Luận án tiến sĩ đánh giá hiệu quả phòng chống lão hóa da của astaxanthin chiết xuất từ tảo haematococcus pluvialis trên mô hình chuột

Luận án tiến sĩ đánh giá hiệu quả phòng chống lão hóa da của astaxanthin từ tảo Haematococcus pluvialis trên mô hình chuột, mang lại kết quả khả quan.

• Tác giả: Tô Minh Quân
• Người hướng dẫn: PGS. Trần Công Toại
• Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
• Đề tài: Đánh Giá Hiệu Quả Chống Lão Hóa Da Của Astaxanthin Từ Tảo Haematococcus Pluvialis Trên Chuột
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Tp. Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỞ ĐẦU
• 1.1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1.1. Tổng quan về vi tảo Haematococcus pluvialis
• 1.1.2. Đặc điểm hình thái
• 1.1.3. Giới thiệu về astaxanthin
• 1.1.4. Nguồn thu nhận AST
• 1.1.5. Quá trình hình thành astaxanthin ở Haematococcus pluvialis
• 1.1.6. Điều kiện nuôi cấy và cảm ứng AST ở Haematococcus pluvialis
• 1.2. Cơ chế chống lão hóa của AST
• 1.2.1. Hoạt tính chống oxy hóa
• 1.2.2. Hoạt tính kháng viêm
• 1.2.3. Hoạt tính tăng cường miễn dịch
• 1.2.4. Hoạt tính điều hòa sửa chữa tổn thương tế bào và DNA
• 1.2.5. Cấu trúc da
• 1.2.6. Chức năng của ROS. ROS trong lão hóa và các bệnh liên quan đến tuổi tác
• 1.3. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP
• 1.3.1. Phương pháp nghiên cứu
• 1.3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
• 1.3.1.2. Môi trường nuôi tảo
• 1.3.1.3. Hóa chất nuôi tế bào. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát
• 1.3.1.4. Phương pháp nghiên cứu. Thiết kế hệ thống nuôi tảo
• 1.3.1.5. Phương pháp nuôi tảo trong chai nuôi 1000 ml
• 1.3.1.6. Phương pháp cảm ứng tảo HP-C tổng hợp AST bằng cường độ ánh sáng mạnh
• 1.3.1.7. Phương pháp thu nhận dịch chiết AST
• 1.3.1.8. Phương pháp định lượng AST
• 1.3.1.9. Phương pháp thu nhận dịch chiết tảo Haematococcus pluvialis giàu AST (AST-EX)
• 1.3.1.10. Phương pháp FRAP
• 1.3.1.11. Phương pháp ABTS
• 1.3.1.12. Phương pháp đánh giá độc tính của AST-EX trên nguyên bào sợi
• 1.3.2. Phương pháp đánh giá sự tăng sinh của nguyên bào sợi trong môi trường AST-EX
• 1.3.3. Phương pháp đánh giá sự di cư tế bào theo phương pháp Scratch-wound assay
• 1.3.4. Phương pháp MTT để đánh giá sức sống tế bào
• 1.3.5. Phương pháp tạo mô hình lão hóa bằng hydrogen peroxide (H2O2)
• 1.3.6. Phương pháp nhuộm senescence-associated β-galactosidase
• 1.3.7. Phương pháp đánh giá khả năng của AST-EX trong việc bảo vệ tế bào trước yếu tố gây lão hóa H2O2
• 1.3.8. Phương pháp nhuộm Hoestch và phalloidin để đánh giá hình dạng tế bào
• 1.3.9. Phương pháp đánh giá sự biểu hiện mRNA tế bào bằng phương pháp realtime PCR
• 1.3.10. Phương pháp WESTERN BLOT đánh giá sự biểu hiện CDK4, CDK6 và cyclin D1
• 1.3.11. Phương pháp tạo mô hình chuột lão hóa da
• 1.3.12. Phương pháp đánh giá khả năng bảo vệ da chuột khỏi tia UVB
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN
• 3.1. Nuôi cấy tăng sinh HP-C và cảm ứng AST
• 3.2. Tách chiết AST
• 3.3. Chống oxi hóa FRAP
• 3.4. Chống oxi hóa ABTS
• 3.5. Độc tính in vitro
• 3.6. Khảo sát quy trình gây lão hóa tế bào bằng H2O2
• 3.6.1. Kết quả khảo sát sự tăng trưởng tế bào
• 3.6.2. Kết quả khảo sát sự biểu hiện SA-gal
• 3.6.3. Khảo sát khả năng bảo vệ tế bào nguyên bào sợi của AST-EX khỏi tác động của H2O2
• 3.6.4. Kết quả đánh giá diện tích tế bào
• 3.6.5. Kết quả đánh giá sự tăng sinh tế bào
• 3.6.6. Kết quả đánh giá sự biểu hiện SA-gal
• 3.6.7. Kết quả đánh giá sự biểu hiện marker lão hóa p53, p21, p16 bằng phương pháp realtime PCR
• 3.6.8. Kết quả đánh giá sự biểu hiện MMP3, MMP1, collagen, elastin
• 3.7. Kết quả đánh giá sự biểu hiện CDK4, CDK6, cyclin D1
• 3.8. Kết quả đánh giá khả năng bảo vệ da chuột lão hóa do tia UV
• 3.8.1. Mô hình lão hóa da do tia UV
• 3.8.2. Kết quả khả năng bảo vệ da của AST-EX khỏi tác hại tia UV
• KẾT LUẬN- KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu về Astaxanthin và tảo Haematococcus Pluvialis

