Đánh Giá Mức Độ Sao Chép hMAM và Survivin mRNA Từ Tế Bào Ung Thư Vú

Luận án tiến sĩ phân tích mức độ sao chép mRNA survivin từ tế bào ung thư vú, cung cấp cái nhìn sâu sắc về cơ chế sinh học và tiềm năng điều trị.

• Tác giả: Nguyễn Minh Hiền
• Người hướng dẫn: TS. Phạm Thiện Ngọc
• Trường học: Trường Đại Học Y Hà Nội
• Chuyên ngành: Hóa sinh
• Đề tài: Đánh Giá Mức Độ Sao Chép hMAM mRNA, Survivin mRNA Từ Tế Bào Ung Thư Vú
• Loại tài liệu: Luận án Tiến sỹ Y học
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Khái niệm và tỷ lệ mắc bệnh ung thư vú
• 1.2. Tiến triển và các giai đoạn ung thư vú
• 1.3. Chẩn đoán ung thư vú
• 1.4. TBUTM và vai trò của survivin mRNA, hMAM mRNA trong phát hiện TBUTM
• 1.5. Đặc điểm TBUTM
• 1.6. Kỹ thuật phát hiện TBUTM trên thế giới
• 1.7. Phát hiện tế bào ung thư vú trong máu bằng nhân bản các mRNA của hMAM và survivin
• 1.8. Nghiên cứu phát hiện tế bào ung thư vú bằng kỹ thuật sinh học phân tử ở Việt Nam
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3. Thiết kế nghiên cứu và xử lý số liệu
• 2.4. Địa điểm, thiết bị nghiên cứu
• 2.5. Các bước tiến hành
• 2.6. Thời gian và kinh phí đề tài
• 2.7. Vấn đề đạo đức của đề tài
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Xây dựng quy trình phát hiện sao chép gen hMAM và survivin ở dòng tế bào ung thư vú nuôi cấy
• 3.2. Kết quả RT-PCR phát hiện hMAM mRNA và survivin mRNA ở dòng tế bào
• 3.3. Giải trình tự sản phẩm PCR gen hMAM, survivin đã khuếch đại
• 3.4. RT-PCR phát hiện sự sao chép hMAM mRNA và survivin mRNA trong mô và trong máu bệnh nhân ung thư vú
• 3.5. Đặc điểm nhóm bệnh nhân nghiên cứu
• 3.6. Realtime PCR đánh giá mức độ sao chép hMAM mRNA, survivin mRNA trong nhóm nghiên cứu
• 3.7. Xây dựng đường chuẩn xác định số bản sao từ dòng tế bào ung thư vú
• 3.8. Mức độ sao chép hMAM mRNA, survivin mRNA ở mô ung thư vú
• 3.9. So sánh mức độ sao chép hMAM mRNA và survivin mRNA trong máu và trong mô bệnh nhân ung thư vú
• 3.10. Diễn tiến sự sao chép hMAM mRNA, survivin mRNA theo giai đoạn bệnh
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
• 4.1. Xây dựng quy trình phát hiện sự sao chép gen hMAM và survivin ở dòng tế bào ung thư vú nuôi cấy
• 4.2. RT-PCR phát hiện sự sao chép hMAM mRNA và survivin mRNA trong mô và trong máu bệnh nhân ung thư vú
• 4.3. Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của nhóm ung thư vú nghiên cứu
• 4.4. RNA tổng số, tổng hợp cDNA, điện di sản phẩm RT-PCR
• 4.5. Tỷ lệ sao chép hMAM mRNA và survivin mRNA trong mô ung thư vú và mối liên quan với các chỉ số lâm sàng, cận lâm sàng trong bệnh ung thư vú
• 4.6. Tỷ lệ sao chép hMAM mRNA và survivin mRNA trong máu ung thư vú và mối liên quan với các chỉ số lâm sàng, cận lâm sàng trong bệnh ung thư vú
• 4.7. Realtime PCR đánh giá mức độ sao chép hMAM mRNA, survivin mRNA trong nhóm nghiên cứu
• 4.8. Xây dựng đường chuẩn xác định số bản sao từ dòng tế bào ung thư vú
• 4.9. Sao chép hMAM mRNA và survivin mRNA ở mô ung thư vú và mô u xơ vú
• 4.10. So sánh mức độ sao chép hMAM mRNA và survivin mRNA trong máu và trong mô bệnh nhân ung thư vú
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Đánh Giá Mức Độ Sao Chép hMAM và Survivin mRNA

Đánh giá mức độ sao chép hMAM và survivin mRNA từ tế bào ung thư vú là một lĩnh vực nghiên cứu quan trọng trong y học hiện đại. Các gen này được coi là biomarker tiềm năng trong việc phát hiện sớm và theo dõi tiến triển của bệnh ung thư vú. Nghiên cứu này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế bệnh lý mà còn mở ra hướng đi mới trong điều trị và chẩn đoán ung thư.

1.1. Khái Niệm Về hMAM và Survivin mRNA

hMAM (Human Mammaglobin) và survivin mRNA là hai loại gen có vai trò quan trọng trong sự phát triển và tiến triển của ung thư vú. hMAM được biết đến như một dấu ấn sinh học đặc hiệu cho ung thư vú, trong khi survivin mRNA liên quan đến sự sống sót của tế bào ung thư.

1.2. Tầm Quan Trọng Của Việc Đánh Giá Mức Độ Sao Chép

Việc đánh giá mức độ sao chép của hMAM và survivin mRNA giúp xác định sự hiện diện của tế bào ung thư trong máu và mô, từ đó hỗ trợ trong việc chẩn đoán sớm và theo dõi hiệu quả điều trị.

II. Vấn Đề Trong Nghiên Cứu Mức Độ Sao Chép hMAM và Survivin mRNA

Mặc dù có nhiều nghiên cứu về hMAM và survivin mRNA, nhưng vẫn tồn tại nhiều thách thức trong việc xác định chính xác mức độ sao chép của chúng. Các yếu tố như kỹ thuật phân tích, mẫu bệnh phẩm và điều kiện môi trường có thể ảnh hưởng đến kết quả nghiên cứu.

2.1. Thách Thức Trong Kỹ Thuật Phân Tích

Kỹ thuật RT-PCR và Realtime PCR là những phương pháp phổ biến để phát hiện hMAM và survivin mRNA. Tuy nhiên, độ nhạy và độ đặc hiệu của các phương pháp này có thể bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như chất lượng RNA và điều kiện phản ứng.

