Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Cây ớt (Capsicum spp.) là cây gia vị có giá trị kinh tế và dinh dưỡng cao, chứa hàm lượng dồi dào các loại vitamin A, C, E cùng nhiều khoáng chất thiết yếu (Ca, Fe, P, Mg). Tại Việt Nam, ớt được canh tác tập trung tại nhiều vùng chuyên canh trọng điểm như Hải Dương, Vĩnh Phúc, Lâm Đồng, các tỉnh miền Trung, khu vực ngoại thành TP. Hồ Chí Minh (Hóc Môn, Bình Chánh) và đặc biệt là 6 tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long (Đồng Tháp, An Giang, Tiền Giang, Sóc Trăng, Vĩnh Long, Trà Vinh) với tổng diện tích đạt 7.079 ha và sản lượng xấp xỉ 97.000 tấn.

Tuy nhiên, năng suất và chất lượng thương phẩm của ớt chịu thiệt hại nặng nề bởi bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. gây ra. Vết bệnh gây hoại tử, lõm sâu trên quả, làm thối rụng và có thể làm giảm từ 70% đến 80% sản lượng thu hoạch. Việc lạm dụng các loại thuốc bảo vệ thực vật hóa học trong thời gian dài đã dẫn đến hiện tượng kháng thuốc, ô nhiễm môi trường, phá vỡ cân bằng sinh thái đồng ruộng và tồn dư chất độc hại trong nông sản, cản trở tiêu chuẩn xuất khẩu sang các thị trường quốc tế khắt khe. Trước yêu cầu phát triển nông nghiệp hữu cơ và an toàn sinh học, việc nghiên cứu các dòng vi sinh vật đối kháng như Bacillus sp. và Pseudomonas sp. có ý nghĩa thực tiễn quan trọng.

Đề tài "Đánh giá khả năng phòng trừ bệnh thán thư trên ớt (Colletotrichum scovillei) của Bacillus sp. trong điều kiện nhà lưới" được thực hiện nhằm giải quyết các mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể:

  1. Đánh giá khả năng phòng và trừ nấm Colletotrichum scovillei gây bệnh thán thư trên cây ớt ở giai đoạn phân cành của các dòng vi khuẩn đối kháng đơn lẻ và phối hợp.
  2. Đánh giá khả năng phòng và trừ nấm Colletotrichum scovillei gây bệnh thán thư trên cây ớt ở giai đoạn ra hoa (đạt 70 - 75% hoa).
  3. Đánh giá ảnh hưởng của các dòng vi khuẩn đối kháng đến các chỉ tiêu sinh trưởng của cây ớt (chiều cao cây và đường kính tán).

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Giống ớt chỉ thiên F1 TN 242 (Công ty Giống cây trồng Trang Nông), nguồn nấm gây bệnh Colletotrichum scovillei chủng LD06, các chủng vi khuẩn đối kháng gồm Bacillus sp. chủng CC-LD 2.4, Pseudomonas sp. chủng O-BT 1.2, Pseudomonas sp. chủng CC-FN 1.1 cùng các chế phẩm đối chứng Ridomil Gold 68WG và BioBac 50WP (Bacillus subtilis 50%).
  • Phạm vi không gian và thời gian: Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm và khu nhà lưới thuộc Bộ môn Bảo vệ Thực vật, Khoa Nông học, Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, từ tháng 5/2023 đến tháng 11/2023.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và tài liệu đối sánh

  • Cơ chế xâm nhiễm của nấm Colletotrichum spp. theo hai phương thức bán ký sinh (hemibiotrophy) và hoại ký sinh (necrotrophy) với cấu trúc đĩa áp (appressorium), sợi nấm sơ cấp, thứ cấp và vòi xâm nhiễm.
  • Cơ chế đối kháng sinh học của Bacillus sp. và Pseudomonas sp.: cạnh tranh dinh dưỡng và không gian sống, tiết enzyme ngoại bào phân giải vách tế bào nấm (chitinase, glucanase, cellulase, protease), tổng hợp hợp chất kháng sinh (như 2,4-diacetylphloroglucinol - 2,4-DAPG), chất thải sắt (siderophore) và kích thích tính kháng tự nhiên cùng phytohormone tăng trưởng thực vật.

