Tổng quan luận án

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Trong lĩnh vực y dược hiện đại, có hơn 10.000 hợp chất có hoạt tính sinh học được sử dụng làm thuốc điều trị. Việc kiểm soát hàm lượng hoạt chất trong nguyên liệu, dạng thuốc bào chế cũng như theo dõi quá trình chuyển hóa, đào thải của thuốc trong dịch sinh học người (nước tiểu, huyết tương) đóng vai trò quyết định đối với việc đánh giá liều dùng, hiệu quả điều trị, thử nghiệm tương đương sinh học và sinh khả dụng.

Các phương pháp phân tích thường quy được quy định trong Dược điển chủ yếu là sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), sắc ký khí (GC), sắc ký ghép khối phổ (LC-MS, GC-MS) và các phương pháp trắc quang (UV-Vis, IR). Mặc dù phương pháp HPLC có độ chính xác cao nhưng đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền, chi phí phân tích lớn và quy trình chuẩn bị mẫu phức tạp. Do đó, việc nghiên cứu xây dựng các phương pháp phân tích có độ chọn lọc cao, độ đúng tốt, quy trình thực hiện đơn giản, giá thành thấp để áp dụng kiểm tra song hành với các phương pháp dược điển là yêu cầu thực tiễn cấp bách.

Phương pháp von-ampe hòa tan hấp phụ (Adsorptive Stripping Voltammetry - AdSV) kết hợp các kỹ thuật đo xung hiện đại là một hướng phân tích công cụ có độ nhạy rất cao nhờ giai đoạn tích lũy làm giàu chất trên bề mặt điện cực. Tuy nhiên, tại Việt Nam vào thời điểm thực hiện đề tài, các nghiên cứu ứng dụng phương pháp AdSV cho các hợp chất hữu cơ có hoạt tính sinh học còn hạn chế; cơ chế và đặc tính điện hóa của nhiều nhóm thuốc chưa được làm sáng tỏ đầy đủ trên các hệ điện cực khác nhau. Nhằm giải quyết vấn đề này, đề tài "Khảo sát tính chất đặc trưng von-ampe của một số hợp chất có hoạt tính sinh học và ứng dụng trong phân tích" đã được thực hiện.

Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu

Luận án xác định các mục tiêu và nhiệm vụ cụ thể:

  1. Nghiên cứu tính chất điện hóa của ba hoạt chất nifedipin, amlodipin besylat và cephalexin bằng phương pháp von-ampe vòng (CV) và phương pháp von-ampe hòa tan hấp phụ (AdSV).
  2. Khảo sát, lý giải các quá trình khử, oxy hóa xảy ra trên bề mặt điện cực giọt thủy ngân treo (HMDE) và điện cực than gương (GCE); sử dụng phương pháp phổ tổng trở điện hóa (EIS) trên điện cực than gương để chứng minh đặc tính hấp phụ và tính toán lượng chất hấp phụ trên bề mặt điện cực.
  3. Nghiên cứu quy trình xử lý mẫu dịch sinh học (mẫu nước tiểu) bằng kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) và kỹ thuật kết tủa.
  4. Xây dựng quy trình và ứng dụng phương pháp von-ampe hòa tan hấp phụ để định lượng nifedipin, amlodipin besylat và cephalexin trong các mẫu thuốc dạng bào chế và mẫu nước tiểu thực tế của bệnh nhân điều trị.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

  • Đối tượng nghiên cứu: Ba hoạt chất có hoạt tính sinh học nằm trong danh mục thuốc thiết yếu:
    • Nifedipin ($C_{17}H_{18}O_6N_2$, $M = 346,3$): Thuốc chẹn kênh canxi thuộc dẫn xuất 1,4-dihydropyridin, tác dụng hạ huyết áp và chống đau thắt ngực.
    • Amlodipin besylat: Dẫn xuất của dihydropyridin, thuốc đối kháng canxi dùng điều trị tăng huyết áp và đau thắt ngực.
    • Cephalexin: Kháng sinh diệt khuẩn nhóm cephalosporin thế hệ 1, có cấu trúc vòng $\beta$-lactam liên kết với vòng dihydrothiazin.
  • Phạm vi nghiên cứu:
    • Khảo sát các thông số điện hóa và điều kiện tích lũy/hòa tan trên điện cực giọt thủy ngân treo (HMDE) và điện cực than gương (GCE).
    • Đối tượng phân tích thực tế gồm các mẫu thuốc thành phẩm lưu hành trên thị trường và các mẫu nước tiểu của người bệnh sau khi uống thuốc theo các mốc thời gian.
    • Địa điểm thực hiện: Bộ môn Hóa phân tích, Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội (bảo vệ năm 2012).