2.2. Ảnh Hưởng Của Mẫu Bệnh Phẩm

Mẫu bệnh phẩm từ mô và máu có thể cho kết quả khác nhau về mức độ sao chép của hMAM và survivin mRNA. Việc lựa chọn mẫu phù hợp là rất quan trọng để đảm bảo tính chính xác của nghiên cứu.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Mức Độ Sao Chép hMAM và Survivin mRNA

Nghiên cứu này sử dụng các phương pháp sinh học phân tử hiện đại để đánh giá mức độ sao chép của hMAM và survivin mRNA từ tế bào ung thư vú. Các bước tiến hành bao gồm thu thập mẫu, tách chiết RNA, và thực hiện RT-PCR.

3.1. Quy Trình Tách Chiết RNA

Quy trình tách chiết RNA từ tế bào ung thư vú được thực hiện bằng phương pháp phenol-chloroform, đảm bảo thu được RNA có độ tinh khiết cao và không bị phân hủy.

3.2. Kỹ Thuật RT PCR Để Phát Hiện mRNA

Kỹ thuật RT-PCR được sử dụng để khuếch đại hMAM và survivin mRNA. Các điều kiện phản ứng được tối ưu hóa để đạt được độ nhạy và độ đặc hiệu cao nhất.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Về Mức Độ Sao Chép hMAM và Survivin mRNA

Kết quả nghiên cứu cho thấy mức độ sao chép của hMAM và survivin mRNA có sự khác biệt rõ rệt giữa các mẫu mô và máu. Điều này cho thấy khả năng phát hiện tế bào ung thư từ máu có thể là một phương pháp hữu hiệu trong chẩn đoán sớm.

4.1. Mức Độ Sao Chép Trong Mô Ung Thư Vú

Kết quả cho thấy mức độ sao chép hMAM và survivin mRNA trong mô ung thư vú cao hơn nhiều so với các mẫu mô bình thường, cho thấy sự liên quan của chúng đến sự phát triển của khối u.

4.2. Mức Độ Sao Chép Trong Máu Bệnh Nhân

Mức độ sao chép hMAM và survivin mRNA trong máu bệnh nhân ung thư vú cũng cho thấy sự gia tăng đáng kể, mở ra khả năng sử dụng chúng như biomarker trong chẩn đoán.

V. Kết Luận Về Đánh Giá Mức Độ Sao Chép hMAM và Survivin mRNA

Nghiên cứu về mức độ sao chép hMAM và survivin mRNA từ tế bào ung thư vú đã chỉ ra rằng đây là những biomarker tiềm năng trong việc phát hiện sớm và theo dõi bệnh. Việc áp dụng các phương pháp sinh học phân tử hiện đại sẽ giúp nâng cao độ chính xác trong chẩn đoán.

5.1. Tương Lai Của Nghiên Cứu

Nghiên cứu trong tương lai cần tập trung vào việc cải thiện các phương pháp phát hiện và đánh giá mức độ sao chép của hMAM và survivin mRNA, nhằm nâng cao hiệu quả chẩn đoán và điều trị ung thư vú.

5.2. Ứng Dụng Thực Tiễn Trong Y Học

Kết quả nghiên cứu có thể được ứng dụng trong lâm sàng để phát hiện sớm ung thư vú, từ đó cải thiện tỷ lệ sống sót cho bệnh nhân.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Ung thư vú là bệnh lý ác tính có tỷ lệ mắc đứng đầu trong các loại ung thư ở nữ giới trên phạm vi toàn cầu cũng như tại Việt Nam. Theo số liệu của Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế (IARC), ung thư vú chiếm khoảng 23% tổng số các trường hợp ung thư ở phụ nữ trên thế giới, với khoảng 1,15 triệu ca mắc mới và 465.000 ca tử vong mỗi năm. Tại Việt Nam, tỷ lệ mắc ung thư vú chuẩn theo tuổi năm 2000 là 17,4/100.000 dân và tăng lên 29,9/100.000 dân vào năm 2010. Nguy cơ mắc bệnh có xu hướng tăng nhanh từ độ tuổi 35 và đạt đỉnh ở giai đoạn quanh mãn kinh (45–54 tuổi).

Tiên lượng của bệnh nhân ung thư vú phụ thuộc chặt chẽ vào giai đoạn phát hiện bệnh: tỷ lệ sống thêm sau 5 năm đạt 97,4% khi khối u còn khu trú tại chỗ, 77,4% khi tổn thương lan tràn tại vùng, nhưng giảm mạnh xuống còn 21,2% khi đã xuất hiện di căn xa. Trong tiến trình phát triển của khối u, các tế bào ung thư có khả năng xâm nhập vào hệ thống tuần hoàn ngay từ giai đoạn sớm, hình thành các tế bào ung thư lưu hành trong máu (TBUTM - Circulating Tumor Cells). Tuy nhiên, các kỹ thuật chẩn đoán hình ảnh và xét nghiệm dấu ấn sinh học protein kinh điển (như CEA, CA 15-3) thường có độ nhạy và độ đặc hiệu hạn chế trong việc phát hiện tình trạng vi di căn ẩn (Mx).

Khoảng trống nghiên cứu đặt ra là cần thiết lập các quy trình sinh học phân tử có độ nhạy cao để phát hiện và định lượng sự biểu hiện của các mRNA đặc hiệu khối u từ mô và từ tế bào ung thư lưu hành trong máu. Luận án tiến sĩ y học của nghiên cứu sinh Nguyễn Minh Hiền với đề tài "Đánh giá mức độ sao chép hMAM mRNA, survivin mRNA từ tế bào ung thư vú" (chuyên ngành Hóa sinh, mã số: 62720112) được thực hiện tại Trường Đại học Y Hà Nội nhằm giải quyết vấn đề này.

Luận án xác định 2 mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

1. Đánh giá mức độ sao chép hMAM mRNA, survivin mRNA từ mô ung thư vú.
2. Đánh giá mức độ sao chép hMAM mRNA, survivin mRNA từ tế bào ung thư vú lưu hành trong máu.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng: 43 bệnh nhân ung thư vú ở các giai đoạn lâm sàng (nhóm bệnh) và 21 bệnh nhân u xơ tuyến vú lành tính (nhóm chứng). Ngoài ra, nghiên cứu sử dụng các dòng tế bào ung thư vú chuẩn nuôi cấy bao gồm MCF7, BT474, KPL4 và MDA-MB-231.
• Địa điểm nghiên cứu: Bệnh phẩm thu thập tại Khoa Ngoại vú, xét nghiệm hóa sinh tại Khoa Hóa sinh Miễn dịch, giải phẫu bệnh tại Khoa Giải phẫu bệnh - Bệnh viện K; các kỹ thuật sinh học phân tử thực hiện tại Phòng Công nghệ Tế bào Động vật - Viện Công nghệ Sinh học và Bộ môn Hóa sinh - Trường Đại học Y Hà Nội.
• Thời gian công bố: Năm 2014.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Tổng quan tài liệu của luận án hệ thống hóa các hướng nghiên cứu trong nước và quốc tế về cơ chế bệnh sinh ung thư vú, đặc điểm TBUTM và các dấu ấn sinh học phân tử:

