Đánh giá khả năng ức chế nấm phytophthora gây bệnh thối nhũn trên quả cam của chế phẩm nano khóa luận tốt nghiệp

Đánh giá hiệu quả chế phẩm nano trong ức chế nấm Phytophthora gây bệnh thối nhũn trên quả cam, ứng dụng trong nông nghiệp bền vững.

• Tác giả: Nguyễn Thị Huyên
• Người hướng dẫn: PGS. Đồng Huy Giới
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
• Đề tài: Đánh giá khả năng ức chế nấm Phytophthora nicotianae gây bệnh thối nhũn trên quả cam của chế phẩm nano
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. PHẦN I: MỞ ĐẦU
• 1.1. Mục đích và yêu cầu
• 2. PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Giới thiệu về cây cam
• 2.2. Nguồn gốc, phân bố, lịch sử phát hiện và phân loại cam
• 2.3. Một số bệnh về cam phổ biến
• 2.4. Tổng quan về nấm Phytophthora nicotianae
• 2.5. Nấm Phytophthora nicotianae
• 2.6. Triệu chứng và biện pháp phòng trừ
• 2.7. Tình hình nghiên cứu về nấm Phytophthora nicotianae
• 2.8. Giới thiệu về công nghệ nano
• 2.9. Giới thiệu về công nghệ nano và công nghệ nano sinh học
• 2.10. Ưu điểm của nano trong phòng trừ bệnh trên thực vật
• 2.11. Tình hình nghiên cứu nano trên thế giới và Việt Nam
• 2.12. Tình hình nghiên cứu nano bạc trên thế giới và Việt Nam
• 2.13. Tình hình nghiên cứu nano đồng trên thế giới và Việt Nam
• 3. PHẦN III: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Vật liệu, dụng cụ, hóa chất thí nghiệm
• 3.2. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm
• 3.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 3.4. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
• 3.4.1. Nội dung nghiên cứu
• 3.4.2. Các phương pháp nghiên cứu
• 4. PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Khả năng ức chế của nano bạc đối với tản nấm Phytophthora nicotianae gây bệnh thối nhũn trên cam trong điều kiện in vitro
• 4.2. Khả năng ức chế của nano đồng đối với tản nấm Phytophthora nicotianae gây bệnh thối nhũn trên cam trong điều kiện in vitro
• 4.3. Khả năng ức chế của nano bạc đồng đối với tản nấm Phytophthora nicotianae gây bệnh thối nhũn trên cam trong điều kiện in vitro
• 4.4. Khả năng ức chế của nano bạc đối với khả năng phát triển bào tử của nấm Phytophthora nicotianae gây bệnh thối nhũn trên cam trong điều kiện in vitro
• 4.5. Khả năng ức chế của nano đồng đối với khả năng phát triển bào tử của nấm Phytophthora nicotianae gây bệnh thối nhũn trên cam trong điều kiện in vitro
• 4.6. Khả năng ức chế của nano bạc đồng đối với khả năng phát triển bào tử của nấm Phytophthora nicotianae gây bệnh thối nhũn trên cam trong điều kiện in vitro
• 4.7. Hiệu quả trị bệnh thối nhũn trên cam do nấm Phytphothora nicotianae trong điều kiện in vivo
• 5. PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu về chế phẩm nano

Chế phẩm nano là một trong những công nghệ tiên tiến được ứng dụng rộng rãi trong nông nghiệp, đặc biệt trong việc phòng trừ bệnh do nấm gây ra. Công nghệ nano cho phép tạo ra các hạt có kích thước nhỏ, giúp tăng cường khả năng thẩm thấu và hiệu quả trong việc ức chế nấm. Nghiên cứu cho thấy, các chế phẩm nano bạc và nano đồng có khả năng tiêu diệt mầm bệnh, trong đó có Phytophthora nicotianae, tác nhân chính gây bệnh thối nhũn cam. Việc sử dụng chế phẩm nano không chỉ mang lại hiệu quả cao trong việc phòng trừ bệnh mà còn thân thiện với môi trường, giảm thiểu tác động tiêu cực đến hệ sinh thái. Theo một nghiên cứu gần đây, chế phẩm nano đã cho thấy hiệu quả ức chế lên đến 100% đối với Phytophthora trong điều kiện thí nghiệm. Điều này mở ra hướng đi mới cho việc bảo vệ cây trồng, đặc biệt là trong bối cảnh nông nghiệp bền vững.

