Giải trình tự gen vi khuẩn Neisseria trong mô đúc nến bằng phương pháp Sanger

Nghiên cứu giải trình tự gen vi khuẩn Neisseria trong mô đúc nến bằng phương pháp Sanger, cung cấp thông tin quan trọng về di truyền học.

• Tác giả: Nguyễn Thị Ngọc Ánh
• Người hướng dẫn: PGS. Trần Vân Khánh
• Trường học: Đại học Y Hà Nội
• Chuyên ngành: Kỹ thuật xét nghiệm y học
• Đề tài: Giải trình tự gen vi khuẩn Neisseria trong mô đúc nến bằng phương pháp Sanger
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CÁM ƠN
• CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Vi khuẩn Neisseria Gonorrhoeae
• 1.2. Sức đề kháng
• 1.3. Khuẩn gây bệnh và cơ chế bệnh sinh
• 1.4. Đường lây truyền và biện pháp phòng ngừa
• 1.5. Phương pháp phát hiện Neisseria Gonorrhoeae
• 1.6. Các kỹ thuật sinh học phân tử
• 1.7. Tách chiết DNA từ mô đúc nến paraffin
• 1.8. Phản ứng Polymerase Chain Reaction
• 1.9. Giải trình tự gen bằng kỹ thuật giải trình tự Sanger
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4. Thiết kế nghiên cứu
• 2.5. Cỡ mẫu nghiên cứu
• 2.6. Sơ đồ nghiên cứu
• 2.7. Dụng cụ, thiết bị, hóa chất nghiên cứu
• 2.8. Quy trình nghiên cứu
• 2.9. Xử lý số liệu
• 2.10. Đạo đức trong nghiên cứu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ
• 3.1. Kết quả tách DNA bằng Kit QIAamp DNA FFPE Tissue
• 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR
• 3.3. Kết quả giải trình tự gen Sanger
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
• 4.1. Ưu và nhược điểm của mẫu mô đúc nến
• 4.2. Kết quả tách chiết DNA từ mô FFPE
• 4.3. Lựa chọn cặp mồi khuếch đại vùng 16S rRNA
• 4.4. Kết quả PCR phát hiện Neisseria Gonorrhoeae
• 4.5. Kết quả giải trình tự Sanger
• 4.6. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam và trên thế giới
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về giải trình tự gen vi khuẩn Neisseria

Giải trình tự gen vi khuẩn Neisseria là một lĩnh vực nghiên cứu quan trọng trong y học và sinh học phân tử. Vi khuẩn thuộc chi Neisseria, đặc biệt là Neisseria gonorrhoeae và Neisseria meningitidis, gây ra nhiều bệnh lý nghiêm trọng. Việc hiểu rõ về cấu trúc gen của chúng giúp phát hiện và điều trị hiệu quả hơn. Phương pháp giải trình tự gen Sanger đã được áp dụng để xác định trình tự DNA của vi khuẩn này trong các mẫu mô đúc nến.

1.1. Giới thiệu về vi khuẩn Neisseria và tầm quan trọng

Vi khuẩn Neisseria bao gồm nhiều loài, trong đó Neisseria gonorrhoeae là nguyên nhân chính gây bệnh lậu. Nghiên cứu về gen của chúng giúp hiểu rõ hơn về cơ chế gây bệnh và phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả.

1.2. Phương pháp giải trình tự gen Sanger

Phương pháp Sanger là một kỹ thuật phổ biến trong giải trình tự DNA, cho phép xác định chính xác trình tự nucleotide. Kỹ thuật này đã được áp dụng thành công trong nghiên cứu gen vi khuẩn Neisseria.

II. Thách thức trong nghiên cứu vi khuẩn Neisseria

Nghiên cứu về vi khuẩn Neisseria gặp nhiều thách thức, bao gồm khả năng kháng thuốc ngày càng tăng và sự biến đổi gen của chúng. Việc phát hiện sớm và chính xác các chủng vi khuẩn này là rất quan trọng để ngăn chặn sự lây lan của bệnh. Các mẫu mô đúc nến thường chứa ít DNA, làm cho việc tách chiết và phân tích trở nên khó khăn hơn.