1. Các nghiên cứu quốc tế về TBUTM và dấu ấn mRNA:

   • Về kỹ thuật phát hiện TBUTM: Các công trình điểm qua nhiều phương pháp như hệ thống Fibre-Optic scanning (độ nhạy ~98%), hệ thống CellSearch dựa trên kháng thể EpCAM (tiêu chuẩn được FDA phê duyệt với ngưỡng cắt ≥ 5 tế bào/7,5 ml máu), thiết bị vi lưu CTC chip của Nagrath và cộng sự (cô lập TBUTM ở 115/116 bệnh nhân, đạt độ nhạy 99,1%), kỹ thuật AdnaTest kết hợp MUC1 và EpCAM, hệ thống Telomescan sử dụng vector Adenovirus vào đoạn telomere.
   • Về gen survivin (BIRC5, nằm trên nhiễm sắc thể 17q25, phân tử lượng 16,3 kDa): Span và cộng sự khảo sát trên 275 mẫu mô vú bằng kỹ thuật TaqMan RT-PCR cho thấy nồng độ survivin mRNA tỷ lệ thuận với mức độ nặng và nguy cơ tái phát. Nghiên cứu của Yamashita và cộng sự tại Nhật Bản trên 76 bệnh nhân ung thư vú nguyên phát chỉ ra nồng độ survivin mRNA tăng dần từ giai đoạn T1 đến T4 (p=0,0104) và cao hơn ở nhóm có di căn hạch (p=0,0001). Nghiên cứu của Yie, Luo và cộng sự tại Trung Quốc trên 67 bệnh nhân phát hiện survivin mRNA trong máu ngoại vi ở 50,7% trường hợp, với tỷ lệ tái phát sau 36 tháng là 81,8% ở nhóm dương tính so với 33,3% ở nhóm âm tính.
   • Về gen hMAM (Human Mammaglobin / SCGB2A2, nằm trên nhiễm sắc thể 11q12.2, phân tử lượng 10,5 kDa): Watson và Fleming (1996, 1998) phát hiện biểu hiện của hMAM có tính đặc hiệu cao cho mô tuyến vú. Lin Y.C. (2003) ghi nhận tỷ lệ biểu hiện hMAM mRNA tăng dần theo giai đoạn bệnh (giai đoạn 0: 12%, giai đoạn 1: 25%, giai đoạn 2: 32%, giai đoạn 3: 33,8%, di căn: 54%). Liu (2012) ghi nhận tỷ lệ biểu hiện hMAM mRNA trong tủy xương là 38,2%, liên quan có ý nghĩa với kích thước khối u (p=0,001) và giai đoạn lâm sàng (p=0,001).
   • Về phối hợp đa dấu ấn: Shen Changxing chứng minh độ nhạy đơn lẻ của hMAM mRNA và survivin mRNA trong huyết thanh là 36,2% và 33%, khi phối hợp thêm hTERT thì độ nhạy tăng lên 70%. Chen C.C. và cộng sự chỉ ra sự kết hợp các dấu ấn mRNA nâng độ nhạy lên 86% và độ đặc hiệu lên 88%. Chen Y. phối hợp CK19, hMAM và CEA giúp nâng cao hiệu quả phát hiện vi di căn sớm.

2. Các nghiên cứu sinh học phân tử ung thư vú tại Việt Nam:

   • Tạ Thành Văn và cộng sự đã công bố các nghiên cứu về mức độ sao chép của gen HIP (Heparansulfate Interacting Protein) trong mô ung thư vú và mô u xơ vú.
   • Phan Tôn Hoàng khảo sát sự biểu hiện của gen HIP theo các giai đoạn tiến triển và độ ác tính của khối u.
   • Đặng Thị Tuyết Minh và cộng sự (2008) ứng dụng kỹ thuật RT-PCR và PCR định lượng điện di mao quản để phân tích sự biểu hiện của HIP và EGFR trong mô ung thư vú.

Khoảng trống nghiên cứu: Các nghiên cứu trước đây tại Việt Nam chủ yếu tập trung phân tích sự biểu hiện gen trên mô bệnh phẩm đơn thuần. Luận án của NCS. Nguyễn Minh Hiền tập trung vào việc áp dụng đồng thời RT-PCR và Realtime PCR định lượng để đánh giá mức độ biểu hiện và số lượng bản sao của hai dấu ấn hMAM mRNA và survivin mRNA đồng thời trên cả mẫu mô khối u và mẫu máu ngoại vi (đại diện cho TBUTM), so sánh với nhóm chứng mô u xơ lành tính.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết

• Gen và protein Survivin: Thành viên thuộc họ protein ức chế chết theo chương trình (IAP - Inhibitor of Apoptosis), có vai trò ức chế hoạt hóa caspase-3 và caspase-7, điều hòa chu kỳ tế bào tại pha G2/M thông qua cấu trúc thoi vô sắc và tham gia kích thích tăng sinh mạch máu.
• Gen và protein hMAM (Human Mammaglobin): Thuộc họ secretoglobin (SCGB2A2), cấu trúc gồm 3 exon và 2 intron, mã hóa glycoprotein 93 acid amin. Gen này biểu hiện đặc hiệu cao ở tế bào biểu mô tuyến vú và tăng biểu hiện trong quá trình chuyển dạng ác tính.
• Nguyên lý TBUTM: Các tế bào khối u tách khỏi vị trí nguyên phát, xâm nhập tuần hoàn máu ngoại vi mang theo các phân tử mRNA đặc hiệu của khối u nguyên phát mà người bình thường không có.

Phương pháp nghiên cứu

• Thiết kế nghiên cứu: Tiến cứu kết hợp mô tả cắt ngang.
• Phương pháp chọn mẫu: Chọn mẫu thuận tiện, thu thập 43 bệnh nhân ung thư vú (đủ 4 giai đoạn theo phân loại TNM của AJCC 2004) và 21 bệnh nhân u xơ tuyến vú làm nhóm chứng.
• Tiêu chuẩn lựa chọn: Chẩn đoán xác định ung thư vú hoặc u xơ vú dựa trên lâm sàng, chẩn đoán hình ảnh và tiêu chuẩn vàng mô bệnh học tại Bệnh viện K.
• Tiêu chuẩn loại trừ: Bệnh nhân có khối u thứ hai ngoài vú, bệnh nhân đã qua điều trị (hóa chất, xạ trị, phẫu thuật) trước khi lấy mẫu, hoặc không đồng ý tham gia.