II. Tình hình nghiên cứu về nấm Phytophthora

Nấm Phytophthora là một trong những tác nhân gây hại nghiêm trọng đến cây trồng, đặc biệt là cây cam. Bệnh thối nhũn do Phytophthora nicotianae gây ra đã gây thiệt hại lớn cho sản xuất nông nghiệp. Nghiên cứu cho thấy, nấm này thường phát triển mạnh trong điều kiện ẩm ướt, làm giảm năng suất và chất lượng quả cam. Các biện pháp phòng trừ truyền thống như sử dụng thuốc hóa học không chỉ tốn kém mà còn có thể gây ô nhiễm môi trường. Do đó, việc nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm nano để ức chế nấm Phytophthora là cần thiết. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, chế phẩm nano bạc và nano đồng có khả năng ức chế sự phát triển của nấm này, từ đó giúp bảo vệ cây cam hiệu quả hơn. Việc áp dụng công nghệ này không chỉ giúp tăng năng suất mà còn đảm bảo an toàn cho người tiêu dùng.

III. Hiệu quả của chế phẩm nano trong phòng trừ bệnh thối nhũn

Kết quả nghiên cứu cho thấy, chế phẩm nano có hiệu quả rõ rệt trong việc ức chế nấm Phytophthora nicotianae gây bệnh thối nhũn trên quả cam. Cụ thể, khi sử dụng nano bạc ở nồng độ 100 ppm, nano đồng ở nồng độ 50 ppm, và nano bạc đồng ở nồng độ 40 ppm, hiệu lực ức chế đạt 100% trong điều kiện in vitro. Điều này chứng tỏ rằng chế phẩm nano không chỉ có khả năng tiêu diệt nấm mà còn ngăn chặn sự phát triển của bào tử nấm. Trong điều kiện in vivo, các nồng độ này cũng cho thấy hiệu quả tốt trong việc trị bệnh thối nhũn. Việc áp dụng chế phẩm nano không chỉ giúp bảo vệ cây trồng mà còn mở ra hướng đi mới cho nông nghiệp bền vững, giảm thiểu sự phụ thuộc vào hóa chất độc hại.

IV. Đánh giá tổng quan và ứng dụng thực tiễn

Nghiên cứu về chế phẩm nano trong việc ức chế nấm Phytophthora đã chỉ ra nhiều tiềm năng ứng dụng trong thực tiễn. Việc sử dụng chế phẩm này không chỉ giúp nâng cao hiệu quả phòng trừ bệnh mà còn góp phần bảo vệ môi trường. Các nông dân có thể áp dụng chế phẩm nano trong quy trình sản xuất cam để giảm thiểu thiệt hại do bệnh thối nhũn. Hơn nữa, việc nghiên cứu và phát triển các chế phẩm nano mới có thể mở ra nhiều cơ hội cho ngành nông nghiệp, giúp tăng cường sức cạnh tranh và đảm bảo an toàn thực phẩm. Từ đó, việc ứng dụng công nghệ nano trong nông nghiệp không chỉ mang lại lợi ích kinh tế mà còn góp phần vào sự phát triển bền vững của ngành nông nghiệp Việt Nam.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Cây cam (Citrus sinensis (L.) Osbeck), thuộc chi Cam chanh (Citrus), họ Cam chanh (Rutaceae), là một trong những loại cây ăn quả có múi phổ biến và có giá trị kinh tế hàng đầu trên thế giới cũng như tại Việt Nam. Tại nước ta, diện tích trồng cây có múi chiếm khoảng 70% tổng diện tích cây ăn quả, trong đó cam là đối tượng canh tác chủ lực. Tuy nhiên, do đặc thù khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng ẩm, các vùng trồng cam thường xuyên đối mặt với nhiều loại sâu bệnh hại nghiêm trọng làm suy giảm nghiêm trọng năng suất, chất lượng và giá trị thương phẩm.