Astaxanthin (AST) là một carotenoid có công thức hóa học 3,3'-dihydroxy-β-carotene-4,4'-dione, được biết đến với hoạt tính chống oxy hóa mạnh mẽ. Nguồn AST tự nhiên tốt nhất hiện nay là từ tảo Haematococcus Pluvialis, với hàm lượng AST có thể đạt tới 5% khối lượng khô. AST từ tảo Haematococcus Pluvialis tồn tại ở dạng đồng phân 3S,3’S, có hoạt tính cao và tốt cho sức khỏe. AST được ứng dụng rộng rãi trong y học và thẩm mỹ, đặc biệt trong việc chống lão hóa da.

1.1. Cơ chế chống lão hóa của Astaxanthin

AST hoạt động như một chất chống oxy hóa mạnh, giúp trung hòa các gốc oxy hóa (ROS) gây hại cho tế bào. ROS được sinh ra từ quá trình sinh lý bình thường hoặc do tác động của các yếu tố bên ngoài như tia UV, khói bụi. AST bảo vệ tế bào da bằng cách giảm thiểu tổn thương DNA, protein và lipid, đồng thời kích thích sản xuất collagen và elastin, giúp da duy trì độ đàn hồi và ngăn ngừa các dấu hiệu lão hóa.

1.2. Nguồn thu nhận Astaxanthin

Ngoài tảo Haematococcus Pluvialis, AST còn được thu nhận từ các nguồn khác như thịt cá hồi, vỏ tôm, cua và vi nấm Phaffia rhodozyma. Tuy nhiên, tảo Haematococcus Pluvialis vẫn được coi là nguồn AST tốt nhất do hàm lượng cao và dạng đồng phân có hoạt tính sinh học cao.

II. Nghiên cứu trên chuột về hiệu quả chống lão hóa da của Astaxanthin

Nghiên cứu này tập trung vào việc đánh giá hiệu quả của dịch chiết giàu AST (AST-EX) từ tảo Haematococcus Pluvialis trong việc bảo vệ tế bào nguyên bào sợi (hF) khỏi tác hại của hydrogen peroxide (H2O2) và bảo vệ da chuột khỏi tia UVB. Kết quả cho thấy AST-EX ở nồng độ 1 µg/ml giúp duy trì sự tăng sinh tế bào, giảm biểu hiện các marker lão hóa như p21, p16 và phục hồi sản xuất collagen, elastin.