Quy trình kỹ thuật thực nghiệm

1. Xử lý mẫu bệnh phẩm:
   • Mẫu máu: 5 ml máu tĩnh mạch chống đông bằng EDTA lấy trước điều trị; ly tâm 4.000 vòng/phút trong 20 phút để tách lớp buffy coat (vòng trắng bạch cầu) nhằm làm giàu tế bào có nhân mang TBUTM; bảo quản ở 4°C trước khi tách chiết RNA.
   • Mẫu mô: 20–30 mg mô tươi lấy ngay sau phẫu thuật cắt bỏ khối u, bảo quản tại nhiệt độ -80°C.
2. Kỹ thuật sinh học phân tử:
   • Tách chiết RNA tổng số, kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ RNA qua đo quang phổ và điện di trên gel agarose 0,8%.
   • Tổng hợp cDNA bằng phản ứng phiên mã ngược (RT-PCR) với mồi ngẫu nhiên (random primer) và enzyme sao mã ngược MMLV-RT.
   • Phản ứng PCR khuếch đại gen hMAM, survivin và gen nội chuẩn GAPDH.
   • Giải trình tự chuỗi nucleotide sản phẩm PCR khuếch đại từ mô và máu bệnh nhân, phân tích qua phần mềm Chromas và so sánh đối chiếu với trình tự chuẩn trên GenBank.
   • Kỹ thuật Realtime PCR sử dụng chất phát huỳnh quang SYBR Green, xác định nhiệt độ nóng chảy (Tm), chu kỳ ngưỡng (Ct), xây dựng đường chuẩn trên các dòng tế bào ung thư vú BT474 (cho hMAM) và MCF7 (cho survivin) để xác định số lượng bản sao.

Gen mục tiêu	Trình tự mồi (Primer Sequence)	Nhiệt độ nóng chảy (Tm)	Kích thước sản phẩm
GAPDH	F: 5’-CGG AGT CAA CGG ATT TGG TCG TAT-3’ R: 5’-AGC CTT CTC CAT GGT GGT GAA GAC-3’	65,3°C 67,0°C	307 bp
hMAM	F: 5’-CTC CCA GCA CTG CTA CGC AGG CTC-3’ R: 5’-CAC CTC AAC ATT GCT CAG AGT TTC ATC CG-3’	67,2°C 66,3°C	202 bp
Survivin	F: 5’-AGA ACT GGC CCT TCT TGG AGG-3’ R: 5’-CTT TTT ATG TTC CTC TAT GGG GTC-3’	63,3°C 61,8°C	170 bp

• Xử lý số liệu: Nhập liệu bằng Microsoft Excel 2007, phân tích thống kê trên phần mềm SPSS 16.0. Sử dụng t-test, kiểm định Chi-bình phương ($\chi^2$), Fisher's exact test cho biến tỷ lệ với khoảng tin cậy 95%; sử dụng các kiểm định phi tham số Wilcoxon (cho mẫu ghép cặp) và Mann-Whitney (cho mẫu độc lập) khi số liệu không tuân theo phân phối chuẩn.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 tổng hợp toàn diện các cơ sở lý luận và y văn chuyên ngành về ung thư vú và kỹ thuật phát hiện tế bào ung thư:

• Trình bày định nghĩa, giải phẫu bệnh học, cơ chế bệnh sinh, tỷ lệ mắc chuẩn theo tuổi tại Việt Nam và trên thế giới.
• Hệ thống hóa tiến trình phát triển của bệnh từ giai đoạn tại chỗ (từ đơn vị tiểu thùy - ống tuyến tận cùng) đến giai đoạn lan tràn theo đường bạch huyết (hạch nách, hạch thượng đòn) và đường máu (di căn xương, phổi, gan, não).
• Chi tiết hóa hệ thống phân loại giai đoạn TNM theo tiêu chuẩn AJCC (2004) từ giai đoạn 0 đến giai đoạn IV (Bảng 1.1).
• Trình bày các phương pháp chẩn đoán lâm sàng và cận lâm sàng hiện hành: X-quang tuyến vú, siêu âm, PET/CT, PET/MRI, ghi hình miễn dịch phóng xạ (RIS), mô bệnh học và các dấu ấn hóa mô miễn dịch/hóa sinh (CEA, CA 15-3, thụ thể ER, PR, HER-2/neu, họ thụ thể EGFR từ ErbB-1 đến ErbB-4).
• Phân tích sâu về đặc tính sinh học của TBUTM, các kỹ thuật làm giàu và phát hiện tế bào ung thư di chuyển trong tuần hoàn (Fibre-Optic scanning, CellSearch, CTC chip, AdnaTest, Telomescan).
• Tổng quan cấu trúc phân tử, cơ chế sinh học phân tử, vai trò ức chế apoptosis và tăng sinh mạch của gen survivin (cùng các biến thể ghép nối như survivin 2A, survivin $\Delta Ex3$, survivin 2B, survivin 3B), cũng như cấu trúc và ý nghĩa đặc hiệu mô của gen hMAM (SCGB2A2).
• Điểm lại các công trình ứng dụng sinh học phân tử trong ung thư vú tại Việt Nam (các nghiên cứu về gen HIP, EGFR của Tạ Thành Văn, Phan Tôn Hoàng, Đặng Thị Tuyết Minh).

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết phương pháp luận thực nghiệm và thiết kế nghiên cứu:

• Trình bày tiêu chuẩn lựa chọn và loại trừ cho 43 bệnh nhân ung thư vú và 21 bệnh nhân nhóm chứng u xơ tuyến vú tại Bệnh viện K.
• Quy trình nuôi cấy, duy trì và rã đông các dòng tế bào ung thư vú chuẩn (MCF7, BT474, KPL4, MDA-MB-231) trong môi trường DMEM bổ sung 10% FBS, 1% P/S và 2 mM L-Glutamin.
• Chuẩn hóa quy trình thu thập mẫu: Ly tâm 5 ml máu toàn phần lấy lớp buffy coat để làm giàu TBUTM và bảo quản mẫu mô tươi phẫu thuật ở nhiệt độ -80°C.
• Quy trình tách chiết RNA tổng số, tinh sạch, điện di kiểm tra chất lượng RNA trên gel agarose 0,8%.
• Thiết kế các cặp mồi chuyên biệt cho GAPDH (307 bp), hMAM (202 bp) và survivin (170 bp).
• Quy trình tổng hợp cDNA (RT-PCR), thực hiện phản ứng PCR khuếch đại, điện di sản phẩm và giải trình tự gen.
• Xây dựng quy trình Realtime PCR với chất nhuộm SYBR Green, phân tích đường cong nóng chảy Tm, thiết lập đường chuẩn nồng độ bản sao trên dòng tế bào BT474 và MCF7.
• Quy định các thuật toán xử lý thống kê trên SPSS 16.0 (t-test, $\chi^2$, Fisher, Wilcoxon, Mann-Whitney) và đảm bảo các nguyên tắc đạo đức y sinh học trong nghiên cứu.