2.1. Khó khăn trong việc tách chiết DNA từ mô đúc nến

Mô đúc nến chứa DNA bị phân hủy, điều này làm cho việc tách chiết DNA trở nên khó khăn. Cần có các phương pháp tối ưu để thu được lượng DNA đủ cho việc phân tích gen.

2.2. Tình trạng kháng thuốc của vi khuẩn Neisseria

Vi khuẩn Neisseria gonorrhoeae đang ngày càng kháng lại nhiều loại kháng sinh, gây khó khăn trong việc điều trị. Việc nghiên cứu gen giúp phát hiện các cơ chế kháng thuốc và phát triển các phương pháp điều trị mới.

III. Phương pháp nghiên cứu giải trình tự gen vi khuẩn Neisseria

Nghiên cứu này sử dụng phương pháp giải trình tự Sanger để xác định trình tự gen của vi khuẩn Neisseria trong mẫu mô đúc nến. Các bước thực hiện bao gồm tách chiết DNA, khuếch đại gen bằng PCR và cuối cùng là giải trình tự gen. Kết quả cho thấy sự hiện diện của vi khuẩn Neisseria trong các mẫu nghiên cứu.

3.1. Quy trình tách chiết DNA từ mô đúc nến

Quy trình tách chiết DNA từ mô đúc nến bao gồm các bước như xử lý hóa chất và ly tâm để thu được DNA tinh khiết. Điều này rất quan trọng để đảm bảo độ chính xác trong phân tích gen.

3.2. Kỹ thuật PCR trong nghiên cứu

Kỹ thuật PCR được sử dụng để khuếch đại vùng gen 16S rRNA của vi khuẩn Neisseria. Việc khuếch đại này giúp tăng cường lượng DNA cần thiết cho việc giải trình tự.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy có sự hiện diện của vi khuẩn Neisseria trong các mẫu mô đúc nến. Việc giải trình tự gen đã xác định được các trình tự tương đồng với bộ gen của vi khuẩn Neisseria. Những phát hiện này có thể được ứng dụng trong việc phát triển các phương pháp chẩn đoán và điều trị bệnh hiệu quả hơn.

4.1. Kết quả giải trình tự gen vi khuẩn Neisseria

Kết quả giải trình tự cho thấy các mẫu dương tính với vi khuẩn Neisseria có trình tự gen tương đồng với các chủng đã được công nhận. Điều này khẳng định tính chính xác của phương pháp nghiên cứu.

4.2. Ứng dụng trong chẩn đoán và điều trị

Các kết quả nghiên cứu có thể được ứng dụng trong việc phát triển các bộ kit chẩn đoán nhanh và hiệu quả cho bệnh lậu, từ đó giúp cải thiện chất lượng điều trị cho bệnh nhân.

V. Kết luận và triển vọng tương lai trong nghiên cứu

Nghiên cứu về giải trình tự gen vi khuẩn Neisseria mở ra nhiều triển vọng trong việc phát hiện và điều trị bệnh. Việc áp dụng các công nghệ mới trong nghiên cứu gen sẽ giúp nâng cao hiệu quả chẩn đoán và điều trị. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị cho y học và sinh học phân tử.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu gen vi khuẩn

Nghiên cứu gen vi khuẩn Neisseria không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế gây bệnh mà còn hỗ trợ trong việc phát triển các phương pháp điều trị mới.

5.2. Triển vọng phát triển công nghệ mới

Công nghệ giải trình tự gen ngày càng phát triển, mở ra cơ hội cho việc nghiên cứu sâu hơn về các loài vi khuẩn khác nhau và ứng dụng trong y học.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Vi khuẩn thuộc chi Neisseria gồm hơn 20 loài Gram âm cư trú trên bề mặt niêm mạc người, trong đó Neisseria gonorrhoeae và Neisseria meningitidis là hai loài gây bệnh nguy hiểm nhất. Neisseria gonorrhoeae — tác nhân gây bệnh lậu — được phân lập lần đầu tiên năm 1879 bởi Albert Neisser, và đến nay vẫn là mối lo ngại lớn của y tế cộng đồng toàn cầu. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), năm 2020 ước tính có khoảng 82,4 triệu trường hợp mắc bệnh lậu mới trên toàn cầu. Tại Hoa Kỳ, năm 2020 có 677.769 ca mắc mới được báo cáo cho CDC, khiến bệnh lậu trở thành bệnh lây nhiễm qua đường tình dục phổ biến thứ hai tại nước này. Ở Việt Nam, ước tính khoảng 50.000 ca mắc mới Neisseria gonorrhoeae mỗi năm; tỷ lệ kháng kháng sinh của vi khuẩn này ngày càng gia tăng, gây nhiều khó khăn trong chẩn đoán và điều trị.

