Đặt vấn đề Họ Lan (danh pháp khoa học: Orchidaceae) là một họ thực vật có hoa, thuộc bộ Măng tây (Asparagales), lớp thực vật một lá mầm. Đây là một trong những họ lớn nhất của thực vật, với tổng số 865 loài thuộc 154 chi. Lan Kim Tuyến-Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl thuộc họ Lan - Orchidaceae, có phân bố rộng ở hầu hết các tỉnh Việt Nam [2] tên khác Lan Kim Tuyến lông cứng, Kim Tuyến tơ, Giải thủy tơ, Lan Gấm, Cỏ nhung, Kim cương (Anoectochilus setaceus Lindl) là một loài thực vật điển hình của chi cùng tên (Anoectochilus). Đây là một loài lan đất có mặt ở Vân Nam, Lào và Việt Nam.
Chúng sinh sống trên các triền núi đá vôi, dọc theo khe suối, dưới các tán cây to trong rừng ẩm ở độ cao 500 - 1. Chi Lan Kim Tuyến Anoectochilus ở Việt Nam hiện thống kê được 12 loài, trong đó có loài Lan Kim Tuyến Anoectochilus setaceus Blume, tên khác Anoectochilus roxburghii Wall. ex Lind [1] được biết đến nhiều bởi giá trị làm cảnh và giá trị làm thuốc. Lan Kim Tuyến là loài dược liệu quý, ít gặp thuộc loại hiếm dùng để điều trị các bệnh về tim mạc [5], bồi bổ sức khỏe cho phụ nữ sau khi sinh [33].
Đặt biệt dược liệu Lan Kim Tuyến có khả năng tiêu diệt các khối u [6], [30]. Với đặc tính quý giá về dược liệu. Do số lượng ít, mọc rải rác và còn bị khai thác quá nhiều (với hình thức khai thác chặt cả cây) nên cây đã được đưa vào Sách đỏ Việt Nam năm 2007 theo Nghị định 32/2006/NĐ-CP, xếp hạng EN A1a,c,d [2],[3] và bị cấm khai thác sử dụng mục đích thương mại. Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật việc ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nhân giống đã trở nên phổ biến.
Nuôi cấy mô tế bào tạo ra những cây trồng sạch bệnh, chất lượng tốt, độ đồng đều cao, hệ số nhân lớn và giữ được đặc tính di truyền của cây mẹ. Nhận thức được vấn đề bảo tồn và phát triển loài dược liệu quý - Lan Kim Tuyến (Anoectochilus roxburghii), chúng tôi tiến hành đề tài: “Hoàn thiện quy trình nhân giống Lan Kim Tuyến (Anoectochilus roxburghii) bằng phương pháp in vitro tại Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên”. Mục đích và yêu cầu nghiên cứu 1. Mục đích Nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng đến khả năng tạo mẫu sạch nấm và vi khuẩn, nồng độ chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh và cường độ ánh sáng tới khả năng ra rễ Lan Kim Tuyến (Anoectochilus roxburghii).
Yêu cầu - Xác định được loại hóa chất khử trùng mẫu đạt hiệu quả tốt nhất đến khả năng tạo vật liệu vô trùng phục vụ tại chỗ. - Xác định ảnh hưởng của nồng độ chất kích thích sinh trưởng (BA, GA3, TDZ, IAA) tới khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến (Anoectochilus roxburghii). - Xác định ảnh hưởng của nước dừa tới khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến (Anoectochilus roxburghii). - Xác định ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng tới khả năng ra rễ Lan Kim Tuyến (Anoectochilus roxburghii).
Ý nghĩa của đề tài 1. Ý nghĩa khoa học - Giúp sinh viên củng cố và hệ thống hoá lại kiến thức đã học vào nghiên cứu khoa học. - Biết được phương pháp nghiên cứu một vấn đề khoa học, xử lý, phân tích số liệu, trình bày một bài báo cáo khoa học 1. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài - Nâng cao hiệu quả nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô, hoàn thiện quy trình nhân nhanh giống Lan Kim Tuyến bằng phương pháp nuôi cấy in vitro, đảm bảo cung cấp số lượng cây giống có chất lượng tốt đồng đều cho quá trình sản xuất.