Chương 3: Kết quả nghiên cứu

Chương 3 trình bày các số liệu thực nghiệm thu được từ quá trình nghiên cứu:

• Chuẩn hóa kỹ thuật và giải trình tự gen:
  • Tối ưu hóa thành công phản ứng RT-PCR trên các dòng tế bào ung thư vú chuẩn, thu được các băng điện di đặc hiệu có kích thước chính xác: hMAM (202 bp), survivin (170 bp) và GAPDH (307 bp).
  • Kết quả giải trình tự nucleotide sản phẩm PCR gen hMAM từ mô bệnh nhân (mã số 4744-11) và gen survivin từ máu bệnh nhân (mã số 4312-11) hiển thị trên biểu đồ Chromas có độ tương đồng hoàn toàn với trình tự đã công bố trên Ngân hàng gen quốc tế (GenBank).
• Chất lượng RNA tổng số:
  • Nồng độ và độ tinh sạch của RNA tổng số tách chiết từ mô và tế bào máu đáp ứng tiêu chuẩn thực hiện phản ứng RT-PCR và Realtime PCR; so sánh nồng độ RNA tổng số giữa nhóm ung thư vú và u xơ vú.
• Tỷ lệ biểu hiện bằng kỹ thuật RT-PCR:
  • Xác định tỷ lệ phát hiện sao chép hMAM mRNA và survivin mRNA trong mô và trong máu của nhóm bệnh nhân ung thư vú so với nhóm chứng u xơ vú.
  • Phân tích mối liên quan giữa tỷ lệ sao chép hMAM mRNA và survivin mRNA trong mô và máu với các đặc điểm lâm sàng, mô bệnh học (kích thước khối u, giai đoạn bệnh, tình trạng di căn hạch, tình trạng thụ thể nội tiết).
• Định lượng bản sao bằng Realtime PCR:
  • Xây dựng thành công đường chuẩn xác định số lượng bản sao và ngưỡng phát hiện: Realtime PCR cho hMAM cDNA trên dòng tế bào BT474 và cho survivin cDNA trên dòng tế bào MCF7.
  • Phân tích phổ nhiệt độ nóng chảy (Tm) của sản phẩm nhân bản gen hMAM và survivin ở các nhóm mẫu (dòng tế bào, mô u xơ, mô ung thư, máu ung thư) nhằm khẳng định tính đặc hiệu của phản ứng.
  • Đánh giá mức độ sao chép (số lượng bản sao) của hMAM mRNA và survivin mRNA ở mô ung thư vú so với mô u xơ vú; so sánh mức độ sao chép giữa mô và máu của cùng bệnh nhân ung thư vú.
  • Phân tích diễn tiến biến thiên số lượng bản sao hMAM mRNA và survivin mRNA theo các giai đoạn tiến triển lâm sàng của bệnh ung thư vú (từ giai đoạn I đến giai đoạn IV).

Chương 4: Bàn luận

Chương 4 phân tích, lý giải và biện luận các kết quả nghiên cứu trên cơ sở đối chiếu với y văn:

• Bàn luận về tính khả thi và độ chính xác của quy trình chuẩn hóa phát hiện gen hMAM và survivin trên dòng tế bào ung thư vú nuôi cấy và mẫu bệnh phẩm lâm sàng.
• Phân tích chất lượng tách chiết RNA tổng số, hiệu quả tổng hợp cDNA và độ đặc hiệu của các sản phẩm khuếch đại điện di RT-PCR.
• Biện luận về tỷ lệ sao chép hMAM mRNA và survivin mRNA trong mô ung thư vú: Giải thích mối liên quan có ý nghĩa sinh học giữa mức độ biểu hiện gen với kích thước khối u, độ biệt hóa mô học, tình trạng di căn hạch vùng và giai đoạn bệnh theo hệ thống TNM.
• Biện luận về tỷ lệ sao chép hMAM mRNA và survivin mRNA trong máu ngoại vi bệnh nhân ung thư vú: Phân tích vai trò của TBUTM trong tuần hoàn, khẳng định sự xuất hiện của các phân tử mRNA này trong máu là dấu chỉ quan trọng phản ánh tình trạng vi di căn mạch máu (Mx) ngay cả khi chưa có biểu hiện di căn đại thể trên lâm sàng.
• Bàn luận về độ nhạy, độ đặc hiệu và giá trị của việc ứng dụng Realtime PCR định lượng số bản sao: So sánh mức độ sao chép giữa mô ung thư và mô u xơ lành tính, giữa mô nguyên phát và máu ngoại vi; đối chiếu kết quả của luận án với các nghiên cứu của Span, Yamashita, Yie, Luo, Lin Y.C., Liu, Shen Changxing trên thế giới.
• Đánh giá giá trị của việc kết hợp hai dấu ấn sinh học phân tử (hMAM và survivin) nhằm khắc phục tính không đồng nhất của tế bào khối u, nâng cao độ tin cậy trong chẩn đoán và tiên lượng bệnh ung thư vú.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Kết quả chính

• Đã xây dựng và chuẩn hóa thành công quy trình kỹ thuật RT-PCR và Realtime PCR sử dụng chất nhuộm huỳnh quang SYBR Green để phát hiện và định lượng mức độ sao chép của hMAM mRNA và survivin mRNA từ các dòng tế bào ung thư vú chuẩn (BT474, MCF7) cũng như trên mẫu mô và mẫu máu lâm sàng.
• Đã xác nhận tính đặc hiệu tuyệt đối của các đoạn gen khuếch đại thông qua giải trình tự nucleotide và so sánh độ tương đồng 100% với trình tự chuẩn trên GenBank.
• Xác định được sự khác biệt có ý nghĩa về tỷ lệ và mức độ sao chép số lượng bản sao hMAM mRNA và survivin mRNA giữa mô ung thư vú và mô u xơ vú lành tính.
• Chứng minh được sự xuất hiện của hMAM mRNA và survivin mRNA trong máu ngoại vi của bệnh nhân ung thư vú (đại diện cho TBUTM), trong khi không phát hiện thấy ở nhóm chứng lành tính; mức độ sao chép trong máu và mô có mối tương quan chặt chẽ với giai đoạn tiến triển của bệnh.