Một thách thức thực tiễn nổi bật là mẫu bệnh phẩm mô tươi không bảo quản được lâu và không có giá trị cho các nghiên cứu hồi cứu. Mô đúc nến (Formalin Fixed Paraffin Embedded — FFPE) khắc phục hạn chế này bằng cách bảo quản bệnh phẩm trong paraffin, giữ nguyên hình thái và cấu trúc mô trong thời gian dài với chi phí thấp, đồng thời là nguồn vật liệu có giá trị cho các nghiên cứu phát hiện đột biến và định danh vi khuẩn, vi rút.

Mục tiêu nghiên cứu được tác giả xác định gồm hai nhiệm vụ:

1. Khuếch đại vùng 16S rRNA của vi khuẩn chi Neisseria bằng kỹ thuật PCR từ mẫu mô đúc nến.
2. Giải trình tự những mẫu dương tính với Neisseria bằng phương pháp giải trình tự Sanger.

Đối tượng nghiên cứu: 17 mẫu mô đúc nến lấy từ khu vực hầu họng của bệnh nhân, đảm bảo đúng quy trình kỹ thuật mô bệnh học và còn nguyên vẹn (paraffin và bệnh phẩm không tách rời nhau). Các mẫu mô bị tổn hại, mô và paraffin tách rời, hoặc mô không lấy từ khu vực hầu họng bị loại khỏi nghiên cứu.

Phạm vi nghiên cứu: Thực hiện từ tháng 10 năm 2022 đến tháng 05 năm 2023, tại Trung tâm Nghiên cứu Gen–Protein, Trường Đại học Y Hà Nội.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và khái niệm

Nghiên cứu dựa trên các khái niệm và cơ sở sinh học phân tử sau:

• Gen 16S rRNA: Được sử dụng làm tiêu chuẩn phân loại và xác định vi khuẩn vì có mặt ở hầu hết các vi khuẩn, chứa đồng thời các vùng bảo tồn cao (dùng để thiết kế mồi đặc hiệu) và các vùng siêu biến đổi V1–V9 (dùng để nhận dạng từng loài). Kích thước gen 16S rRNA khoảng 1.550 bp. Bộ gen chủng N. gonorrhoeae NCCP11945 mã hóa 54 trình tự tRNA và bốn bản sao 16S–23S–5S rRNA operon, với hàm lượng G–C là 52%.
• Mô đúc nến (FFPE): Kỹ thuật vùi paraffin gồm 4 bước cơ bản — khử nước, khử cồn, khử xylen và đúc block. Mẫu FFPE có thể bảo quản hàng chục năm và phục vụ các thử nghiệm hồi cứu.
• PCR (Polymerase Chain Reaction): Kỹ thuật khuếch đại DNA đặc hiệu nhờ cặp mồi; độ nhạy và độ đặc hiệu của PCR với N. gonorrhoeae đạt khoảng 98%. Chu kỳ nhiệt gồm 3 giai đoạn (biến tính ở 94–95°C, gắn mồi, kéo dài ở 72°C), lặp lại 25–40 lần.
• Giải trình tự Sanger: Dựa trên nguyên lý "chain termination" sử dụng dideoxynucleotide (ddNTP) — các deoxynucleotide không có nhóm 3'-OH — để dừng ngẫu nhiên phản ứng tổng hợp, tạo ra các đoạn DNA có độ dài khác nhau. Phiên bản cải tiến sử dụng ddNTP đánh dấu huỳnh quang và máy điện di mao quản tự động (Genetic Analyzer 3500), có thể giải trình tự đoạn DNA dài khoảng 900–1.000 cặp base trong một phản ứng.

Phương pháp nghiên cứu

Thiết kế: Nghiên cứu thực nghiệm trên 17 mẫu mô đúc nến.