- Bảo tồn nguồn dược liệu quý đang có nguy cơ tuyệt chủng. 3 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Giới thiệu về cây Lan Kim Tuyến 2. Phân loại Theo hệ thống phân loại thực vật [16] Lan Kim Tuyến được phân loại như sau: Giới (regnum) Plantae Ngành Magnoliophyta Lớp Liliospida Bộ (ordo) Asparagales Họ (familia) Orchidaceae Phân họ (subfamilia) Orchidoideae Tông (tribus) Cranichideae Phân tông (subtribus) Goodyerinae Chi (genus) Anoectochilus Loài (species) roxburghii 2.
Đặc điểm hình thái cây trưởng thành Cây thảo, mọc ở đất, có thân rễ mọc dài; thân trên đất mọng nước, mang các lá mọc xoè sát đất. - Đặc điểm thân rễ: Thân rễ nằm ngang sát mặt đất, đôi khi hơi nghiêng, bò dài. Chiều dài thân rễ từ 5-12 cm, trung bình là 7,87 cm. Đường kính thân rễ từ 3-4 mm, trung bình là 3,17 mm.
Số lóng trên thân rễ từ 3-7 lóng, trung bình là 4,03 lóng. Chiều dài của lóng từ 1-6 cm, trung bình là 1,99 cm. Thân rễ thường có màu xanh trắng, đôi khi có màu nâu đỏ, thường nhẵn, không phủ lông [4]. - Đặc điểm thân khí sinh: Thân khí sinh thường mọc thẳng đứng trên mặt đất, ít khi mọc nghiêng.
Chiều dài thân khí sinh từ 4-8 cm, trung bình 6 cm. Đường kính thân khí sinh từ 3-5 mm, trung bình là 3,08 cm. Thân khí sinh mang nhiều lóng, các lóng có chiều dài khác nhau. Số lóng trên thân khí sinh thay đổi từ 2-4 lóng, trung bình là 2,87.
Chiều dài mỗi lóng từ 1-4 cm, trung bình 2,23 cm. Thân khí sinh thường mọng nước, nhẵn, không phủ lông, thường có màu xanh trắng, đôi khi có màu hồng nhạt. 4 - Rễ được mọc ra từ các mấu trên thân rễ. Đôi khi rễ cũng được hình thành từ thân khí sinh.
Rễ thường đâm thẳng xuống đất. Thông thường mỗi mấu chỉ có một rễ, đôi khi có vài rễ cùng được hình thành từ một mấu trên thân rễ. Số lượng và kích thước rễ cũng thay đổi tuỳ theo cá thể. Số rễ trên một cây thường từ 3 - 10 rễ, trung bình là 5,4 rễ.
Chiều dài của rễ thay đổi từ 0,5-8cm, rễ dài nhất trung bình là 6,07cm và ngắn nhất trung bình là 1,22cm, chiều dài trung bình của các rễ trên một cây là 3,82cm [4]. - Lá mọc cách xoắn quanh thân, xoè trên mặt đất. Lá hình trứng, gần tròn ở gốc, đầu lá hơi nhọn và có mũi ngắn, thường dài từ 3 - 4cm, trung bình là 4,03cm và rộng từ 2 - 3cm, trung bình là 3,12cm. Lá có màu nâu đỏ ở mặt trên và phủ lông mịn như nhung.
Hệ gân lá mạng lưới lông chim, thường có 5 gân gốc. Các gân này thường có màu hồng ở mặt trên và nổi rất rõ. Đôi khi gân ở giữa có màu vàng nhạt. Mặt dưới lá có màu nâu đỏ nhạt, nhẵn với 5 gân gốc nổi rõ.
Các gân bên ở phía rìa lá nổi rõ, gân ở giữa lá mặt dưới không rõ. Cuống lá dài 0,6 - 1,2cm, thường nhẵn và có màu trắng xanh, đôi khi hơi đỏ tía ở bẹ lá. Bẹ lá nổi rõ và nhẵn. Số lá trên một cây thay đổi từ 2 - 6, thông thường có 4 lá.
Kích thước của lá cũng thay đổi, các lá trên một cây thường có kích thước khác nhau rõ rệt [4]. - Đặc điểm của hoa, quả: Cụm hoa dài 10 - 20 cm ở ngọn thân, mang 4- 10 hoa mọc thưa. Lá bắc hình trứng, dài 6 - 10 mm, màu hồng. Các mảnh bao hoa dài khoảng 6 mm; cánh môi màu trắng, dài đến 1,5 cm, ở mỗi bên gốc mang 6-8 dải hẹp, đầu chẻ đôi.