Đóng góp mới về mặt khoa học và thực tiễn

1. Đóng góp khoa học: Cung cấp các bằng chứng thực nghiệm sinh học phân tử tại Việt Nam về đặc điểm biểu hiện và mức độ sao chép của hai dấu ấn hMAM mRNA và survivin mRNA trên cả hai loại bệnh phẩm (mô u và tế bào ung thư lưu hành trong máu), làm sáng tỏ mối liên hệ giữa các dấu ấn này với tiến trình xâm lấn và di căn của bệnh ung thư vú.
2. Đóng góp thực tiễn: Thiết lập quy trình kỹ thuật Realtime PCR hoàn chỉnh, có tính khả thi cao, có thể áp dụng tại các phòng xét nghiệm sinh học phân tử y học để hỗ trợ chẩn đoán xác định, đánh giá giai đoạn, sàng lọc tình trạng vi di căn sớm qua máu ngoại vi (xâm lấn tối thiểu) và cung cấp cơ sở phục vụ theo dõi đáp ứng điều trị cho người bệnh.

Kiến nghị

• Mở rộng ứng dụng quy trình kỹ thuật Realtime PCR đa mồi phối hợp nhiều dấu ấn sinh học phân tử trong xét nghiệm thường quy tại các cơ sở chuyên khoa ung bướu.
• Tiến hành các nghiên cứu theo dõi dọc sau điều trị để đánh giá sâu hơn giá trị tiên lượng tái phát của việc tồn lưu hMAM mRNA và survivin mRNA trong máu ngoại vi sau phẫu thuật và hóa trị liệu.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

• Cỡ mẫu nghiên cứu còn ở mức độ vừa phải (43 bệnh nhân ung thư vú và 21 bệnh nhân nhóm chứng u xơ vú), được thu thập theo phương pháp chọn mẫu thuận tiện tại một trung tâm (Khoa Ngoại vú - Bệnh viện K).
• Thiết kế nghiên cứu mô tả cắt ngang kết hợp tiến cứu chưa bao gồm việc theo dõi dọc bệnh nhân qua nhiều năm để tính toán các chỉ số sống thêm toàn bộ (Overall Survival) và sống thêm không bệnh (Disease-Free Survival) tương quan với số lượng bản sao mRNA tại thời điểm ban đầu.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

• Mở rộng quy mô nghiên cứu trên cỡ mẫu lớn hơn tại nhiều trung tâm y tế chuyên khoa.
• Thiết kế nghiên cứu theo dõi dọc thuần tập (cohort) sau phẫu thuật, hóa trị, xạ trị nhằm đánh giá động học thay đổi số lượng bản sao hMAM mRNA và survivin mRNA trong máu ngoại vi theo thời gian, từ đó xác lập ngưỡng cắt (cut-off) chính xác dự báo nguy cơ tái phát và kháng thuốc.
• Nghiên cứu kết hợp thêm các dấu ấn phân tử khác (hTERT, CK19, HER2, MUC1) để xây dựng bộ kít đa dấu ấn (multiplex panel) tối ưu hóa độ nhạy phát hiện TBUTM.

---

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo chuyên sâu và có giá trị thực tiễn đối với:

• Bác sĩ lâm sàng chuyên ngành Ung bướu và Phẫu thuật tuyến vú: Cung cấp thêm cơ sở khoa học về hiện tượng vi di căn sớm qua máu (giai đoạn Mx) và giá trị bổ trợ của các dấu ấn sinh học phân tử bên cạnh các phương pháp chẩn đoán hình ảnh và giải phẫu bệnh truyền thống.
• Cán bộ xét nghiệm và nghiên cứu viên Hóa sinh Y học, Sinh học Phân tử: Tham khảo quy trình chi tiết về xử lý mẫu máu làm giàu tế bào có nhân, thiết kế mồi chuẩn hóa, điều kiện chạy phản ứng RT-PCR, giải trình tự và thiết lập đường chuẩn định lượng bản sao bằng Realtime PCR.
• Học viên sau đại học, nghiên cứu sinh: Cung cấp tài liệu tham khảo chuẩn mực về cấu trúc, phương pháp luận nghiên cứu thực nghiệm y học, các phương pháp phân tích thống kê y sinh học và tổng quan hệ thống tài liệu chuyên ngành.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Mục tiêu chính của luận án là gì?

Luận án nhằm đánh giá mức độ sao chép của hai dấu ấn sinh học hMAM mRNA và survivin mRNA từ mô khối u ung thư vú và từ tế bào ung thư vú lưu hành trong máu (TBUTM), đồng thời so sánh với mô u xơ tuyến vú lành tính và phân tích mối liên quan với các đặc điểm lâm sàng, mô bệnh học.

2. Kích thước sản phẩm khuếch đại PCR và nhiệt độ nóng chảy của các mồi trong nghiên cứu là bao nhiêu?

• Gen nội chuẩn GAPDH: Sản phẩm khuếch đại 307 bp; nhiệt độ nóng chảy của mồi xuôi là 65,3°C, mồi ngược là 67,0°C.
• Gen hMAM: Sản phẩm khuếch đại 202 bp; nhiệt độ nóng chảy của mồi xuôi là 67,2°C, mồi ngược là 66,3°C.
• Gen survivin: Sản phẩm khuếch đại 170 bp; nhiệt độ nóng chảy của mồi xuôi là 63,3°C, mồi ngược là 61,8°C.

3. Mẫu bệnh phẩm được thu thập và xử lý như thế nào để phát hiện tế bào ung thư trong máu và mô?

• Mẫu máu: 5 ml máu tĩnh mạch chống đông bằng EDTA lấy trước khi điều trị, được ly tâm 4.000 vòng/phút trong 20 phút để tách thu lấy lớp vòng trắng bạch cầu (buffy coat) nhằm làm giàu tế bào có nhân mang TBUTM, bảo quản ở 4°C và tiến hành tách chiết RNA tổng số.
• Mẫu mô: Lấy 20–30 mg mô tươi ngay sau khi phẫu thuật cắt u, bảo quản ở nhiệt độ -80°C cho đến khi tách chiết RNA.

4. Luận án đã sử dụng những dòng tế bào chuẩn nào để xây dựng quy trình và đường chuẩn?

Nghiên cứu sử dụng 4 dòng tế bào ung thư vú chuẩn nuôi cấy: MCF7, BT474, KPL4 và MDA-MB-231. Trong đó, dòng tế bào BT474 được sử dụng để xây dựng đường chuẩn định lượng bản sao hMAM cDNA và dòng tế bào MCF7 được sử dụng để xây dựng đường chuẩn định lượng bản sao survivin cDNA bằng kỹ thuật Realtime PCR.