2.1. Hiệu quả chống lão hóa trên tế bào nguyên bào sợi

Khi tế bào hF được xử lý với AST-EX trước khi tiếp xúc với H2O2, AST-EX giúp giảm đáng kể tổn thương tế bào, duy trì sự tăng sinh và giảm biểu hiện của β-galactosidase lão hóa. Điều này chứng tỏ AST-EX có khả năng bảo vệ tế bào khỏi tác hại của ROS và ngăn ngừa quá trình lão hóa tế bào.

2.2. Hiệu quả bảo vệ da chuột khỏi tia UVB

Da chuột được thoa AST-EX trước khi chiếu tia UVB cho thấy sự giảm đáng kể các dấu hiệu lão hóa như nhăn da, nhão da và độ dày biểu bì. AST-EX cũng giúp giảm sự biểu hiện của collagen bất thường, chứng tỏ khả năng bảo vệ da khỏi tác hại của tia UV.

III. Cơ chế chống lão hóa của Astaxanthin

AST hoạt động thông qua nhiều cơ chế khác nhau để ngăn ngừa lão hóa da. Ngoài việc trung hòa ROS, AST còn kích thích sản xuất collagen và elastin, giảm biểu hiện của các enzyme phân hủy protein như MMP1 và MMP3, đồng thời điều hòa chu kỳ tế bào thông qua các protein như CDK4, CDK6 và cyclin D1.

3.1. Hoạt tính chống oxy hóa

AST có khả năng hấp thụ và trung hòa các ROS, ngăn chặn tổn thương tế bào và DNA. Điều này giúp giảm thiểu quá trình lão hóa tế bào và duy trì chức năng da.

3.2. Tác dụng kháng viêm

AST còn có khả năng kháng viêm, giúp giảm các phản ứng viêm do tác hại của ROS và tia UV, từ đó bảo vệ da khỏi các tổn thương do lão hóa.

IV. Kết luận và ứng dụng thực tiễn

Nghiên cứu đã chứng minh hiệu quả chống lão hóa da của AST-EX từ tảo Haematococcus Pluvialis trên cả mô hình tế bào và chuột. AST-EX không chỉ bảo vệ tế bào khỏi tác hại của ROS mà còn giúp phục hồi và duy trì cấu trúc da. Kết quả này mở ra tiềm năng ứng dụng AST trong các sản phẩm dưỡng da và thẩm mỹ, giúp ngăn ngừa và làm chậm quá trình lão hóa da.

4.1. Ứng dụng trong thẩm mỹ

AST có thể được sử dụng trong các sản phẩm dưỡng da dạng thoa, giúp tăng hiệu quả chống lão hóa và giảm giá thành sử dụng, mang lại lợi ích cho người tiêu dùng.

4.2. Hướng nghiên cứu tương lai

Cần thêm các nghiên cứu lâm sàng để đánh giá hiệu quả của AST trên người, đồng thời tối ưu hóa quy trình sản xuất AST từ tảo Haematococcus Pluvialis để giảm chi phí và tăng khả năng ứng dụng thương mại.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Astaxanthin (AST) là một chất thuộc nhóm carotenoid với công thức hóa học 3,3'- dihydroxy-β-carotene-4,4'-dione. AST có hoạt tính chống oxi hóa hàng đầu hiện nay và được ứng dụng rất nhiều trong y học để chữa trị các bệnh có nguyên nhân là các gốc oxy hoạt động (ROS): tim mạch, khớp, tiểu đường, … Hiện nay, AST được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như thịt cá hồi, vỏ tôm, cua, vi nấm (Phaffia rhodozyma). Trong những nguồn AST tự nhiên, tảo Haematococcus pluvialis (H. pluvialis) được xem là nguồn AST tốt nhất hiện nay.

Nồng độ AST cao nhất trong tảo H. pluvialis có thể có thể đạt đến là 5% khối lượng khô, cao gấp 33 lần so với AST từ tôm, gần 1000 lần so với thịt cá hồi [1]. Đồng thời, AST từ tảo H. pluvialis tồn tại ở dạng đồng phân có hoạt tính cao, tốt cho sức khỏe (3S,3’S).