Mùa hoa tháng 10 - 12. Mùa quả chín tháng 12 - 3 năm sau [4]. Đặc điểm phân bố của Lan Kim Tuyến Lan Kim Tuyến thường mọc ở dưới tán rừng nguyên sinh, hầu hết là nguyên thủy, rậm thường xanh, nhiệt đới, trên sườn núi đá granit, riclit, phiến sét, ở độ cao 500 - 1600m rải rác thành từng nhóm vài ba cây trên đất ẩm rất giàu mùn và lá cây rụng [2]. Ở Việt Nam, Lan Kim Tuyến có phổ phân bố khá rộng bao gồm: Lào Cai (Sa Pa, Liêm Phá), Hà Tĩnh, Quảng Trị, Kom Tum, Lâm Đồng, Đắk Lăk [2].
Thế giới: Ấn Độ, Nhật Bản, Butan, Trung Quốc, Mi-an-ma, Thái Lan, Lào, Cam-pu-chi-a, Ma-lay-xi-a, In-đô-nê-xi-a [2]. Số lượng quần thể Chi lan Anoectochilus có khoảng 30 - 40 loài phổ biến rộng khắp các vùng nhiệt đới từ Ấn Độ thông qua dãy Hymalaya tới các dãy núi ở Đông Nam Á, Nhật Bản, In-đô-nê-xi-a và một số đảo ở Thái Bình Dương bao gồm cả Đài Loan [30], [31]. Giá trị của Lan Kim Tuyến 2.1 Giá trị kinh tế Do tính quý hiếm, tính dược liệu và làm cây cảnh nên giá lan Kim Tyến tươi được bán trên thị trường thế giới từ 200 - 300 USD/kg, cây khô có giá 3.200 USD/kg, giá thu hái trong tự nhiên còn cao hơn nữa[22], [23], [24] nhiều nước đã trồng và xuất khẩu Lan Kim Tuyến mang lại nhiều lợi nhuận, là cây có nhiều tiềm năng sản xuất và xuất khẩu nếu cần được đầu tư đúng mức.2 Giá trị dược liệu Lan Kim Tuyến là một loại thảo dược có giá trị cao, chứa axit 4- hydroxycinnamic, β-sitosterol, β-D-glucopyranoside, 3-glucosides butanoic axit, kinsenoside cho mục đích y tế [23], [24] như có tác dụng giảm huyết áp cao [30], [32] điều trị chống viêm, xơ vữa động mạch, tiểu đường, chứng rối loạn gan, lá lách, tim, bệnh phổi [30], [22], [32] bảo vệ gan và sử dụng để chữa bệnh viêm gan [33], [34] viêm thận [23], rắn cắn [30],[23], chống khối u, ung thư và tính chống virus [23],[32], ngoài Lan Kim Tuyến còn có tác dụng điều trị hen phế quản, chống loãng xương, chống mệt mỏi [35]. Lan Kim Tuyến chứa các nguyên tố vi lượng (Fe, Co, Cu, Mn, Zn, Cr) đóng vai trò quan trọng trong nâng cao hiệu quả chống lão hóa, chuỗi polysaccharide nâng cao hiệu lực của miễn dịch trong cơ thể con người [33].
Hiện nay, rất nhiều người đã trồng loài lan này để làm thuốc sử dụng cho gia đình và trồng quy mô lớn để bán Lan Kim Tuyến thương phẩm cho các Công ty sản xuất Dược phẩm và xuất khẩu sang Trung Quốc. Tổng quan về phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 2. Khái niệm về phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật Nuôi cấy mô tế bào thực vật là thuật ngữ được dùng một cách rộng rãi để nói về việc mô tả các phương thức nuôi cấy các bộ phận thực vật (tế bào đơn, mô, cơ quan) trong ống nghiệm có chứa môi trường xác định ở điều kiện vô 6 trùng [5]. Mục đích chung của nuôi cấy mô tế bào thực vật là sử dụng các điều kiện như: nhiệt độ, ánh sáng, thành phần dinh dưỡng, các chất điều hoà sinh trưởng thực vật… để điều khiển qúa trình sinh trưởng và phát triển của tế bào, mô nuôi cấy theo mục tiêu và yêu cầu đặt ra.
Nuôi cấy mô tế bào thực vật còn là một phương pháp nghiên cứu hiệu quả nhất quá trình phát sinh hình thái ở nhiều loài thực vật.