Phương pháp bố trí thí nghiệm và xử lý sinh học

  • Thiết kế thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu tố (CRD) gồm 14 nghiệm thức (NT), mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần (LLL), mỗi lần lặp lại gồm 10 chậu (1 cây/chậu).
  • Chuẩn bị nguồn vi sinh vật:
    • Vi khuẩn đối kháng được nuôi cấy tăng sinh trên môi trường Luria Broth (LB) lỏng, lắc ngang 220 vòng/phút trong 24 giờ, hiệu chỉnh mật số đạt $10^7\text{ CFU/mL}$.
    • Nấm Colletotrichum scovillei chủng LD06 nuôi cấy trên môi trường PDA trong 14 ngày, thu bào tử bằng nước cất khử trùng, đếm bằng buồng đếm hồng cầu và hiệu chỉnh mật độ đạt $10^5\text{ bào tử/mL}$.
  • Phương thức xử lý:
    • Thí nghiệm phòng bệnh: Phun 20 mL dịch huyền phù vi khuẩn ($10^7\text{ CFU/mL}$) kết hợp 4 mL chất bám dính trước khi lây nhiễm nấm 3 ngày. Sau đó phun 20 mL huyền phù nấm bệnh ($10^5\text{ bào tử/mL}$) và giữ ẩm.
    • Thí nghiệm trừ bệnh: Phun huyền phù nấm bệnh trước để nấm xâm nhiễm, 3 ngày sau tiến hành phun dịch vi khuẩn đối kháng hoặc chế phẩm đối chứng.
    • Hai quy trình trên được tiến hành độc lập tại 2 giai đoạn sinh trưởng của cây ớt: giai đoạn phân cành và giai đoạn ra hoa (70 - 75% hoa nở).

Chỉ tiêu theo dõi và phương pháp tính toán

Các chỉ tiêu bệnh học được thu thập tại các thời điểm 7, 14 và 21 ngày sau xử lý (NSXL) trên 6 chậu ngẫu nhiên/ô cơ sở:

  • Tỉ lệ bệnh ($TLB$): Xác định theo tỷ lệ số lá bị bệnh trên tổng số lá điều tra theo QCVN 01-160:2014/BNNPTNT.
  • Chỉ số bệnh ($CSB$): Phân cấp bệnh theo 5 thang điểm (1, 3, 5, 7, 9) tương ứng với tỷ lệ diện tích vết bệnh hại lá: $$\text{Chỉ số bệnh } (%) = \frac{9n_9 + 7n_7 + 5n_5 + 3n_3 + 1n_1}{9N} \times 100$$
  • Hiệu lực phòng trừ ($HLPT$): Tính toán theo công thức Abbott: $$\text{HLPT } (%) = \frac{C - T}{C} \times 100$$ (trong đó $C$ là chỉ số bệnh ở đối chứng dương chỉ nhiễm nấm; $T$ là chỉ số bệnh ở nghiệm thức xử lý).
  • Diện tích dưới đường cong tiến triển bệnh (AUDPC): $$\text{AUDPC} = \sum_{i=1}^{n-1} \left( \frac{y_i + y_{i+1}}{2} \right) (t_{i+1} - t_i)$$
  • Chỉ tiêu sinh trưởng: Đo chiều cao cây (cm) từ mặt đất đến đỉnh ngọn và đường kính tán (cm) tại thời điểm 21 NSXL theo quy chuẩn QCVN 01-64:2011/BNNPTNT.
  • Xử lý số liệu: Nhập liệu bằng Microsoft Excel 2010; phân tích phương sai (ANOVA) và kiểm định phân hạng Duncan/Tukey bằng phần mềm SAS 9.1 (số liệu tỷ lệ được chuyển đổi sang dạng $\text{Arcsin}\sqrt{%}$ trước khi phân tích).