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trước đây

Luận án đã tổng quan hệ thống các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế về các phương pháp định lượng nifedipin, amlodipin besylat và cephalexin:

  1. Phương pháp xác định Nifedipin:

    • Phương pháp hóa học/chuẩn độ: Chuẩn độ bằng dung dịch ceri sunfat $0,1\text{ M}$ trong môi trường axit perchloric với chỉ thị o-phenanthrolin ($1\text{ ml } Ce(SO_4)2\text{ }0,1\text{ M} \equiv 17,32\text{ mg } C{17}H_{18}N_2O_6$).
    • Phương pháp HPLC: Sử dụng pha tĩnh C18, detector UV tại bước sóng $235\text{ nm}$ hoặc detector điện hóa với giới hạn định lượng (LOQ) đạt $1,0\text{ ng/ml}$ trong huyết thanh người.
    • Phương pháp trắc quang: Nhóm tác giả Rahman (2005, 2006) định lượng nifedipin dựa trên phản ứng tạo màu giữa nhóm nitro với KOH trong nền dimethyl sulphoxide (DMSO) đo tại bước sóng $430\text{ nm}$, hoặc phản ứng với amoni molybdat ở $100^\circ\text{C}$ đo ở $830\text{ nm}$.
    • Phương pháp điện hóa: Sử dụng von-ampe hòa tan trên điện cực HMDE trong nền đệm Britton-Robinson (pH 11,0) hoặc nền KCl, điện cực than gương hoạt hóa (GCE), điện cực than mềm biến tính (CPE) với giới hạn phát hiện từ $1,35\text{ mg/l}$ đến $3,46\text{ mg/l}$.

  2. Phương pháp xác định Amlodipin besylat:

    • Phương pháp trắc quang: Nhóm tác giả Shama, Amin, Mabrouk và Omara (2004) xác định amlodipin dựa vào phản ứng oxy hóa với $KMnO_4$ dư trong môi trường axit rồi đo độ giảm hấp thụ của các thuốc thử màu (metylen xanh, axit xanh 74, axit đỏ 73, amaranth, axit da cam 7); Basavaiah (2005) dùng hệ $BrO_3^- - Br^-$ và metyl da cam; Golcu, Yucesoy (2006) tạo phức với bromophenol xanh tại pH 3,2 chiết vào clorofom đo tại $414\text{ nm}$; Rahman và Azmi (2001) phản ứng với ninhydrin trong DMF đo tại $595\text{ nm}$.
    • Phương pháp HPLC: Dược điển Việt Nam quy định cột C18 ($5,\mu\text{m}$), detector UV tại $237\text{ nm}$, pha động hỗn hợp axetonitril - metanol - trietylamin/axit photphoric (pH 3,0).
    • Phương pháp von-ampe: Gazy (2004) xác định amlodipin besylat dựa trên phản ứng oxy hóa nhóm 1,4-dihydropyridin trên điện cực GCE và CPE trong đệm Britton-Robinson (pH 11,0) với giới hạn phát hiện $7,92,\mu\text{g/l}$.

  3. Phương pháp xác định Cephalexin:

    • Phương pháp HPLC: Dược điển quy định pha động metanol - axetonitril - $KH_2PO_4\text{ }0,136%$ - nước ($2:5:10:83$), detector UV tại bước sóng $254\text{ nm}$.
    • Phương pháp cực phổ và von-ampe: Yet Benner xác định trong nền $H_2SO_4\text{ }0,125\text{ M}$ tại thế đỉnh $-1,25\text{ V}$ (so với SCE); Fogg (1979) đo cực phổ sản phẩm thủy phân; Xu và cộng sự (2004) nghiên cứu phản ứng khử của cephalexin trong môi trường $HCl\text{ }0,03\text{ M}$ tại $-1,24\text{ V}$ có mặt xúc tác $H_2O_2$; Chailapakul (2001) dùng điện cực kim cương pha tạp bo (BDD).