Bên cạnh các tác nhân vi khuẩn (Xanthomonas campestris, Candidatus Liberibacter spp.) và sâu hại (sâu vẽ bùa, sâu đục cành, rầy chổng cánh, ruồi đục quả, nhện đỏ), nguồn bệnh do nấm là mối đe dọa thường trực. Trong đó, bệnh thối nhũn (hay chảy gôm, thối quả) do nấm Phytophthora nicotianae (đồng nghĩa Phytophthora parasitica) gây ra là nguyên nhân chính gây tổn thất nặng nề, đặc biệt trên các giống như cam mật, quýt đường. Nấm tấn công mạnh vào mùa mưa, điều kiện ẩm độ cao, gây hại trên các quả già và quả ở vị trí khuất tán thiếu ánh sáng; vết bệnh ban đầu chuyển sang màu nâu nhạt úng nước, sau đó thối mềm, bốc mùi cay hôi đặc trưng, xuất hiện lớp tơ nấm trắng bao phủ và làm rụng quả hàng loạt khi vết thối chiếm từ 1/3 đến 1/2 diện tích vỏ.

Các biện pháp phòng trừ hóa học truyền thống (sử dụng Ridomil Gold 68WG, Mexyl-MZ 72WP, Alpine 80WG...) bộc lộ nhiều hạn chế về mặt tồn dư hóa chất độc hại trên nông sản sau thu hoạch, gây ô nhiễm môi trường đất, nước và dẫn đến hiện tượng kháng thuốc ở vi sinh vật. Trong bối cảnh đó, vật liệu nano (nano bạc, nano đồng, nano bạc – đồng) nổi lên như một giải pháp kháng khuẩn, kháng nấm sinh học tiềm năng nhờ diện tích bề mặt tiếp xúc lớn, hiệu quả tiêu diệt mầm bệnh cao, an toàn cho thực vật, không gây tồn dư độc hại và hạn chế tối đa nguy cơ kháng thuốc.

Mục tiêu nghiên cứu:

1. Xác định nồng độ nano (nano bạc, nano đồng, nano bạc – đồng) và thời gian xử lý thích hợp nhằm ức chế nấm Phytophthora nicotianae gây bệnh thối nhũn trên quả cam trong điều kiện in vitro.
2. Xác định nồng độ chế phẩm nano thích hợp để ứng dụng phòng trị bệnh và bảo quản quả cam sau thu hoạch trong điều kiện in vivo.

Nhiệm vụ nghiên cứu:

1. Đánh giá hiệu lực ức chế sự phát triển tản nấm Phytophthora nicotianae của các chế phẩm nano ở các nồng độ khác nhau theo thời gian trong điều kiện in vitro.
2. Đánh giá hiệu lực ức chế sự nảy mầm bào tử của nấm Phytophthora nicotianae của các chế phẩm nano theo các mốc thời gian (12h, 24h, 48h) trong điều kiện in vitro.
3. Đánh giá khả năng phòng trị bệnh thối nhũn trên quả cam do nấm Phytophthora nicotianae gây ra bằng phương pháp lây nhiễm nhân tạo trong điều kiện in vivo.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Chủng nấm thuần Phytophthora nicotianae (do Trung tâm Bệnh cây nhiệt đới – Khoa Nông học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam cung cấp); các dung dịch chế phẩm nano bạc (AgNPs), nano đồng (CuNPs), nano bạc – đồng gốc 1000 ppm; quả cam (Citrus sinensis) thương phẩm đạt độ chín thu hoạch.
• Phạm vi không gian: Phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh học, Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
• Phạm vi thời gian: Từ tháng 09/2020 đến tháng 02/2021.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và cơ chế tác động