Quy trình kỹ thuật chính:

• Tách chiết DNA bằng Kit QIAamp DNA FFPE Tissue (QIAGEN, code 56404).
• Đo nồng độ và độ tinh sạch DNA bằng máy đo OD Nanodrop 2000c (Thermo).
• Khuếch đại vùng 16S rRNA bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu; điện di sản phẩm trên gel agarose 1,5%.
• Giải trình tự Sanger bằng bộ hoá chất BigDye Terminator v3.1, phân tích kết quả bằng phần mềm CLC Main Workbench, so sánh với ngân hàng gen chuẩn.

Nguồn dữ liệu: Dữ liệu thực nghiệm tự thu thập trong phòng thí nghiệm; số liệu xử lý bằng phần mềm Excel.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương này hệ thống hoá kiến thức nền về Neisseria gonorrhoeae và các kỹ thuật phân tích liên quan. Các luận điểm chính bao gồm:

• Đặc điểm vi khuẩn: N. gonorrhoeae là vi khuẩn Gram âm, hình song cầu hạt cà phê, không di động, không tạo bào tử. Màng ngoài chứa protein, phospholipid và lipooligosaccharide (LOS) — khác biệt với LPS ở chỗ không có tiểu đơn vị lặp lại (kháng nguyên O). Pili loại IV đóng vai trò bám dính và trao đổi vật liệu di truyền.
• Dịch tễ học: Tỷ lệ mắc toàn cầu năm 2016 là 0,9% ở phụ nữ và 0,7% ở nam giới, tương đương 30,6 triệu ca; năm 2020 tăng lên 82,4 triệu ca mới. Tỷ lệ mắc mới năm 2016 là 20/1.000 phụ nữ và 26/1.000 nam giới, tương đương 86,9 triệu ca mới. Tại Việt Nam, số ca mắc lậu cầu giai đoạn 2012–2016 dao động từ 3.619 đến 6.625 ca/năm.

Năm	2012	2013	2014	2015	2016
Số ca	6.625	3.619	4.743	5.188	5.018

• Cơ chế bệnh sinh: Vi khuẩn bám dính vào biểu mô nhờ pili loại IV, xâm nhập qua cơ chế thực bào, giải phóng LOS và peptidoglycan gây phản ứng viêm; LOS kích hoạt bổ thể và thu hút đại thực bào tạo thành mủ. Bơm FarA–FarB kiểm soát vận chuyển axit béo; bơm MtrC–MtrD–MtrE kiểm soát peptide kháng khuẩn.
• Sức đề kháng: Vi khuẩn dễ bị tiêu diệt ở 55°C sau 5 phút; trong điều kiện khô và giàu oxy chết sau 1–2 giờ; với phenol 1% chết sau 1–5 phút tiếp xúc.
• Kỹ thuật sinh học phân tử: Trình bày nguyên lý tạo mô đúc nến, tách chiết DNA từ FFPE, PCR và giải trình tự Sanger — bao gồm cả phiên bản cải tiến với ddNTP huỳnh quang và máy điện di mao quản tự động.

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương mô tả chi tiết thiết kế và quy trình thực nghiệm:

• Tiêu chuẩn chọn mẫu và loại trừ: Mô lấy từ khu vực hầu họng, đúc nến đúng quy trình, khối nến còn nguyên vẹn. Loại trừ mẫu bị tổn hại hoặc không đúng vị trí.
• Cặp mồi 16S rRNA được lựa chọn:

Mồi	Trình tự (5'→3')	Tm (°C)	GC (%)	Kích thước sản phẩm (bp)
Mồi xuôi	GCC TCG CGG CTT GGC TA	62,6	—	691
Mồi ngược	GGC GCA GAC GGT TAC TTA AGC AGG A	66,96	—	691