Khoảng trống nghiên cứu được luận án lựa chọn giải quyết

  • Đa số các nghiên cứu điện hóa trước đây chỉ tập trung vào một loại điện cực riêng lẻ hoặc chưa khai thác đồng thời các kỹ thuật xung khác nhau (như xung thường NP và xung vi phân DP) để nâng cao độ nhạy cho nifedipin.
  • Chưa có công trình sử dụng phương pháp phổ tổng trở điện hóa (EIS) để mô tả quá trình điện cực và định lượng lượng chất hấp phụ của nifedipin và amlodipin besylat trên bề mặt điện cực than gương.
  • Tính chất điện hóa của sản phẩm thủy phân kiềm của cephalexin chưa được khảo sát có hệ thống bằng kỹ thuật DP-AdSV trên HMDE để ứng dụng định lượng nồng độ vết.
  • Thiếu các quy trình xử lý mẫu dịch sinh học (nước tiểu) hoàn chỉnh, kinh tế bằng kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) và kết tủa hóa học tương thích trực tiếp với phép đo von-ampe hòa tan hấp phụ.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết của phương pháp Von-ampe hòa tan hấp phụ (AdSV)

Phương pháp AdSV bao gồm ba giai đoạn kế tiếp nhau trong một chu trình đo:

  1. Giai đoạn làm giàu (tích lũy động): Chất phân tích được tích lũy lên bề mặt điện cực làm việc thông qua quá trình hấp phụ tại một thế tích lũy cố định ($E_{acc}$) trong thời gian xác định ($t_{acc}$), có khuấy dung dịch để tăng cường chuyển khối.
  2. Giai đoạn dừng (cân bằng): Ngừng khuấy trong một khoảng thời gian ngắn ($t_{eq} \approx 5 - 10\text{ s}$) để dung dịch chuyển từ trạng thái động sang trạng thái tĩnh và chất phân bố ổn định trên bề mặt điện cực.
  3. Giai đoạn hòa tan tĩnh: Phân cực điện cực bằng cách quét thế tuyến tính kết hợp điều chế xung theo chiều catot (quét về phía âm để khử) hoặc theo chiều anot (quét về phía dương để oxy hóa) nhằm giải hấp/phản ứng chất đã hấp phụ và ghi nhận tín hiệu dòng đỉnh ($I_p$).

Tín hiệu dòng hòa tan tuân theo phương trình của Pihlar, Valenta và Nürnberg: $$Q = n \cdot F \cdot S \cdot C_0$$ Trong đó:

  • $Q$ là điện lượng tiêu tốn cho phản ứng điện cực (C).
  • $n$ là số electron trao đổi trong phản ứng.
  • $F$ là hằng số Faraday ($96.485\text{ C/mol}$).
  • $S$ là diện tích bề mặt điện cực ($\text{cm}^2$).
  • $C_0$ là nồng độ bề mặt của chất hấp phụ trên điện cực ($\text{mol/cm}^2$).

Dòng đỉnh hòa tan ($I_p$) tỷ lệ thuận với nồng độ chất trong dung dịch ($C$) theo quan hệ: $$I_p = K \cdot C$$ (với $K$ là hệ số phụ thuộc vào các điều kiện tích lũy và thông số kỹ thuật đo).

Kỹ thuật đo và thiết bị phân tích

  • Kỹ thuật von-ampe:
    • Von-ampe vòng (CV): Khảo sát cơ chế oxy hóa khử, tính thuận nghịch và bản chất dòng hấp phụ.
    • Von-ampe xung vi phân (DP): Đặt các xung vuông góc biên độ $\Delta E = 10 - 100\text{ mV}$, đo dòng hai lần trước và sau xung để triệt tiêu dòng dung dịch tụ.
    • Von-ampe xung thường (NP): Đặt các xung có biên độ tăng dần từ thế nền $E_{base}$, đo dòng ở cuối xung.
    • Von-ampe hòa tan catot (CSV) và von-ampe hòa tan anot (ASV).
  • Phổ tổng trở điện hóa (EIS): Đo trên hệ điện cực than gương (GCE) tại các dải thế khác nhau, xây dựng đồ thị Nyquist và mô phỏng mạch điện tương đương để tính toán các tham số điện trở dung dịch ($R_s$), điện trở truyền điện tích ($R_{ct}$), điện dung lớp kép ($C_{dl}$) và lượng chất hấp phụ ($\Gamma$).
  • Hệ điện cực:
    • Điện cực làm việc: Điện cực giọt thủy ngân treo (HMDE), điện cực than gương (GCE).
    • Điện cực so sánh: $Ag/AgCl/KCl\text{ }3\text{ M}$.
    • Điện cực phụ trợ: Dây platin (Pt).
  • Kỹ thuật xử lý mẫu dịch sinh học:
    • Chiết pha rắn (SPE): Cột chiết C18 ($200\text{ mg}$, kích thước hạt $10,\mu\text{m}$, thể tích cột $3\text{ ml}$).
    • Phương pháp kết tủa protein/tạp chất: Sử dụng dung dịch $NaOH\text{ }0,2\text{ M}$, $ZnSO_4\text{ }5%$ và etanol $95%$.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 hệ thống hóa cơ sở lý thuyết về cấu tạo, tính chất dược lý, dược động học và hành vi điện hóa của ba hợp chất nghiên cứu:

  • Nifedipin: Khử nhóm nitrophenyl đặc trưng ($ArNO_2 + 4e + 4H^+ \to ArNHOH + H_2O$). Trong môi trường axit mạnh có thêm sóng khử hydroxylamin thành amin ($RNHOH_2^+ + 2e + H^+ \to RNH_2 + H_2O$). Trong môi trường kiềm hoặc dung môi aprotic, quá trình khử phân tách thành hai giai đoạn tạo gốc anion nitro ($RNO_2^{\bullet-}$).
  • Amlodipin besylat: Quá trình oxy hóa bất thuận nghịch tại vòng 1,4-dihydropyridin có sự tham gia của 2 electron trên điện cực rắn (GCE, CPE).
  • Cephalexin: Vòng $\beta$-lactam bền trong môi trường axit nhưng dễ bị thủy phân mở vòng trong môi trường kiềm tạo thành sản phẩm có hoạt tính điện hóa rất mạnh trên điện cực thủy ngân.
  • Tổng quan nguyên tắc phương pháp AdSV, ưu thế so với các kỹ thuật điện hóa truyền thống, các thông số ảnh hưởng và phương pháp xử lý nền mẫu sinh học phức tạp.

Chương 2: Nội dung và phương pháp nghiên cứu

Trình bày chi tiết quy trình thực nghiệm và phương pháp nghiên cứu:

  • Xây dựng tiến trình đo CV, DP-AdSV, NP-AdSV, đo tổng trở EIS và đo ảnh hưởng của nhiệt độ đối với dòng hòa tan.
  • Khảo sát các điều kiện thủy phân kiềm cephalexin: ảnh hưởng của nồng độ kiềm ($NaOH$), nhiệt độ đun và thời gian phản ứng, đánh giá độ bền của sản phẩm thủy phân theo thời gian.
  • Thiết lập quy trình chiết pha rắn SPE trên cột C18 và quy trình kết tủa mẫu nước tiểu cho từng hợp chất.
  • Phương pháp đánh giá phương pháp phân tích: Xác định khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), độ lệch chuẩn tương đối (RSD) và hiệu suất thu hồi ($R_e$).

Chương 3: Kết quả nghiên cứu và bàn luận

1. Nghiên cứu tính chất điện hóa của Nifedipin

  • Trên điện cực HMDE:
    • Đường CV thể hiện một pic catot bất thuận nghịch tương ứng với sự khử nhóm $-NO_2$. Sự phụ thuộc tuyến tính giữa $\log I_p$ và $\log v$ khẳng định quá trình điện cực bị khống chế bởi sự hấp phụ (hấp phụ đa lớp).
    • So sánh kỹ thuật ghi đo: Nghiên cứu sinh lần đầu áp dụng kỹ thuật xung thường (NP-AdSV) và nhận thấy cường độ dòng hòa tan của nifedipin cao hơn rõ rệt so với kỹ thuật xung vi phân (DP-AdSV).
    • Các điều kiện đo tối ưu trên HMDE: Thế tích lũy $E_{acc} = -0,2\text{ V}$; đệm Britton-Robinson pH 4,0; nhiệt độ $25^\circ\text{C} - 35^\circ\text{C}$; thời gian tích lũy $t_{acc} = 30\text{ s}$ (đối với dải $10^{-6}\text{ M} - 10^{-5}\text{ M}$), $t_{acc} = 60\text{ s}$ ($10^{-7}\text{ M} - 10^{-6}\text{ M}$) và $t_{acc} = 120\text{ s}$ ($10^{-8}\text{ M} - 10^{-7}\text{ M}$).
    • Giới hạn phát hiện đạt được: $LOD = 0,95 \cdot 10^{-9}\text{ M}$ (đối với DP-AdSV) và $LOD = 0,54 \cdot 10^{-9}\text{ M}$ (đối với NP-AdSV).
  • Trên điện cực GCE:
    • Nifedipin thể hiện đồng thời cả tính chất khử và tính chất oxy hóa (các pic đều bất thuận nghịch).
    • Kết quả đo phổ tổng trở điện hóa (EIS) và đồ thị Nyquist tại các vùng thế khác nhau đã mô tả sự biến đổi trở kháng lớp kép, cho phép xác định mạch điện tương đương và tính toán mật độ hấp phụ của nifedipin trên bề mặt GCE.