5. Kết quả giải trình tự gen của luận án đã chứng minh điều gì?

Kết quả giải trình tự các sản phẩm PCR khuếch đại gen hMAM (từ mô bệnh nhân ung thư vú mã số 4744-11) và gen survivin (từ máu bệnh nhân ung thư vú mã số 4312-11) đối chiếu với phần mềm Chromas cho thấy trình tự nucleotide hoàn toàn trùng khớp với trình tự chuẩn đã được công bố trên Ngân hàng gen quốc tế (GenBank), khẳng định tính đặc hiệu tuyệt đối của phản ứng khuếch đại.

---

Kết luận

Luận án tiến sĩ y học của tác giả Nguyễn Minh Hiền đã hoàn thành đầy đủ hai mục tiêu nghiên cứu thông qua việc thiết lập và chuẩn hóa thành công quy trình RT-PCR và Realtime PCR định lượng hMAM mRNA và survivin mRNA. Nghiên cứu đã chứng minh sự biểu hiện đặc hiệu và mức độ sao chép vượt trội của hai gen này ở mô ung thư vú so với mô u xơ lành tính, đồng thời phát hiện thành công sự hiện diện của chúng trong máu ngoại vi của bệnh nhân ung thư vú. Mức độ sao chép mRNA của hMAM và survivin phản ánh mức độ tiến triển lâm sàng và tình trạng di căn hạch, khẳng định giá trị của việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử độ nhạy cao trong phát hiện tế bào ung thư lưu hành phục vụ chẩn đoán sớm và tiên lượng bệnh ung thư vú.

Trích đoạn nội dung tài liệu

mở đầu cho một đáp ứng sinh học ở tế bào đích. Có nhiều loại thụ thể khác nhau, mỗi loại thụ thể gắn với một phối tử đặc hiệu khởi đầu cho một đáp ứng tế bào riêng biệt. Các thụ thể có chức năng phù hợp đối với sự điều hòa hoạt động bình thường của tế bào. Sự sản xuất các thụ thể được điều hòa một phần bởi nồng độ của phối tử.

Có những thiếu hụt thụ thể do quá trình tổng hợp hoặc suy giảm chức năng của thụ thể do di truyền, hoặc do sự rối loạn tự miễn dịch (kháng thể trực tiếp chống lại thụ thể). Rất nhiều khối u ác tính gây những biến đổi về chức năng và số lượng thụ thể nên các thụ thể có thể được sử dụng như dấu ấn ung thư. Các dấu ấn có bản chất là thụ thể thường được sử dụng trong chẩn đoán và theo dõi điều trị là các thụ thể estrogen và progesteron, thụ thể của yếu tố sinh trưởng biểu mô… +Thụ thểestrogen và progesterone (ER và PR) Estrogen có vai trò quan trọng trong điều hòa sự tăng sinh và biệt hóa của biểu mô vú bình thường. Estrogen giúp phát triển hệ thống mô đệm tuyến vú, phát triển hệ thống các ống bài xuất nhỏ và làm tăng mô mỡ trong tuyến vú.

Progesteron thúc đẩy sự phát triển các tiểu thùy, kích thích các tế bào chế tiết tăng sinh. Để xác định những bệnh nhân bị ung thư vúchắc chắn có đáp ứng với điều trị nội tiết không, người ta phải xác định xem các tế bào ung thư đó có ER và PR dương tính không[12].ER và PR được nghiên cứu rộng rãi trên 10 năm qua. Người ta biết rằng 50-85% các khối u nguyên phát và 45-55% các u di căn có ER dương tính. Trên 60% bệnh nhânung thư vú có ER dương tính, đáp ứng tốt với điều trị nội tiết so với những bệnh nhân có ER âm tính là 8%.

Sự có mặt của PR làm tăng đáp ứng điều trị nội tiết lên LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Vai trò quan trọng nhất của việc đánh giá ER và PR là giúp lập kế hoạch điều trị[13]. + Thụ thểyếu tố phát triển biểu mô -Her-2/neu: là một tiền gen nằm trên nhiễm sắc thể 17, là một trong bốn thành viên của họ các yếu tố phát triển biểu mô, có vai trò như yếu tố phát triển biểu mô. Bằng nhuộm hóa mô miễn dịch, người ta xác định được sự bộc lộ gen này chiếm khoảng 1/3 số trường hợp ung thư biểu mô tuyến vú.

Khuếch đại gen Her-2/neu liên quan đến giảm tỷ lệ sống thêm không bệnh tật và tỷ lệ sống thêm chung, đặc biệt trong nhóm bệnh nhân hạch nách dương tính, mặc dù nó không phải là yếu tố tiên lượng độc lập[13]. EGFR: là thụ thể của các yếu tố sinh trưởng biểu môEFG và yếu tố biến đổi sinh trưởng tế bào α (transforming growth factor α- TGF-α). Họ thụ thể của các yếu tố sinh trưởng gồm các thụ thể: EGFR (ErbB-1), HER2/c-neu (ErbB-2), HER3/c-neu (ErbB-3), HER4/c-neu (ErbB-4). Sự vắng mặt của thụ thể này tỷ lệ thuận với một đáp ứng tốt với tamoxifen.

Nồng độ cao của thụ thể có liên quan đến sự tái phát khối u và sự sống sót của bệnh nhân ung thư.Thụ thể của yếu tố phát triển biểu mô là một glycoprotein về mặt cấu trúc giống như thụ thể của yếu tố phát triển chuyển dạng có mặt trên các tế bào biểu mô vú bình thường và các mô khác với một nồng độ thấp[14].1: Sơ đồ nhóm thụ thể của yếu tố tăng trưởng thượng bì (nguồn Ross.S, oncologist [15]) LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 13 Hóa sinh học và hóa mô miễn dịch đã góp phần không nhỏ trong chẩnđoán và theo dõi điều trị ung thư vú cùng với sự phát triển ngày càng hiện đại về kỹ thuật sinh học phân tử nhiều phương pháp phát hiện tế bào ung thư đã được thiết lập và ngày càng hoàn thiện giúp cho các nhà lâm sàng có thêm vũ khí phòng chống bệnh ung thư.Một trong những tiến bộ đó là phát hiện tế bào ung thư trong máu.Nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới đã cho thấy sự di căn ung thư là một quá trình nhiều bước gọi là quá trình di căn, trong đó sự xâm nhập của các tế bào ung thư vào mạch máu gọi là các TBUTM, đây là một giai đoạn hết sức quan trọng được coi là giai đoạn vi mô di căn ẩn – (Mx). TBUTM có thể được đưa đến rất nhiều cơ quan tuy nhiên quá trình di căn thực sự nhìn thấy được ở mức vĩ mô nhiều khi là ngẫu nhiên[16]. TBUTM và vai trò của Survivin mRNA,hMAM mRNA trong phát hiện TBUTM 1. Đặc điểm TBUTM  Đặc tính sinh học của các TBUTM: TBUTM được phát hiện trong máu của bệnh nhân ung thư được coi là dấu hiệu phát tán của bệnh.