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này hệ thống hóa các đặc điểm nông học và bệnh học thực vật:

  • Cây ớt: Nguồn gốc phân loại thuộc chi Capsicum, họ Cà (Solanaceae); phân tích hình thái rễ chùm ăn nông, thân bụi hóa gỗ, cấu trúc hoa lưỡng tính, quả mọng và hạt dẹp; giá trị dinh dưỡng với 143,7 mg vitamin C và 952 IU vitamin A trên 100 g quả chín đỏ; bức tranh sản xuất với số liệu FAOSTAT giai đoạn 2010 - 2018 (sản lượng toàn cầu đạt 36,77 triệu tấn năm 2018).
  • Nấm Colletotrichum spp.: Lịch sử định danh, vị trí thứ 8 trong nhóm nấm gây bệnh thực vật nguy hiểm nhất toàn cầu (Dean et al., 2012); đặc điểm sợi nấm nội sinh, cụm cuống đĩa cành vô tính và lông cứng; triệu chứng đốm vòng đồng tâm màu gạch non/nâu đen trên lá và quả; vòng đời lây lan qua nước tưới, tàn dư cây trồng và phạm vi ký chủ trên 70 loài cây trồng.
  • Tác nhân đối kháng sinh học: Tổng kết cơ chế tiết kháng sinh, siderophore của Pseudomonas sp. (đặc biệt là nhóm huỳnh quang sinh 2,4-DAPG) và tiềm năng ức chế nấm gây bệnh; khả năng hình thành nội bào tử bền vững, tiết enzyme ngoại bào (chitinase, $\beta$-1,3-glucanase) của Bacillus subtilis, B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, chứng minh triển vọng ứng dụng phòng trị nấm Colletotrichum scovillei.

Chương 2: Nội dung và phương pháp nghiên cứu

Trình bày chi tiết hệ thống trang thiết bị, hóa chất (nồi hấp ALP MC40L, tủ cấy vô trùng Esco IIAC2-4E8, kính hiển vi Olympus CX23, máy lắc Stuart SSL1, máy đo Nanovue Plus), thành phần môi trường nuôi cấy (LB, LB lỏng, PGA/PDA), nguồn gốc giống ớt TN 242 và nguồn vi sinh vật. Mô tả chi tiết sơ đồ bố trí 14 nghiệm thức cho từng giai đoạn sinh trưởng của cây ớt (phân cành và ra hoa) trong điều kiện nhà lưới, công thức toán học đo lường mức độ gây hại của bệnh và quy trình thống kê sinh học bằng SAS.

Chương 3: Kết quả và thảo luận

1. Thí nghiệm giai đoạn phân cành

  • Khả năng phòng bệnh: Ở 21 NSXL, đối chứng dương nhiễm nấm có tỷ lệ bệnh lên tới 71,51% và chỉ số bệnh 36,17%. Việc xử lý đơn lẻ hay kết hợp các dòng vi khuẩn đều làm giảm tỷ lệ bệnh rõ rệt (dao động từ 21,34% đến 36,36%). Nghiệm thức kết hợp 3 chủng vi khuẩn (Nấm bệnh + O-BT 1.2 + CC-LD 2.4 + CC-FN 1.1) đạt hiệu quả cao nhất với tỷ lệ bệnh 21,34%, chỉ số bệnh 9,49%, chỉ số AUDPC thấp nhất (23,77) và hiệu lực phòng trừ ở 7 NSXL đạt 87,31% (ở 21 NSXL đạt 46,78%), tương đương với thuốc hóa học Ridomil Gold 68WG (52,56%) và thuốc sinh học BioBac 50WP (48,10%).
  • Khả năng trừ bệnh: Khi phun vi khuẩn sau khi nấm đã xâm nhiễm 3 ngày, nghiệm thức kết hợp 3 dòng vi khuẩn tiếp tục thể hiện hiệu lực trừ bệnh cao nhất ở 7 NSXL đạt 85,73%, 14 NSXL đạt 70,89% và 21 NSXL đạt 41,58% (so với Ridomil Gold là 44,37% và BioBac là 41,74%), chỉ số bệnh tại 21 NSXL là 12,11% so với 36,17% của đối chứng dương.
Nghiệm thức tiêu biểu (Giai đoạn phân cành) TLB (%) 21 NSXL CSB (%) 21 NSXL AUDPC CSB HLPT (%) 7 NSXL HLPT (%) 21 NSXL
Phòng bệnh: Nấm + 3 khuẩn kết hợp 21,34 9,49 23,77 87,31 46,78
Phòng bệnh: Nấm + Ridomil Gold 68WG 17,17 9,00 20,65 98,58 52,56
Phòng bệnh: Nấm + BioBac 50WP 20,31 9,60 21,67 95,03 48,10
Phòng bệnh: Đối chứng dương (Chỉ nấm) 71,51 36,17 66,69 0,00 0,00
Trừ bệnh: Nấm + 3 khuẩn kết hợp 18,06 12,11 33,49 85,73 41,58
Trừ bệnh: Nấm + Ridomil Gold 68WG 10,27 12,13 29,48 93,13 44,37
Trừ bệnh: Nấm + BioBac 50WP 10,83 11,79 30,73 87,27 41,74
Trừ bệnh: Đối chứng dương (Chỉ nấm) 74,72 36,17 71,45 0,00 0,00