• Chu trình nhiệt PCR: Biến tính 95°C/5 phút; 40 chu kỳ (95°C/30s → 58°C/45s → 72°C/30s); kéo dài cuối 72°C/5 phút; bảo quản 4°C.
• Thành phần phản ứng PCR (tổng 10 µl): Master mix 2X (5 µl), Sense Primer 0,5 µl, Antisense Primer 0,5 µl, nước cất 2 lần 2 µl, DNA 2 µl.
• Thành phần phản ứng giải trình tự Sanger (tổng 10 µl): Nước cất 6 µl, Buffer BigDye 5X (2 µl), BigDye Terminator v3.1 (1 µl), mồi ngược (0,7 µl), sản phẩm PCR (0,3 µl).
• Chu trình nhiệt giải trình tự Sanger: 96°C/1 phút; 25 chu kỳ (96°C/10s → 50°C/5s → 60°C/4 phút); bảo quản 4°C.
• Sản phẩm sau giải trình tự được tinh sạch bằng EDTA 0,125M, EtOH 100% và EtOH 70%, sau đó phân tích trên máy ABI 3500 (Genetic Analyzer) bằng phần mềm CLC Main Workbench.

Chương 3: Kết quả nghiên cứu

Chương trình bày kết quả qua ba bước phân tích:

• Tách chiết DNA: 17 mẫu mô FFPE được tách chiết bằng Kit QIAamp DNA FFPE Tissue và đo bằng Nanodrop 2000c. Minh hoạ từ mẫu HyC 01 cho thấy nồng độ DNA đạt 240 ng/µl, tỷ số A260/280 = 1,99 (trong khoảng 1,8–2,0), tỷ số A260/230 đạt giá trị trong khoảng 2,0–2,2; đồ thị hấp thụ quang có đỉnh cực đại ở 260 nm, hình parabol không gãy khúc, đảm bảo chất lượng DNA.
• Điện di sản phẩm PCR: Kết quả điện di trên gel agarose 1,5% (120V, 30 phút, nhuộm Ethidium Bromide) xác định được 3 mẫu dương tính (xuất hiện vạch điện di tương ứng với kích thước 691 bp của chứng dương, sử dụng Maker 100 bp).
• Giải trình tự Sanger: Tiến hành giải trình tự ngẫu nhiên mẫu dương tính; kết quả thu được trình tự tương đồng với bộ gen của họ vi khuẩn Neisseria khi so sánh với bộ gen chuẩn trong ngân hàng gen.

Chương 4: Bàn luận

Chương phân tích sâu các kết quả và đặt trong bối cảnh khoa học:

• Ưu và nhược điểm của mô đúc nến: FFPE bảo quản tốt hình thái và cấu trúc, chi phí thấp, phù hợp nghiên cứu hồi cứu; tuy nhiên quá trình cố định formalin có thể làm phân mảnh và biến đổi hoá học DNA, ảnh hưởng đến chất lượng khuếch đại.
• Kết quả tách chiết DNA từ mô FFPE: Thảo luận về độ tinh sạch và nồng độ DNA thu được, liên hệ với tiêu chí đánh giá (tỷ số A260/280 trong khoảng 1,8–2,0; tỷ số A260/230 trong khoảng 2,0–2,2).
• Lựa chọn cặp mồi khuếch đại vùng 16S rRNA: Cặp mồi cho sản phẩm 691 bp, Tm xuôi 62,6°C và Tm ngược 66,96°C được lựa chọn dựa trên tính bảo tồn của vùng gen và khả năng phân biệt loài.
• Kết quả PCR phát hiện Neisseria gonorrhoeae: Trong 17 mẫu, 3 mẫu dương tính (chiếm tỷ lệ đáng ghi nhận trong điều kiện mẫu bệnh phẩm FFPE hầu họng).
• Kết quả giải trình tự Sanger: Trình tự thu được tương đồng với bộ gen Neisseria trong ngân hàng gen, xác nhận sự hiện diện của vi khuẩn chi này trong mẫu mô đúc nến.
• Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam và trên thế giới: Đặt kết quả nghiên cứu trong bối cảnh tình trạng kháng kháng sinh ngày càng gia tăng và mục tiêu của WHO giảm 90% tỷ lệ mắc bệnh lậu vào năm 2030.

---

Kết quả và đóng góp

Kết quả chính:

• Trong 17 mẫu mô đúc nến (FFPE) lấy từ vùng hầu họng, kỹ thuật PCR xác định được 3 mẫu dương tính (xuất hiện vạch khuếch đại đúng kích thước 691 bp tương ứng vùng 16S rRNA).
• Giải trình tự Sanger mẫu dương tính ngẫu nhiên thu được trình tự tương đồng với bộ gen họ vi khuẩn Neisseria khi so sánh với ngân hàng gen chuẩn, khẳng định sự hiện diện của vi khuẩn chi này trong mô đúc nến.
• DNA tách chiết từ mẫu minh hoạ HyC 01 đạt nồng độ 240 ng/µl, tỷ số A260/280 = 1,99, đảm bảo tiêu chí chất lượng cho PCR.

