Luận án có giá trị tham khảo chuyên môn đối với các đối tượng và lĩnh vực sau:
- Nghiên cứu sinh, học viên cao học và nhà khoa học chuyên ngành Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Hóa sinh học và Dược học: Cung cấp tài liệu tham khảo về phương pháp tách chiết, tinh chế các hợp chất hữu cơ phân cực từ sinh vật biển khó xử lý bằng sắc ký thông thường.
- Các phòng thí nghiệm nghiên cứu cấu trúc hóa học: Có giá trị ứng dụng thực tiễn trong việc áp dụng kỹ thuật NMR 2D, HR ESI-MS/MS, phương pháp Mosher và GC phân tích dẫn xuất octanol-acetate để giải đoán cấu trúc và xác định cấu hình lập thể tuyệt đối của các phân tử phức tạp.
- Các nhà nghiên cứu sàng lọc dược lý sinh học biển: Cung cấp quy trình chi tiết của các mô hình thử nghiệm hoạt tính phiên mã qua gen chỉ thị Luciferase (NF-$\kappa$B, p53) và mô hình ức chế thụ tinh/phân chia phôi bào trên giao tử cầu gai Strongylocentrotus intermedius.
Câu hỏi thường gặp
1. Mẫu sao biển Archaster typicus dùng trong luận án được thu thập ở đâu và do ai định danh?
Mẫu sao biển tươi với khối lượng 7 kg được thu thập tại vùng biển Quảng Ninh vào tháng 08/2008. Mẫu được PGS. TS Đỗ Công Thung thuộc Viện Tài nguyên và Môi trường biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam giám định tên khoa học và lưu giữ tiêu bản.
2. Phương pháp nào được sử dụng để loại bỏ muối khoáng biển trong dịch chiết thô?
Dịch cô chiết cồn A (120 g) được hòa tan trong 1 lít nước cất rồi nạp lên cột sắc ký Polychrome ($\Phi = 70\text{ mm}$, $L = 260\text{ mm}$). Cột được rửa giải bằng 11 lít nước cất để loại muối khoáng. Quá trình loại muối được kiểm tra bằng dung dịch $AgNO_3\text{ 1N}$ cho đến khi dịch chảy ra không còn tạo kết tủa trắng. Sau đó, cột được rửa giải bằng 7 lít ethanol để thu nhận các phân đoạn steroid phân cực.
3. Phương pháp nào được sử dụng để xác định cấu hình tuyệt đối của gốc đường trong hợp chất A2?
Hợp chất glycoside A2 (1,0 mg) được thủy phân bằng axit trifluoroacetic (TFA) 2M ở $100^\circ\text{C}$ trong 2 giờ. Sau khi loại aglycon bằng $CHCl_3$, hỗn hợp đường được phản ứng với $(-)\text{-2-octanol}$ và TFA đậm đặc ở $130^\circ\text{C}$ trong 6 giờ, tiếp tục acetyl hóa bằng hỗn hợp pyridin/anhydrit axetic (1:1) trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Hỗn hợp dẫn xuất được phân tích bằng sắc ký khí (GC) trên máy Agilent 6580. Kết quả thời gian lưu ($t_R = 28,27; 28,86; 29,00; 29,38\text{ phút}$) hoàn toàn trùng khớp với mẫu D-glucose chuẩn.
4. Những mô hình thử nghiệm hoạt tính sinh học nào đã được thiết lập và sử dụng trong luận án?
Luận án đã thiết lập ba mô hình thử nghiệm sinh học:
- Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào bằng phương pháp so màu MTS trên dòng tế bào ung thư cổ tử cung người (HeLa) và dòng tế bào biểu mô chuột (JB6 Cl 41).
- Đánh giá hoạt tính điều hòa phiên mã các yếu tố nhân NF-$\kappa$B và p53 qua gen chỉ thị luciferase trên tế bào JB6 Cl 41 ở các nồng độ chất thử 6,25; 12,5; 25,0; 50,0 $\mu\text{M}$.
- Đánh giá hoạt tính ức chế sự thụ tinh và phát triển phôi bào giai đoạn 8 tế bào trên giao tử của loài cầu gai Strongylocentrotus intermedius.
5. Hợp chất mới A1 được xác định cấu trúc và công thức phân tử như thế nào?
Hợp chất A1 ở dạng chất rắn vô định hình, có công thức phân tử $C_{26}H_{46}O_7$ và khối lượng phân tử $M = 470$. Khối phổ phân giải cao HR-ESIMS cho pic ion giả phân tử $[M+Na]^+$ tại $m/z$ 493,3138 (phù hợp với tính toán lý thuyết cho $C_{26}H_{46}O_7Na$ là 493,3136). Phổ phân mảnh ESI-MS/MS của ion $[M-H]^-$ tại $m/z$ 469 cho các pic mất liên tiếp các phân tử nước ở $m/z$ 451, 433, 415, 397 và 379. Cấu hình tuyệt đối tại C-3, C-6 và C-24 được xác lập thông qua phổ $^1H\text{-NMR}$ của các dẫn xuất 3,6,24-tri-(S)-MTPA este và 3,6,24-tri-(R)-MTPA este, xác định tên hóa học là (24R)-27-nor-5α-cholestane-3β,4β,6α,8,14,15α,24-heptaol.
Kết luận
Luận án đã thực hiện nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của nhóm hợp chất steroid phân cực từ loài sao biển Archaster typicus thu tại vùng biển Quảng Ninh, Việt Nam. Tác giả đã phân lập và xác định cấu trúc của nhiều hợp chất steroid phân cực, trong đó có các hợp chất mới thuộc nhóm polyhydroxy steroid (AT4, A1, A3), steroid sulfate (A4, A5) và glycoside steroid (Archasteroside A–C). Nghiên cứu đã áp dụng các phương pháp phổ học hiện đại kết hợp dẫn xuất hóa Mosher và sắc ký khí để làm sáng tỏ cấu hình lập thể phân tử. Các kết quả thực nghiệm đóng góp dữ liệu khoa học về hóa học các hợp chất thiên nhiên từ sinh vật biển Da gai tại Việt Nam và cung cấp cơ sở cho các định hướng nghiên cứu phát triển hóa dược tiếp theo.