• Đặc điểm phân loại học của nấm Phytophthora nicotianae: Thuộc chi Phytophthora, họ Peronosporaceae, bộ Peronosporales, lớp Oomycetes, ngành Oomycota. Nấm tồn tại ở dạng sợi và bào tử; nang bào tử khi gặp ẩm độ và nhiệt độ thích hợp sẽ phóng thích các động bào tử có hai roi bơi lội trong nước, xâm nhập qua vết thương cơ giới hoặc khí khổng của quả và rễ cây.
• Cơ sở khoa học của vật liệu nano kim loại: Hiệu ứng kích thước lượng tử và hiệu ứng diện tích bề mặt riêng cực lớn giúp các hạt nano có khả năng phản ứng và tiếp xúc tế bào vượt trội so với vật liệu dạng khối.
• Cơ chế kháng nấm của nano bạc (AgNPs): Các ion bạc ($Ag^+$) và hạt nano phân tán liên kết với nhóm chức mang lưu huỳnh (-SH, sulfhydryl/sulfate) của các protein và enzyme trên màng tế bào nấm, làm biến tính protein, phá hủy tính toàn vẹn của màng tế bào, ức chế chuỗi hô hấp và thâm nhập nội bào để bất hoạt enzyme chuyển hóa. Kích thước hạt từ 1–10 nm tạo hiệu ứng điện tử mạnh giúp gia tăng độc tính đối với tế bào vi sinh vật.
• Cơ chế kháng nấm của nano đồng (CuNPs): Hạt nano đồng giải phóng liên tục ion $Cu^+$ và $Cu^{2+}$, xúc tác hình thành các gốc tự do hydroxyl ($^{\bullet}OH$) phá hủy liên kết xoắn kép của DNA, liên kết với nhóm carboxyl và amino sulfhydryl của amino acid làm tê liệt các protein vận chuyển màng và enzyme nội bào.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

1. Phương pháp đánh giá ức chế sự phát triển tản nấm in vitro:

   • Môi trường nuôi cấy: PDA (Potato Dextrose Agar: 200 g khoai tây, 20 g glucose, 20 g agar, 1000 mL nước cất).
   • Bố trí thí nghiệm: Bổ sung dung dịch nano vào môi trường PDA vô trùng để đạt các dải nồng độ khảo sát:
     • Nano bạc: 20, 40, 60, 80, 100 ppm.
     • Nano đồng: 10, 20, 30, 40, 50 ppm.
     • Nano bạc – đồng: 20, 25, 30, 35, 40 ppm.
     • Đối chứng âm (ĐC-): Nước cất vô trùng (0 ppm).
     • Đối chứng dương (ĐC+): Thuốc BVTV Ridomil Gold 68WG.
   • Đặt miếng thạch nấm thuần kích thước $3 \times 3\text{ mm}$ vào tâm đĩa petri (25 mL môi trường), nuôi ở nhiệt độ $25–30^\circ\text{C}$. Đo đường kính tản nấm ($d$) sau các mốc 1, 3, 5, 7 ngày.
   • Hiệu lực ức chế tản nấm ($H_1%$) tính theo công thức: $$H_1 (%) = \frac{D - d}{D} \times 100$$ (Trong đó: $D$ là đường kính khuẩn lạc ở nghiệm thức đối chứng âm; $d$ là đường kính khuẩn lạc ở nghiệm thức có bổ sung nano).