Đối với lĩnh vực thẩm mỹ, AST thường được sử dụng để chống lại lão hóa da. Hiện tượng lão hóa da có nguyên nhân từ bên trong và bên ngoài cơ thể. Các gốc oxy hóa hoạt động (ROS) là một trong những nguyên nhân chính gây ra quá trình lão hóa da. ROS được sinh ra liên tuc trong quá trình sinh lý bình thường trong suốt chu kỳ sống của tế bào như ROS được sinh ra trong chuỗi truyền điện tử trong ty thể.

Khi được sinh ra, ROS có khả năng phá hủy các phân tử DNA, protein, lipid mà ROS tiếp xúc. Lượng ROS có khả năng da tăng theo sự quá trình lão hóa sinh lý cũng như bị tác động bởi các tác nhân bên ngoài như tia cực tím (tia UV), khói bụi… Tia UV trong ánh sáng mặt trời không chỉ phá hủy tế bào da mà còn sinh ra lượng lớn ROS gây tổn hại lên tế bào da (nguyên bào sợi, tế bào sừng) và những protein chính trong chất nền da như collagen, elastin, đồng thời ngăn cản sự tổng hợp mới những protein nói trên [2]. Do đó, khi tiếp xúc với tia UV trong thời gian dài, da sẽ xuất hiện những dấu hiệu lão hóa: xuất hiện viết nhăn, da trở nên nhão, kém đàn hồi. AST là chất chống oxi hóa mạnh có khả năng hấp thu những gốc tự do này nên có khả năng ức chế quá trình lão hóa da do ROS sinh ra trong quá trình sinh lý hoặc do tia UV.

Hiện nay các nghiên cứu ứng dụng AST trong thẩm mỹ trên đối tượng động vật và những thử nghiệm lâm sàng trên người tập trung vào AST dạng uống. Giá thành hiện nay của AST vẫn còn cao (giá thành bột tảo giàu AST được bán khoảng 400 USD/kg trên các trang mạng online, giá AST dạng bột tinh khiết có thể lên tới 40000 USD/kg), việc sử dụng AST dạng thoa có thể làm tăng hiệu quả chống lão hóa và giảm giá thành sử dụng, điều này giúp nhiều người có điều kiện tiếp cận được với sản phẩm có chất n 2 lượng tốt. Tuy nhiên, hiện nay vẫn chưa có nghiên cứu đánh giá hiệu quả của AST trong việc bảo vệ nguyên bào sợi chống lại tác hại các ROS trực tiếp ở cấp độ tế bào, nội phân tử cũng như chưa có nghiên cứu xác định nồng độ hiệu quả của AST dạng thoa. Đồng thời nguồn tảo Haematococcus pluvialis trong nước rất ít (hiện chỉ có chủng HB và chùng LC của viện Công nghệ Sinh học được thông báo rộng rãi) và những khảo sát tiến hành tập trung vào quá trình nuôi cấy để thu AST, chưa tập trung vào ứng dụng của AST.

Do đó, trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng nguồn tảo trong nước (chủng LC) để cung cấp thêm thông tin về 1 nguồn tảo có thể sử dụng thương mại. Nghiên cứu được tiến hành với mục đích đánh giá hiệu quả của dịch chiết tảo H. pluvialis giàu AST trong bảo vệ nguyên bào sợi khỏi tác nhân ROS trực tiếp in vitro và bảo vệ da khi sử dụng dạng thoa trên mô hình động vật bị lão hóa do tia UVB. Mục tiêu tổng quát: - Đánh giá hiệu quả chống lão hóa của dịch chiết tảo Haematococcus pluvialis giàu astaxanthin trên mô hình tế bào và chuột.