Giải pháp và đóng góp:

• Nghiên cứu chứng minh tính khả thi của quy trình tách chiết DNA từ mô FFPE kết hợp PCR và giải trình tự Sanger trong việc phát hiện và định danh vi khuẩn chi Neisseria từ mẫu bệnh phẩm bảo quản dài hạn.
• Đây là hướng tiếp cận có giá trị cho các nghiên cứu hồi cứu tại Việt Nam — nơi mẫu mô tươi bị hạn chế về thời gian bảo quản nhưng kho lưu trữ FFPE rất phong phú tại các bệnh viện và phòng xét nghiệm.
• Quy trình khuếch đại vùng 16S rRNA từ mô FFPE hầu họng được mô tả chi tiết, có thể tái sử dụng cho các nghiên cứu định danh vi khuẩn chi Neisseria trong tương lai.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Cỡ mẫu nhỏ: Nghiên cứu chỉ thực hiện trên 17 mẫu mô đúc nến; cần mở rộng cỡ mẫu để đánh giá tỷ lệ dương tính có ý nghĩa thống kê.
• Phạm vi vị trí giải phẫu hạn chế: Toàn bộ mẫu lấy từ vùng hầu họng; chưa khảo sát các vị trí nhiễm khuẩn khác của Neisseria gonorrhoeae như niệu đạo, cổ tử cung, trực tràng.
• Khả năng phân biệt loài trong chi Neisseria: Vùng siêu biến đổi 16S rRNA gặp khó khăn trong phân biệt các loài có quan hệ họ hàng gần (như N. gonorrhoeae và N. meningitidis); các nghiên cứu tiếp theo có thể sử dụng các gen đặc hiệu loài hơn hoặc giải trình tự thế hệ mới (NGS) để định danh chính xác hơn.
• Chưa khảo sát tình trạng kháng kháng sinh: Nghiên cứu tập trung vào phát hiện và định danh, chưa phân tích gen kháng kháng sinh — đây là hướng có ý nghĩa thực tiễn cao trong bối cảnh tỷ lệ kháng kháng sinh của N. gonorrhoeae đang gia tăng tại Việt Nam.

---

Giá trị tham khảo

Khóa luận có giá trị tham khảo trực tiếp cho các đối tượng sau:

• Sinh viên ngành Kỹ thuật Xét nghiệm Y học và Y sinh học phân tử: Phần Chương 1 cung cấp kiến thức nền tảng đầy đủ về Neisseria gonorrhoeae, nguyên lý mô đúc nến, PCR và giải trình tự Sanger; Chương 2 trình bày quy trình thực nghiệm chi tiết ở mức có thể áp dụng trực tiếp trong phòng thí nghiệm.
• Sinh viên y khoa và nghiên cứu sinh làm đề tài về bệnh lây truyền qua đường tình dục (STI): Phần tổng quan dịch tễ học và cơ chế bệnh sinh cung cấp số liệu cập nhật đến năm 2020.
• Nhà nghiên cứu làm việc với mẫu FFPE: Phần mô tả quy trình tách chiết DNA bằng Kit QIAamp DNA FFPE Tissue và tiêu chí kiểm tra chất lượng DNA (tỷ số A260/280, A260/230) là tài liệu kỹ thuật có giá trị thực hành.
• Những người thực hiện đề tài tương tự về định danh vi khuẩn từ mô vùi paraffin: Cách lựa chọn cặp mồi 16S rRNA, thiết kế chu trình nhiệt PCR và quy trình tinh sạch sản phẩm trước khi giải trình tự là các tham chiếu kỹ thuật cụ thể.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao nghiên cứu chọn vùng 16S rRNA để khuếch đại thay vì các gen đặc hiệu loài khác? Gen 16S rRNA chứa đồng thời các vùng bảo tồn cao — cho phép thiết kế mồi khuếch đại đặc hiệu trên nhiều loài vi khuẩn — và các vùng siêu biến đổi V1–V9 dài 30–100 bp cung cấp trình tự đặc trưng cho từng loài. Ngoài ra, gen này có mặt ở hầu hết các vi khuẩn và đã được chứng minh là tiêu chuẩn phân loại. Cặp mồi được lựa chọn cho sản phẩm 691 bp với Tm xuôi 62,6°C và Tm ngược 66,96°C.