2. Nghiên cứu tính chất điện hóa của Amlodipin besylat

  • Trên điện cực GCE:
    • Amlodipin besylat bị oxy hóa bất thuận nghịch 2 electron tại nhóm dihydropyridin, thể hiện quá trình hấp phụ đơn lớp trên bề mặt điện cực than gương.
    • Điều kiện tối ưu cho phương pháp DP-AdSV (quét thế anot): Thế tích lũy $E_{acc} = 0\text{ V}$; nền đệm Britton-Robinson pH 5,0; tốc độ quét thế $v = 12,5\text{ mV/s}$; thời gian tích lũy $t_{acc} = 60\text{ s}$ (cho dải $10^{-6}\text{ M} - 10^{-5}\text{ M}$) và $t_{acc} = 120\text{ s}$ (cho dải $10^{-7}\text{ M} - 10^{-6}\text{ M}$).
    • Giới hạn phát hiện của amlodipin besylat trên GCE đạt $LOD = 5,1 \cdot 10^{-9}\text{ M}$.
    • Phổ tổng trở EIS ghi tại các thế từ $0\text{ V}$ đến $-1,2\text{ V}$ giúp mô phỏng chính xác mạch tương đương và xác định lượng hấp phụ bề mặt của amlodipin.

3. Nghiên cứu tính chất điện hóa của Cephalexin

  • Trên điện cực HMDE:
    • Khảo sát phản ứng thủy phân: Cephalexin nguyên bản cho tín hiệu điện hóa yếu, nhưng sau khi thủy phân bằng dung dịch $NaOH\text{ }0,2\text{ M}$ ở $90^\circ\text{C}$ trong $15\text{ phút}$, sản phẩm tạo thành có hoạt tính điện hóa cao và hấp phụ rất mạnh lên HMDE.
    • Phản ứng điện cực của sản phẩm thủy phân có tính chất gần thuận nghịch, trong đó pic catot có cường độ dòng cao hơn pic anot hơn 20 lần nên được chọn để phân tích định lượng.
    • Điều kiện đo tối ưu DP-AdSV: Thế tích lũy $E_{acc} = -0,3\text{ V}$; môi trường $NaOH\text{ }0,2\text{ M}$; tốc độ quét $v = 12,5\text{ mV/s}$; thời gian tích lũy $t_{acc} = 60\text{ s}$ (dải $10^{-6}\text{ M} - 10^{-5}\text{ M}$) và $t_{acc} = 120\text{ s}$ (dải $10^{-8}\text{ M} - 10^{-7}\text{ M}$).
    • Giới hạn phát hiện đạt $LOD = 4,8 \cdot 10^{-9}\text{ M}$.

4. Ứng dụng phân tích mẫu thuốc và mẫu nước tiểu

  • Phân tích mẫu thuốc dạng bào chế: Phương pháp DP-AdSV và NP-AdSV đã định lượng chính xác hàm lượng nifedipin (viên nén/nang), amlodipin besylat (viên nén) và cephalexin (viên nang) với kết quả phù hợp với hàm lượng ghi trên nhãn và phương pháp đối chứng.
  • Xử lý và phân tích mẫu nước tiểu:
    • Mẫu nước tiểu không xử lý: Xuất hiện các pic cản trở từ các hợp chất nội sinh trong nước tiểu chồng lấn lên pic của hoạt chất, làm mất tính tuyến tính của đường chuẩn thêm.
    • Xử lý nifedipin: Phương pháp SPE trên cột C18 (rửa tạp bằng đệm BR pH 6,0 và aceton:nước 1:5; rửa giải bằng aceton) cho độ thu hồi $R_e = 97,5% - 104,0%$. Phương pháp kết tủa ($NaOH + ZnSO_4 + \text{etanol}$) cho độ thu hồi $R_e = 94,7% - 97,0%$.
    • Xử lý amlodipin besylat: Phương pháp kết tủa bằng $NaOH\text{ }0,2\text{ M} + ZnSO_4\text{ }5%$ cho độ thu hồi $R_e = 84,0% - 110,0%$ (mẫu giả định đạt $86,0%$).
    • Xử lý cephalexin: Chiết qua cột C18, rửa giải bằng hỗn hợp axetonitril : metanol : đệm axetat pH 4,5 ($10:10:80$), sau đó đem thủy phân kiềm bằng $NaOH\text{ }2\text{ M}$ ở $90^\circ\text{C}$ trong $15 - 20\text{ phút}$, độ thu hồi đạt $R_e = 94,6% - 110,0%$.