Mục tiêu cụ thể: - Cảm ứng thành công AST từ vi tảo Haematococcus pluvialis - Đánh giá được hiệu quả của dịch chiết tảo Haematococcus pluvialis giàu astxanthin trong việc bảo vệ nguyên bào sợi khỏi tác nhân hydrogen peroxide trong điều kiện in vitro. - Đánh giá được hiệu quả bảo vệ da chuột của dịch chiết tảo giàu AST khỏi tia UVB. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan về vi tảo Haematococcus pluvialis A B Hình 1.

Tế bào vi tảo Haematococcus pluvialis [3]. A: Nang bào tử sinh dưỡng, B: Nang bào tử cảm ứng trưởng thành Tên khoa học: Haematococcus pluvialis. Phân loại khoa học: Giới Eukaryote Ngành Chlorophyta Lớp Chlorophyceae Bộ Volvocales Họ Haematococcaceae Chi Haematococcus H. pluvialis là một loài vi tảo lục đơn bào có roi, có vùng phân bố rộng ở các vùng ôn đới đới và đã được phân lập từ Châu Âu, Châu Phi, Bắc Mỹ và Himachal Pradeslv Ấn Độ [4].

Đặc điểm hình thái Hình thái tế bào của H. pluvialis có sự biến đổi khác nhau trong chu trình sống của chúng. Tế bào có 2 dạng, tương ứng với đặc điểm sinh trưởng: tế bào sinh dưỡng và nang bào tử (cyst). Trong đó: - Tế bào sinh dưỡng: màu xanh, dạng cầu hoặc elip với đường kính khoảng 10 – 20 µm, có thể chuyển động nhanh nhờ 2 roi.

Trong điều kiện thuận lợi, phần lớn các tế n 4 bào tảo tồn tại ở dạng sinh dưỡng, có hàm lượng chlorophyll a, b và tiền chất carotenoid cao, nhân nằm ở trung tâm tế bào với diệp lục vây quanh, có rất ít hạt chứa AST nằm xung quanh nhân. Các tế bào sinh dưỡng có thể phân chia tạo thành 2-32 tế bào con. Khi điều kiện trở nên bất lợi (cạn kiệt dinh dưỡng, cường độ ánh sáng cao, nhiệt độ cao, stress muối, …), các tế bào sinh dưỡng bắt đầu mất roi, phình to. Trong giai đoạn này, tảo ở trạng thái tế bào sinh dưỡng hình cầu bất động (pamelloid).

- Nang bào tử: Khi điều kiện bất lợi tiếp tục diễn ra, tế bào sinh dưỡng sẽ bắt đầu tích lũy AST để hình thành nang bào tử. Trong suốt quá trình bất đầu hình thành nang bào tử, H. pluvialis chuyển từ màu xanh lục sang tế bào có màu xanh lẫn cam, đây là giai đoạn trung gian của giai đoạn sinh dưỡng và nang bào tử trưởng thành. Một số tác giả gọi giai đoạn này là giai đoạn nang bào tử non hoặc tế bào trung gian.

Trong giai đoạn này các túi tinh bột có thể thấy rõ cùng với những hạt dầu với nhiều kích thước chứa AST nằm xung quanh nhân. Đi cùng với sự tích lũy AST, diệp lục giảm về thể tích nhưng quá trình quang hợp vẫn còn xảy ra cho đến khi giai đoạn bào nang bắt đầu. Lúc này diệp lục bị phân hủy hoàn toàn và thay thế bởi những hạt dầu chứa AST. Khi điều kiện bất lợi tiếp tục diễn ra, tế bào tổng tích lũy lượng lớn AST và chuyển thành nang bào tử trưởng thành (giai đoạn cyst hoặc còn gọi là aplanopspore).

Tế bào có hình cầu, không còn khả năng di động màu đỏ sậm. Thành tế bào dày lên, đường kính tăng 40 – 50 µm. Tốc độ sinh trưởng của tế bào giảm và tế bào tích luỹ một lượng lớn astaxanthin [5, 6], [7]. - Giai đoạn nảy mầm: Khi điều kiện trở nên thuận lợi, nang bào tử trưởng thành nảy mầm thành tế bào sinh dưỡng có roi di động để bắt đầu chu kỳ phát triển tiếp theo.