2. Tại sao chỉ 3 trong 17 mẫu cho kết quả dương tính với PCR? Khóa luận giải thích rằng mẫu mô FFPE có hạn chế vốn có: quá trình cố định formalin có thể phân mảnh và biến đổi hoá học DNA, ảnh hưởng đến hiệu quả khuếch đại. Ngoài ra, tiêu chuẩn chọn mẫu chỉ dựa vào vị trí hầu họng — không phải tất cả bệnh nhân đều nhất thiết có nhiễm Neisseria tại vị trí này.

3. Phần mềm nào được dùng để phân tích kết quả giải trình tự Sanger? Kết quả từ máy giải trình tự tự động ABI 3500 (Genetic Analyzer 3500 — máy điện di mao quản) được phân tích bằng phần mềm CLC Main Workbench, sau đó so sánh với bộ gen chuẩn của các chủng Neisseria gonorrhoeae trong ngân hàng gen.

4. Tiêu chí nào được dùng để đánh giá chất lượng DNA tách chiết từ mô FFPE? Chất lượng DNA được đánh giá bằng hai chỉ số đo quang trên Nanodrop 2000c: tỷ số A260/280 nằm trong khoảng 1,8–2,0 (đánh giá độ tinh sạch, loại tạp protein) và tỷ số A260/230 trong khoảng 2,0–2,2 (loại tạp carbohydrate và dung môi hữu cơ). Mẫu HyC 01 đạt A260/280 = 1,99 và nồng độ 240 ng/µl là ví dụ điển hình đạt tiêu chí.

5. Điểm khác biệt của giải trình tự Sanger cải tiến so với phiên bản cổ điển trong nghiên cứu này là gì? Thay vì sử dụng ddNTP đánh dấu đồng vị phóng xạ và bốn phản ứng riêng biệt, phiên bản cải tiến dùng ddNTP đánh dấu huỳnh quang với bốn màu phát xạ khác nhau cho mỗi loại ddNTP, thực hiện trong một phản ứng duy nhất. Kết quả được ghi nhận tự động qua máy điện di mao quản ABI 3500 — camera ghi nhận cường độ đỉnh sáng khi vạch điện di đi qua chùm tia laser, máy phân tích thành trình tự DNA. Phương pháp này có thể giải trình tự đoạn DNA dài khoảng 900–1.000 cặp base.

---

Kết luận

Khóa luận của Nguyễn Thị Ngọc Ánh (Trường Đại học Y Hà Nội, 2023) trình bày một nghiên cứu thực nghiệm ứng dụng kỹ thuật PCR và giải trình tự Sanger để phát hiện và định danh vi khuẩn chi Neisseria từ mẫu mô đúc nến (FFPE) lấy tại vùng hầu họng. Trong 17 mẫu nghiên cứu, 3 mẫu dương tính bằng PCR khuếch đại vùng 16S rRNA; kết quả giải trình tự Sanger xác nhận trình tự tương đồng với bộ gen họ vi khuẩn Neisseria trong ngân hàng gen. Nghiên cứu khẳng định tính khả thi của việc sử dụng mẫu FFPE — nguồn bệnh phẩm bảo quản dài hạn phổ biến tại các cơ sở y tế Việt Nam — cho phân tích sinh học phân tử định danh vi khuẩn gây bệnh lây qua đường tình dục.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG I: TÔNG QUAN 1. Cấu trúc chung 5 Vi khuân Neisseria Gonorrhoea? là vi khuân Gram âm. có kích thước khoáng 0. là song cẩu hình hạt cà phe cô hai mật dẹt quay vào nhau.