Dưới đây là bảng tổng hợp số liệu thực nghiệm định lượng cephalexin trong mẫu nước tiểu của người bệnh:

Bệnh nhân Liều dùng Thời điểm lấy mẫu nước tiểu Hàm lượng Cephalexin tìm thấy ($\text{mg/ml}$)
Bệnh nhân 1 (MS1) Uống 2 viên $500\text{ mg}$ Sau 1 đêm uống thuốc ($6\text{h}30\text{p}$) 2,17
Bệnh nhân 1 (MS2) Uống 2 viên $500\text{ mg}$ Sau 1 giờ uống thuốc buổi sáng 1,95
Bệnh nhân 1 (MS3) Uống 2 viên $500\text{ mg}$ Sau 2 giờ uống cùng ngày 1,82
Bệnh nhân 1 (MS4) Uống 2 viên $500\text{ mg}$ Sau 13 giờ uống cùng ngày 0,13
Bệnh nhân 2 (MS1) Uống 2 viên $250\text{ mg}$ Sau 7 giờ ($V_u = 380\text{ ml}$) 0,97
Bệnh nhân 2 (MS2) Uống 2 viên $250\text{ mg}$ Sau 1 giờ 1,04
Bệnh nhân 2 (MS3) Uống 2 viên $250\text{ mg}$ Sau 2 giờ 1,01
Bệnh nhân 2 (MS4) Uống 2 viên $250\text{ mg}$ Sau 13 giờ 0,07
Bệnh nhân 2 (MS5) Uống 2 viên $250\text{ mg}$ Sau 6 giờ qua đêm ($V_u = 350\text{ ml}$) 1,11
BN6 Uống 2 viên $250\text{ mg}$ Sau 2 giờ ($V_u = 320\text{ ml}$) 1,02
BN7 Uống 2 viên $250\text{ mg}$ Sau 2 giờ 0,91
BN8 Uống 2 viên $250\text{ mg}$ Sau 2 giờ ($V_u = 410\text{ ml}$) 0,88
BN9 Uống 2 viên $250\text{ mg}$ Sau 2 giờ 1,08
BN10 Uống 2 viên $250\text{ mg}$ Sau 2 giờ 0,92

Kết quả phân tích nước tiểu thực tế phù hợp với các dữ liệu dược động học đã công bố: thuốc được đào thải chủ yếu qua nước tiểu ở dạng không đổi trong những giờ đầu sau khi uống.