2. Phương pháp đánh giá ức chế sự nảy mầm bào tử in vitro:

   • Thu dịch bào tử từ đĩa nấm 14 ngày tuổi bằng nước cất vô trùng, lọc qua giấy lọc, điều chỉnh mật độ đạt $10^5 - 10^6\text{ bào tử/mL}$.
   • Hút $20\ \mu\text{L}$ dịch bào tử tra vào các ống nghiệm chứa môi trường PDA lỏng đã bổ sung chế phẩm nano ở các nồng độ:
     • Nano bạc: 10, 20, 30, 40, 50 ppm.
     • Nano đồng: 10, 20, 30, 40, 50 ppm.
     • Nano bạc – đồng: 20, 25, 30, 35, 40 ppm.
     • Đối chứng âm (ĐC-): 0 ppm.
   • Thí nghiệm lặp lại 3 lần (10 đĩa/lần lặp). Quan sát sự nảy mầm dưới kính hiển vi tại các thời điểm 12, 24 và 48 giờ.
   • Tỷ lệ ức chế nảy mầm ($H_2%$) tính theo công thức: $$H_2 (%) = \frac{T - G}{T} \times 100$$ (Trong đó: $T$ là tổng số bào tử nảy mầm ở công thức đối chứng; $G$ là tổng số bào tử nảy mầm ở công thức thí nghiệm).

3. Phương pháp đánh giá hiệu quả phòng trị bệnh trên quả cam in vivo:

   • Chọn 90 quả cam đồng đều về kích thước, màu sắc và độ chín thu hoạch. Rửa sạch, khử trùng bề mặt bằng cồn $70^\circ$, tráng nước cất vô trùng.
   • Dùng dao y tế vô trùng tạo 3 vết thương/quả, lây nhiễm nhân tạo $10\ \mu\text{L}$ dịch huyền phù P. nicotianae ($10^5\text{ tế bào/mL}$) vào mỗi vết thương, để khô tự nhiên 2 giờ.
   • Phun chế phẩm nano bạc – đồng ở các nồng độ 0 ppm, 40 ppm, 60 ppm, 80 ppm và đối chứng Ridomil Gold 68WG 0,3%. Phun lặp lại lần 2 sau 2 giờ.
   • Theo dõi ở nhiệt độ phòng trong 7 ngày, tính tỷ lệ nhiễm bệnh ($TLN%$): $$TLN (%) = \frac{\text{Tổng số vết thương phát triển nấm bệnh}}{\text{Tổng số vết thương nhân tạo mỗi công thức}} \times 100$$

---

Nội dung chính theo từng chương

PHẦN I: MỞ ĐẦU

Chương này nêu rõ tầm quan trọng kinh tế - xã hội của cây cam tại Việt Nam và các quốc gia trên thế giới. Tác giả chỉ ra áp lực sâu bệnh hại nhiệt đới, đặc biệt là nấm Phytophthora nicotianae gây bệnh thối nhũn, chảy gôm, làm thối rụng quả sau thu hoạch. Phân tích sự cần thiết phải tìm kiếm giải pháp thay thế hóa chất BVTV độc hại bằng công nghệ nano sinh học. Xác lập mục tiêu khoa học, đối tượng, thời gian (09/2020 – 02/2021) và 7 nội dung nghiên cứu cụ thể.

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Trình bày tổng quan nguồn gốc thực vật học của cây cam (Citrus sinensis), tình hình sản xuất và tiêu thụ cam toàn cầu (sản lượng thế giới năm 2000 đạt 85 triệu tấn theo FAO) và các bệnh phổ biến trên cây có múi (bệnh do sâu hại, bệnh loét do Xanthomonas axonopodis pv. citri, bệnh vàng lá Greening do Candidatus Liberibacter spp., bệnh sẹo do Elsinoe fawcetti, thán thư do Colletotrichum gloeosporioides). Trình bày chi tiết đặc điểm phân loại, hình thái, vòng đời và triệu chứng gây hại của nấm P. nicotianae. Khái quát cơ sở khoa học của công nghệ nano (hiệu ứng bề mặt, kích thước tới hạn, tính chất lượng tử), cơ chế kháng khuẩn của nano bạc, nano đồng và tổng hợp tình hình nghiên cứu ứng dụng nano trong bảo vệ thực vật trên thế giới và tại Việt Nam.