Vi khuẩn Neisseria Gonorrhoea? không di động, không tạo nha bào. không có tiêm mao. một số chung có pili. ỉ'i khuân Neisseria gonorrhoea? (lậu cầu) Cẩu trúc màng: Vi khuấn Neisseria gonorrhoea? có cẩu trúc mãng ngoài của vi khuấn Gram âm điên hình bao gồm protein, phospholipid và lipopolysaccharide (LPS).Gonorrhoeae khác biệt so với LPS cua các vi khuân Gram khác bơi cấu trúc oligosaccharide cơ ban phân nhánh và sự văng mặt cùa tiêu dơn vị lộp lại (kháng nguyên O).

Chinh vi the.Gonorrhoeae dược gọi lã lipooligosacchaiide (LOS) .^H «4 ugc V Hl 5 Pili: cỏ ờ vi khuân N.Gononhoeae có dạng TI vã T2. Ban chắt là protein cỏ trọng lượng phân tư dao động từ 17. Giúp Neisseria gonorrhoeas bám vào te bảo. giúp cho sự trao dổi vật liệu di truyền giừa nhừng chung có pili.

Trong nghiên cứu về vật liệu di truyền cua vi khuân N. dáng quan tàm nhai là ba dạng plamis: + loại I: plasmid 24. cô kha nâng hoạt hỏa các plasmid khác. chưa rò chức nàng + loại 3: plasmid quy định sinh lactamase, dây lã plasmid quy định tính kháng kháng sinh cua N.Gonorrhoeas' chúng có trọng lượng phân tư thay đổi: 4.

cẩu trúc gcn Chủng N.Gonorrhocae NCCPI1945 Bộ gen cua chung N.Gonorrhoeas NCCP11945 bao gồm một nhiẻm sắc thế tròn có kích thước 2.025 bp vã một plasmid có kích thước 4153 bp. Mật độ mà hóa trên toàn bộ bộ gen là X7% với hâm lượng G - c là 52. Bộ gcn chung NCCP11945 mã hóa cho 54 trinh tự tRNA và bốn ban sao I6S- 23S-5S rRNA operon. Cùng như các loài Neisseria khác, bộ gen NCCP11945 chứa hãng trám yểu lổ lập đi lập lại.

trinh tự DNA (5’ GCCGTCTGAA 3') lặp lại nhiều nhất với 1966 ban sao trong bộ gen. Gen 16S ribosomal RNA vi khuẩn s ' ơ sinh vật nhân sơ RNA ribosome cua tiêu dơn vị 30S được gọi là 1RNA I6S. Do chức năng I6S rRNA rất cần thiết cho te bào vi khuân trong .^H «4 ugc V Hl 6 quá trinh dịch mà, nên hầu như tất ca cảc bộ gcn cúa vi khuân đều đưực cấu tạo tử gen I6S rRNA. Gen I6S rRNA này dã dược chứng minh có chửa cá những vùng gcn dược bao tồn cao (vùng gcn dược báo tồn nhất ờ tẩt ca các tề bào) cùng như những vũng sicu bicn dôi.

Sự hiện diện cua các vùng bao ton cao cho phép thict kế các cập mồi khuếch đại chinh xác cùa các loài vi khuân, chính vi vậy nó dược sử dụng nhiều cho các nghiên cứu phát sinh loài. Ngoài các vị tri lien kcl mỗi dược bao toàn cao. các trinh tự gen 16S rRNA còn chứa các vùng siêu biến dôi có the cung cấp những trinh lự đặc tnmg cho lừng loài, diều này rầt hừu ich dê nhận dạng các loại vi khuân. Mặc dù vùng siêu dôi cùa I6S là một công cụ mạnh mè cho các nghiên cứu phân loại vi khuân, nhưng lại gặp khó khản trong việc phân biệt giữa các loài có quan hộ họ hãng gàn gũi.

Vùng siêu biên đôi cùa gen I6S vi khuân chứa chin vùng siêu biên đôi (VI - V9). các vùng có chiều dài từ 30 100 bp. Kích thước cua gen I6S rRNA là khoang I55()bp. dù cho các mục đích sinh hục.

Theo các nghiên cứu dã cho thấy, gen I6S rRNA dược sư dụng làm tiêu chuân đê phân loại và xác định vi khuân, bời vi nó có mặt ở hầu hết các vi khuân và cho thầy sự thay đôi thích hợp tương ửng với từng loài. Sức đề kháng ■ Sức đề kháng cua vi khuân N.Gononhoeae rất kém.