Kết quả và những đóng góp mới

  1. Về tính chất điện hóa của nifedipin: Đã làm sáng tỏ tính chất khử bất thuận nghịch theo cơ chế hấp phụ đa lớp trên điện cực HMDE; chứng minh nifedipin có cả tính oxi hóa và khử trên điện cực than gương GCE. Lần đầu tiên nghiên cứu đặc tính hấp phụ của nifedipin bằng kỹ thuật xung thường (NP-AdSV), cho thấy tín hiệu dòng cao hơn và giới hạn phát hiện thấp hơn ($LOD = 0,54 \cdot 10^{-9}\text{ M}$) so với kỹ thuật xung vi phân ($LOD = 0,95 \cdot 10^{-9}\text{ M}$).
  2. Về tính chất điện hóa của amlodipin besylat: Đã xác định amlodipin besylat bị oxy hóa bất thuận nghịch 2 electron tại nhóm dihydropyridin và hấp phụ đơn lớp trên bề mặt điện cực GCE; thiết lập các điều kiện tối ưu xác định bằng DP-AdSV ($E_{acc} = 0\text{ V}$, pH 5,0, $LOD = 5,1 \cdot 10^{-9}\text{ M}$).
  3. Về tính chất điện hóa của cephalexin: Đã khảo sát có hệ thống phản ứng thủy phân cephalexin trong môi trường kiềm ($NaOH\text{ }0,2\text{ M}$, $90^\circ\text{C}$, $15\text{ phút}$) tạo sản phẩm có hoạt tính điện hóa và hấp phụ mạnh trên HMDE; thiết lập quy trình DP-AdSV với pic khử catot ($E_{acc} = -0,3\text{ V}$, $LOD = 4,8 \cdot 10^{-9}\text{ M}$).
  4. Về ứng dụng phổ tổng trở điện hóa (EIS): Lần đầu tiên áp dụng phương pháp EIS để nghiên cứu tính chất điện hóa của nifedipin và amlodipin besylat trên điện cực GCE; xây dựng mạch điện tương đương, mô phỏng diễn biến quá trình bề mặt và tính toán lượng chất hấp phụ, góp phần làm sáng tỏ cơ chế của phương pháp AdSV.
  5. Về quy trình xử lý mẫu dịch sinh học: Đã xây dựng và tối ưu hóa thành công hai quy trình xử lý mẫu nước tiểu:
    • Quy trình chiết pha rắn (SPE) trên cột C18 cho nifedipin ($R_e = 97,5% - 104,0%$) và cephalexin ($R_e = 94,6% - 110,0%$).
    • Quy trình kết tủa bằng $ZnSO_4$ trong môi trường kiềm cho nifedipin ($R_e = 94,7% - 97,0%$) và amlodipin besylat ($R_e = 84,0% - 110,0%$).
  6. Về khả năng ứng dụng thực tế: Đã ứng dụng thành công các quy trình đề xuất để phân tích hàm lượng hoạt chất trong các chế phẩm thuốc thương mại và theo dõi nồng độ đào thải thuốc trong nước tiểu của bệnh nhân thực tế.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế về thiết bị: Do giới hạn của trang thiết bị đo điện hóa tại thời điểm nghiên cứu, phổ tổng trở điện hóa (EIS) chỉ thực hiện được trên điện cực rắn (GCE), chưa thực hiện được phép đo tổng trở trên điện cực giọt thủy ngân treo (HMDE).
  • Phạm vi đối tượng mẫu: Luận án tập trung khảo sát trên mẫu nước tiểu; chưa triển khai trực tiếp phân tích trên nền mẫu huyết tương hoặc máu toàn phần trong phần thực nghiệm ứng dụng.
  • Hướng nghiên cứu tiếp:
    • Mở rộng nghiên cứu cơ chế và quy trình AdSV cho các kháng sinh khác cùng họ cephalosporin (thế hệ 2, 3, 4).
    • Nghiên cứu chế tạo và ứng dụng các loại điện cực biến tính mới (điện cực biến tính hạt nano kim loại, ống nano cacbon) thay thế cho điện cực thủy ngân để thân thiện hơn với môi trường.
    • Áp dụng phương pháp phân tích trên mẫu huyết tương nhằm phục vụ trực tiếp các nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học toàn diện của thuốc.

Giá trị tham khảo

  • Đối với nghiên cứu sinh và học viên chuyên ngành Hóa phân tích, Điện hóa học: Luận án là tài liệu tham khảo chi tiết về phương pháp luận nghiên cứu quá trình điện cực, cách kết hợp giữa các kỹ thuật von-ampe hiện đại (CV, DP, NP, CSV, ASV) và phổ tổng trở điện hóa (EIS) để khảo sát đặc tính hấp phụ của các hợp chất hữu cơ.
  • Đối với các phòng kiểm nghiệm dược phẩm và trung tâm kiểm nghiệm tương đương sinh học: Cung cấp quy trình phân tích định lượng vi lượng nifedipin, amlodipin besylat và cephalexin với chi phí thấp, thiết bị đơn giản nhưng đạt độ nhạy tương đương sắc ký, có thể sử dụng làm phương pháp kiểm tra độc lập hoặc song hành với HPLC.
  • Đối với lĩnh vực dược lý và hóa sinh lâm sàng: Cung cấp quy trình chiết tách mẫu dịch sinh học (SPE, kết tủa) nhanh gọn, hạn chế ảnh hưởng của nền mẫu protein và hợp chất nội sinh, hỗ trợ việc theo dõi dược động học và thải trừ thuốc ở bệnh nhân.

Câu hỏi thường gặp

1. Quá trình điện cực của nifedipin trên điện cực giọt thủy ngân treo (HMDE) và điện cực than gương (GCE) khác nhau như thế nào?