2. Thí nghiệm giai đoạn ra hoa

  • Khả năng phòng bệnh: Ở giai đoạn cây ra hoa 70 - 75%, nghiệm thức kết hợp 3 dòng vi khuẩn cho hiệu lực phòng trừ đạt đỉnh ở 7 NSXL với 88,87%, duy trì 65,65% ở 14 NSXL và đạt 50,18% ở 21 NSXL (khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với thuốc hóa học 52,54% và thuốc sinh học 50,43%). Chỉ số AUDPC của nghiệm thức 3 khuẩn là 27,76.
  • Khả năng trừ bệnh: Xử lý kết hợp 3 chủng vi khuẩn tiếp tục duy trì ưu thế vượt trội so với các nghiệm thức xử lý 1 dòng đơn lẻ hay phối hợp 2 dòng.
  • Độc tính sinh học: Các nghiệm thức đối chứng chỉ xử lý vi khuẩn đối kháng đơn lẻ (NT12, NT13, NT14) đều ghi nhận tỷ lệ bệnh bằng 0% tại mọi thời điểm, chứng minh các chủng vi khuẩn thử nghiệm hoàn toàn an toàn và không gây độc cho cây ớt.

3. Ảnh hưởng đến sinh trưởng của cây ớt

Các dòng vi khuẩn đối kháng kích thích rõ rệt sự tăng trưởng về tầm vóc cây. Tại thời điểm 21 NSXL:

  • Chủng Pseudomonas sp. CC-FN 1.1 kích thích sinh trưởng mạnh nhất: chiều cao cây đạt gấp 1,32 lần và đường kính tán đạt gấp 1,24 lần so với nghiệm thức đối chứng âm chỉ tưới nước cất.
  • Việc kết hợp các chủng vi khuẩn vừa nâng cao hiệu lực kiểm soát nấm bệnh vừa duy trì khả năng phát triển sinh khối thân lá tốt cho cây trồng.

Kết quả và đóng góp

Kết quả chính kèm số liệu thực chứng

  1. Hiệu lực đối kháng: Xác lập hiệu lực kiểm soát bệnh thán thư do Colletotrichum scovillei của các chủng vi khuẩn đối kháng Bacillus sp. CC-LD 2.4 và Pseudomonas sp. (O-BT 1.2, CC-FN 1.1). Hiệu quả phòng trừ cao nhất luôn đạt được khi phối hợp đồng thời cả 3 chủng vi khuẩn, đạt HLPT cực đại 88,87% (phòng bệnh giai đoạn ra hoa ở 7 NSXL) và 85,73% (trừ bệnh giai đoạn phân cành ở 7 NSXL).
  2. Giá trị bảo vệ tương đương đối chứng chuẩn: Ở thời điểm 21 NSXL, nghiệm thức phối hợp 3 dòng vi khuẩn có hiệu lực phòng bệnh (46,78% - 50,18%) và trừ bệnh (41,58%) tương đương về mặt thống kê ($p < 0,01$) với thuốc hóa học Ridomil Gold 68WG (44,37% - 52,56%) và thuốc sinh học thương phẩm BioBac 50WP (41,74% - 50,43%).
  3. Kích thích sinh trưởng: Các dòng vi sinh vật không gây bệnh cho cây ký chủ (tỷ lệ bệnh 0%), đồng thời chủng CC-FN 1.1 giúp tăng chiều cao cây gấp 1,32 lần và đường kính tán gấp 1,24 lần so với đối chứng nước cất.