Các tế bào này mang đặc tính của tế bào ung thư nguyên phát, mang một số gen đặc trưng khối u mà người bình thường không thấy biểu hiện [17]. Khi di chuyển trong máu các tế bào này tồn tại ở dạng không biệt hóa, nhưng nó sẽ phân chia khi đến một tổ chức thích hợp dưới sự hiện diện của các tác nhân đặc thù[18]. Theo quan niệm trước đây di căn ung thư vú xảy ra ở giai đoạn muộn khi có khối u nguyên phát rõ ràng, nhưng trong những năm gần đây các nhà khoa học đã sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử chứng minh được quá trình di căn ung thư xảy ra ở giai đoạn rất sớm ngay từ khi mới hình thành khối u[19]. Trong những con đường di căn của khối u thì di căn theo đường máu chiếm 80%, các tế bào khối u trong máu gọi tế bào ung thư di chuyển (Circulating Tumor Cell), vì các tế bào này xuất hiện sớm nên có thể coi là dấu ấn chẩn đoán ung thư ngay từ giai đoạn rất sớm.

Sự xuất hiện và di chuyển của các khối u vào máu ngoại vi bao gồm nhiều giai đoạn. Ban đầu các tế bào ung thư phát triển nhanh, cần nhiều oxy nên phát triển LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 14 xâm lấn. Các tế bào này có mật độ thụ thể trên bề mặt thấp dẫn tới sự giảm liên kết với nhau và chống lại quá trình chết theo chương trình. Kết quả là các tế bào này có khả năng sống sót cao hơn và dễ dàng xâm nhập vào máu.

Sau khi vào máu, các TBUTM không còn khả năng biệt hóa và di chuyển tới các cơ quan khác. Trên mô hình nghiên cứu ung thư ở động vật, hiện tượng di căn chỉ xảy ra khi phát hiện 1/10.000 tế bào bạch cầu[20].  Vai trò TBUTM trong chẩn đoán và điều trị Những nghiên cứu gần đây đã đưa ra những kết luận quan trọng về vai trò của TBUTM trong chẩn đoán lâm sàng: (i) TBUTM là các tế bào liên quan đến quá trình di căn và phát triển của bệnh. Nó là yếu tố hữu ích dự đoán khả năng di căn đến cơ quan khác đặc biệt là gan và phổi.

Việc phát hiện sớm ở giai đoạn đầu sẽ làm giảm tỷ lệ tử vong bằng cách áp dụng phương pháp điều trị thích hợp trước khi có biểu hiện di căn thực sự trên lâm sàng. Phát hiện TBUTM từ các bệnh nhân có thể giúp cho phân tích đặc tính phân tử của các tế bào, thiết lập một xét nghiệm xâm lấn tối thiểu cho dự đoán của di căn và tối ưu hóa hơn nữa cho điều trị[21]. (ii) TBUTM có thể theo dõi điều trị vì khi nó có thể sống sót sau hóa trị liệu thì đó là bằng chứng chỉ ra sự thất bại của các can thiệp điều trị. Hơn nữa phát hiện TBUTM trong máu sau phẫu thuật cắt bỏ khối u nguyên phát và theo dõi sự xuất hiện của nó trong quá trình theo dõi sau điều trị sẽ phát hiện sớm quá trình tái phát, nó có tính đặc hiệu cao nên được coi là yếu tố chiến lược hơn so với các dấu ấn ung thư huyết thanh cổ điển.

(iii) Kết quả phân tích TBUTM giúp ích cho việc lựa chọn phương thức điều trị thích hợp, khi phát hiện TBUTM trong thời kỳ đầu có thể phải tiến hành điều trị toàn thân thay cho hoặc kèm với điều trị tại chỗ. Vì ý nghĩa quan trọng như vậy nên kỹ thuật phát hiện TBUTMđược coi là xét nghiệm thường xuyên trong suốt quá trình điều trị và sau điều trị[16].Kỹ thuật phát hiện TBUTM trên thế giới TBUTM tồn tại rất thấp trong máu và rất khó phân biệt được với các tế bào bạch cầu bình thường nên để tăng độ nhạy xét nghiệm TBUTM thì trước tiên phải “làm giàu” tế bào và hạn chế tối đa sự mất TBUTM trong quá trình LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 15 làm kỹ thuật[22]. Làm giàu tế bào dựa vào:tính chất vật lý (kích thước, biến dạng, mật độ, và điện tích), đặc điểm sinh học (biểu hiện protein bề mặt và khả năngxâm nhập). Có nhiều cách để làm giàu tế bào dựa vào tỷ trọng, kích thước đặc điểm của từng loại tế bào.

Người ta có thể “làm giàu” tế bào trước rồi tiến hành kỹ thuật phát hiện hoặc lồng ghép vừa “làm giàu” đồngthời với phát hiện trong cùng một quá trình.2: Sơ đồ “làm giàu” TBUTM (nguồn Noha Gerge 2010[16]) Có 2 cách phát hiện sự có mặt của TBUTM: + Trực tiếp: Không có sự phá hủy màng tế bào, đảm bảo tính toàn vẹn tế bào, cần thiết bị chụp đặc biệt.3: Hình ảnh tế bào ung thư di chuyển phát hiện dưới kính hiển vi điện tử (nguồn MARIJA BALIC, National Medical Journal of India 2005[23]). + Gián tiếp: Phát hiện gen, thụ thể…, protein có trong tế bào ung thư vú mà có thể phân biệt được với tế bào bình thường. LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 16 Một số phương pháp phát hiện TBUTM 1.Fibre-Optic scanning technology:Đây là một hệ thống tự động hiển vi kỹ thuật số siêu tốc độ và áp dụng kỹ thuật quét laser phát hiện tế bào hiếm gặp. Quang học in laser được sử dụng để có thể phát hiện tới hơn 300.000 tế bào mỗi giây.

Hệ thống này giúp phát hiện các tế bào đánh dấu miễn dịch huỳnh quang nhanh hơn 500 lần so với kỹ thuật kính hiển vi tự động thông thường. Điều này tăng độ nhạy đạt được ~ 98% trong việc phát hiện TBUTM sau khi tách khỏi máu toàn phần[24].4: Tế bào ung thư vúlưu hành trong máu quét lase (nguồnScripps Research Institung) 1.CellSearch Sự phát triển của một hệ thống làm giàu và nhuộm miễn dịch từ tính tự động cho TBUTM (CellSearch ™).