Trong giai đoạn này, một tế bào cyst có khả năng tạo thành 64 tế bào con với kích thước nhỏ (<10 µm). Các chu kỳ tế bào của H. pluvialis trong chu kỳ sống [4]. (A), Tế bào sinh dưỡng thể di động; (B) Tế bào sinh dưỡng hình cầu bất động; (C) AST bắt đầu được tích lũy trong tronng tế bào sinh dưỡng hình cầu, (D) Nang bào tử trưởng thành tích lũy đầy đủ AST.

Vòng đời tự nhiên của vi tảo [4]. Trái: tế bào với nhiều giọt dầ, phải: tế bào với các giọt dầu dung hợp tạo nên những giọt dầu rất lớn trong tế bào. N: nhân, OD: giọt dầu 1. Giới thiệu về astaxanthin Astaxanthin là một xanthophyll carotenoid có tên công thức khoa học là 3,3'- dihydroxy-ß-carotene-4,4'-dione.

AST có cấu trúc mạch thẳng với 2 đầu là 2 vòng ionone có nhóm liên kết hydroxyl và keto. Hai đầu được nối với nhau bằng một chuỗi polyene bao gồm các liên kết C-C với các liên kết đôi và đơn xen kẽ lẫn nhau (Hình 1. Do cấu trúc đặc trưng: dạng thẳng, gồm 3 phần phân cực – không cực – phân cực nên đã giúp cho astaxanthin có tính chất độc đáo là xen giữa màng tế bào (Hình 2). Điều này tạo nên tính chất chống oxi hóa độc đáo của astaxanthin: o Vòng ionone ở hai đầu giúp chống oxi hóa trong và ngoài màng sinh học (màng tế bào, màng nhân, màng ti thể…) o Chuỗi C-C giúp chống oxi giữa màng sinh học (màng tế bào, màng nhân, màng ti thể…) n 6 Hình 1.

Cấu trúc astaxanthin [9]. Ngoài ra, một tính chất quan trọng khác của astaxanthin là astaxanthin không bị biến đổi thành chất pro-oxidant (chất gây oxi hóa) khi bị kích thích như các chất β- carotene, vitamin C. Đây cũng chính là một trong những nguyên nhân tạo nên tính an toàn cao của astaxanthin. Thực tế, astaxanthin có khả năng oxi hóa cao hơn α- tocopherol 100 lần và cao hơn các hợp chất zeaxanthin, lutein, canthaxanthin, β- carotene 10 lần [1].

Vị trí chống oxi hóa của AST [9] Với khả năng chống oxi hóa hiệu quả như trên, hiện nay AST được sử dụng trên toàn thế giới để chống lại các căn bệnh có liên quan đến các gốc oxi hóa như bệnh tim mạch, viêm khớp, tiểu đường, ung thư … đặc biệt là dùng để chống lão hóa. AST có tính an toàn cao, một số nghiên cứu ghi nhận liều dùng AST có thể lên tới 40 mg/ngày [1]. Do đó, AST được sử dụng trên thế giới như 1 loại thực phẩm chức năng hằng ngày để chống lại các gốc oxi hóa hoặc chống lão hóa nhưng các nghiên cứu lâm sàng trên AST vẫn chưa được tiến hành ở quy mộ lớn mà chỉ ở những quy mô n 7 nhỏ (khoảng 50 người) [10]. Đa phần người sử dụng đều cảm nhận rõ ràng sự phục hồi sức khỏe.

Nguồn thu nhận AST Hiện nay trên thị trường có 2 loại AST đang lưu hành: AST tự nhiên và astxanthin tổng hợp. AST tự nhiên là AST được chiết xuất từ những nguồn tự nhiên như tảo, nấm, thịt… AST tổng hợp là AST được tổng hợp bằng những phản ứng hóa học từ dầu mỏ.