Trên HMDE trong môi trường đệm Britton-Robinson (pH 2,0 - 11,0), nifedipin chỉ thể hiện tính chất khử bất thuận nghịch tại nhóm nitrophenyl (trao đổi 4 electron và 4 proton tạo dẫn xuất phenylhydroxyamin), quá trình bị khống chế bởi hấp phụ đa lớp. Trên GCE, nifedipin thể hiện cả tính chất oxy hóa và tính chất khử, các pic đều có bản chất bất thuận nghịch.

2. Tại sao cần phải thủy phân trong môi trường kiềm trước khi xác định cephalexin bằng phương pháp DP-AdSV?

Cephalexin nguyên bản trong môi trường trung tính hoặc axit có hoạt tính điện hóa rất yếu trên điện cực thủy ngân. Khi đun nóng ở $90^\circ\text{C}$ trong dung dịch $NaOH\text{ }0,2\text{ M}$ trong 15 phút, vòng $\beta$-lactam bị mở tạo thành sản phẩm thủy phân có hoạt tính điện hóa cao và khả năng hấp phụ rất mạnh trên HMDE, cho pic khử catot rõ nét có cường độ lớn gấp hơn 20 lần so với pic oxy hóa.

3. Kỹ thuật xung thường (NP-AdSV) thể hiện ưu thế gì so với kỹ thuật xung vi phân (DP-AdSV) trong phân tích nifedipin?

Kỹ thuật NP-AdSV cho tín hiệu cường độ dòng hòa tan cao hơn và đường nền phẳng hơn đối với các chất hữu cơ có khả năng hấp phụ mạnh và tốc độ hấp phụ nhanh như nifedipin. Giới hạn phát hiện của nifedipin khi đo bằng NP-AdSV đạt $0,54 \cdot 10^{-9}\text{ M}$, thấp hơn so với kỹ thuật DP-AdSV ($0,95 \cdot 10^{-9}\text{ M}$).

4. Tại sao mẫu nước tiểu không thể đo trực tiếp bằng phương pháp von-ampe hòa tan mà bắt buộc phải xử lý tách tạp?

Trong mẫu nước tiểu chưa xử lý, các hợp chất nội sinh và chất hoạt động bề mặt bị hấp phụ cạnh tranh lên điện cực làm việc và tạo ra các pic nền cao, nằm sát hoặc chồng lấn lên thế đỉnh pic ($E_p$) của chất cần phân tích. Điều này làm mất mối quan hệ tuyến tính giữa dòng hòa tan và nồng độ khi thêm chuẩn, dẫn đến sai số lớn trong phép định lượng.

5. Phương pháp phổ tổng trở điện hóa (EIS) đã đóng góp thông tin gì cho việc giải thích cơ chế hấp phụ của thuốc?

Phương pháp EIS cung cấp các thông số trở kháng lớp kép thông qua đồ thị Nyquist tại các khoảng thế đặt vào khác nhau. Bằng cách thiết lập sơ đồ mạch điện tương đương và khớp dữ liệu thực nghiệm, tác giả đã tính toán được điện trở truyền điện tích ($R_{ct}$), điện dung lớp kép ($C_{dl}$) và lượng chất hấp phụ ($\Gamma$) trên bề mặt điện cực than gương GCE, từ đó khẳng định và lượng hóa đặc tính hấp phụ của nifedipin và amlodipin besylat.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Nguyễn Thị Kim Thường đã nghiên cứu toàn diện các đặc tính điện hóa và cơ chế hấp phụ của ba hoạt chất nifedipin, amlodipin besylat và cephalexin trên hệ điện cực HMDE và GCE bằng các phương pháp von-ampe hòa tan hấp phụ hiện đại kết hợp phổ tổng trở điện hóa. Các điều kiện thực nghiệm tối ưu, kỹ thuật đo xung (DP, NP) và phương pháp xử lý mẫu dịch sinh học (SPE, kết tủa) đã được thiết lập chặt chẽ, đạt giới hạn phát hiện ở mức nồng độ nano mol/lít ($10^{-9}\text{ M}$) và độ thu hồi cao. Kết quả phân tích thành công trên các dạng thuốc bào chế và mẫu nước tiểu bệnh nhân đã chứng minh tính đúng đắn, độ tin cậy và giá trị ứng dụng thực tiễn của phương pháp trong kiểm nghiệm dược phẩm và nghiên cứu dược động học.