Giải pháp và kiến nghị của tác giả

  • Ứng dụng phối hợp phức hợp 3 dòng vi khuẩn (Bacillus sp. CC-LD 2.4, Pseudomonas sp. O-BT 1.2 và Pseudomonas sp. CC-FN 1.1) trong phòng trừ sinh học bệnh thán thư thay vì chỉ sử dụng đơn dòng đơn lẻ.
  • Tiến hành phun phòng dịch vi khuẩn ở mật số $10^7\text{ CFU/mL}$ trước các thời điểm cây mẫn cảm với bệnh (phân cành, chuẩn bị ra hoa rộ).

Đóng góp khoa học

Khóa luận đã cung cấp dẫn liệu thực nghiệm đầy đủ về hiệu quả ức chế in vivo trong điều kiện nhà lưới của tập đoàn vi khuẩn đối kháng bản địa đối với chủng nấm Colletotrichum scovillei LD06, khẳng định tính khả thi của việc phối hợp đa chủng vi khuẩn để tối ưu hóa hiệu lực sinh học tương đương thuốc bảo vệ thực vật hóa học.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế: Thí nghiệm mới dừng lại ở phạm vi chậu vại trong điều kiện nhà lưới có kiểm soát nhiệt độ, ẩm độ và kỹ thuật canh tác, chưa đánh giá dưới điều kiện đồng ruộng mở - nơi chịu ảnh hưởng phức tạp bởi thời tiết (mưa lớn rửa trôi, bức xạ UV làm suy giảm mật số vi sinh vật) và áp lực nguồn bệnh tự nhiên. Đề tài chưa đi sâu phân tích cơ chế phân tử và nhận diện chính xác các hoạt chất kháng sinh sinh học do các chủng vi khuẩn tiết ra.
  • Hướng mở rộng:
    • Tiếp tục thử nghiệm đồng ruộng diện hẹp và diện rộng để đánh giá độ ổn định của chế phẩm vi sinh qua các mùa vụ canh tác thực tế.
    • Định danh chính xác đến mức loài bằng giải trình tự gen 16S rRNA/gyrA cho các chủng vi khuẩn triển vọng.
    • Nghiên cứu công nghệ lên men, tạo chất mang và chất phụ gia bảo quản để hoàn thiện quy trình sản xuất chế phẩm sinh học dạng bột hòa nước hoặc dạng lỏng thương phẩm.

Giá trị tham khảo

  • Đối tượng thụ hưởng: Tài liệu tham khảo cho sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu viên các ngành Bảo vệ Thực vật, Nông học, Công nghệ Sinh học Nông nghiệp, Vi sinh vật ứng dụng và Bệnh học cây trồng.
  • Nội dung giá trị:
    • Quy trình chi tiết về tạo nguồn bệnh nhân tạo, thu thập và hiệu chỉnh mật số bào tử nấm Colletotrichum scovillei ($10^5\text{ bào tử/mL}$) và vi khuẩn đối kháng ($10^7\text{ CFU/mL}$).
    • Phương pháp thiết kế thí nghiệm đánh giá hiệu lực phòng bệnh và trừ bệnh độc lập ở 2 giai đoạn sinh trưởng xung yếu của cây rau ăn quả.
    • Phương pháp ứng dụng quy chuẩn kỹ thuật quốc gia (QCVN) để đánh giá chỉ số bệnh hại và xử lý số liệu chuyên sâu qua chỉ số AUDPC và phần mềm SAS.

Câu hỏi thường gặp

1. Nguồn nấm bệnh và các chủng vi khuẩn đối kháng được sử dụng trong đề tài có nguồn gốc từ đâu?

Mẫu nấm Colletotrichum scovillei chủng LD06 và các chủng vi khuẩn đối kháng (Bacillus sp. chủng CC-LD 2.4, Pseudomonas sp. chủng O-BT 1.2, Pseudomonas sp. chủng CC-FN 1.1) đều được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Bộ môn Bảo vệ Thực vật, Khoa Nông học, Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.

2. Mật độ vi khuẩn và bào tử nấm được hiệu chỉnh ở mức nào trước khi xử lý lên cây?

Dịch huyền phù vi khuẩn đối kháng được nuôi cấy tăng sinh trong môi trường LB lỏng và hiệu chỉnh mật số đạt $10^7\text{ CFU/mL}$. Dịch nấm bệnh Colletotrichum scovillei LD06 được thu bào tử từ đĩa PDA 14 ngày tuổi, lọc bỏ sợi nấm, đếm qua buồng đếm hồng cầu và hiệu chỉnh về nồng độ $10^5\text{ bào tử/mL}$. Thể tích phun cho mỗi chậu là 20 mL dịch sinh học kết hợp 4 mL chất bám dính.

3. Hiệu lực phòng trừ bệnh thán thư của nghiệm thức kết hợp 3 chủng vi khuẩn đạt kết quả cao nhất là bao nhiêu?

Nghiệm thức kết hợp 3 chủng vi khuẩn (Bacillus sp. CC-LD 2.4 + Pseudomonas sp. O-BT 1.2 + Pseudomonas sp. CC-FN 1.1) đạt hiệu lực phòng trừ cao nhất là 88,87% tại thời điểm 7 ngày sau xử lý trong thí nghiệm phòng bệnh ở giai đoạn ớt ra hoa, và đạt 85,73% ở 7 ngày sau xử lý trong thí nghiệm trừ bệnh ở giai đoạn ớt phân cành.

4. Dòng vi khuẩn nào thể hiện khả năng kích thích sinh trưởng cây ớt tốt nhất?

Chủng Pseudomonas sp. CC-FN 1.1 cho hiệu quả kích thích sinh trưởng cây ớt tốt nhất tại thời điểm 21 ngày sau xử lý, giúp chiều cao cây tăng gấp 1,32 lần và đường kính tán tăng gấp 1,24 lần so với nghiệm thức đối chứng tưới nước cất.

5. Kết quả hiệu lực phòng trừ ở thời điểm 21 ngày sau xử lý của nghiệm thức vi khuẩn phối hợp có tương đương thuốc hóa học không?

Có. Tại thời điểm 21 ngày sau xử lý ở cả hai giai đoạn phân cành và ra hoa, hiệu lực phòng trừ của nghiệm thức phối hợp 3 dòng vi khuẩn (41,58% - 50,18%) khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với thuốc hóa học đối chứng Ridomil Gold 68WG (44,37% - 52,56%) và thuốc sinh học BioBac 50WP (41,74% - 50,43%).

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Huỳnh Chí Hướng đã hoàn thành đầy đủ các mục tiêu đề ra, chứng minh được tiềm năng ứng dụng đối kháng của các chủng vi khuẩn bản địa Bacillus sp. và Pseudomonas sp. đối với nấm Colletotrichum scovillei gây bệnh thán thư trên cây ớt trong nhà lưới. Việc xử lý kết hợp 3 chủng vi khuẩn mang lại hiệu lực phòng trừ cao vượt trội so với xử lý đơn dòng, đạt hiệu quả tương đương thuốc hóa học Ridomil Gold 68WG ở 21 ngày sau xử lý mà không gây độc cho cây trồng. Đồng thời, các dòng vi khuẩn này còn đóng vai trò kích thích tăng trưởng chiều cao và tán cây, cung cấp cơ sở khoa học vững chắc cho việc phát triển các chế phẩm sinh học trừ bệnh thán thư phục vụ canh tác ớt bền vững.