PHẦN III: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Mô tả chi tiết các trang thiết bị (nồi hấp khử trùng, box cấy vi sinh, máy đo pH, kính hiển vi quang học, micropipette...), nguồn nấm thuần chủng từ Trung tâm Bệnh cây nhiệt đới, dung dịch nano bạc, đồng, bạc – đồng 1000 ppm, môi trường PDA và thuốc Ridomil Gold 68WG. Chi tiết hóa quy trình bố trí thí nghiệm in vitro đánh giá đường kính tản nấm (sau 1, 3, 5, 7 ngày), đếm tỷ lệ nảy mầm bào tử (sau 12, 24, 48 giờ) và quy trình lây nhiễm nhân tạo in vivo trên 90 quả cam theo dõi trong 7 ngày cùng các công thức tính toán chỉ tiêu toán học.

PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Trình bày toàn bộ số liệu thực nghiệm thu được từ 7 nội dung nghiên cứu:

• Ức chế tản nấm in vitro: Nano bạc đạt hiệu lực ức chế 100% ở nồng độ 100 ppm sau 7 ngày nuôi cấy; nano đồng đạt hiệu lực 100% ở nồng độ 50 ppm; nano bạc – đồng đạt hiệu lực 100% ở nồng độ 40 ppm. Ở các nồng độ thấp hơn, tản nấm vẫn phát triển nhưng bị kìm hãm so với đối chứng âm (đối chứng âm sợi nấm mọc kín mặt đĩa sau 7 ngày).
• Ức chế nảy mầm bào tử in vitro: Nano bạc ở 50 ppm, nano đồng ở 50 ppm và nano bạc – đồng ở 40 ppm ức chế hoàn toàn (100%) sự nảy mầm của bào tử sau 48 giờ theo dõi.
• Thử nghiệm in vivo trên quả cam: Phun chế phẩm nano bạc – đồng ở nồng độ từ 40 ppm giúp ngăn chặn hiệu quả sự hình thành và lan rộng của vết thối nhũn trên vỏ quả cam lây nhiễm nấm nhân tạo sau 7 ngày theo dõi, cho hiệu quả tương đương và ổn định hơn so với thuốc đối chứng Ridomil Gold 68WG.

PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Tổng kết các ngưỡng nồng độ tối ưu của ba loại nano đối với tản nấm và bào tử nấm P. nicotianae. Đưa ra kiến nghị về việc áp dụng chế phẩm nano trong quy trình xử lý, bảo quản quả cam sau thu hoạch nhằm nâng cao giá trị thương phẩm và tính an toàn sinh học.

---

Kết quả và đóng góp

1. Số liệu thực nghiệm chính

Bảng tổng hợp hiệu lực ức chế tản nấm Phytophthora nicotianae (in vitro sau 7 ngày)

Loại chế phẩm Nano	Nồng độ khảo sát (ppm)	Hiệu lực ức chế sau 7 ngày ($H_1%$)	Nhận xét trạng thái khuẩn lạc
Đối chứng âm (ĐC-)	0 ppm	0,00%	Sợi nấm trắng mọc lan kín toàn bộ bề mặt đĩa petri
Đối chứng dương (ĐC+)	Ridomil Gold 68WG	100,00%	Không có sự phát triển của khuẩn lạc nấm
Nano Bạc (AgNPs)	20 ppm 40 ppm 60 ppm 80 ppm 100 ppm	25,33% 75,24% 75,00% Đường kính giảm mạnh 100,00%	Ở nồng độ 100 ppm ức chế hoàn toàn tản nấm sau 7 ngày theo dõi
Nano Đồng (CuNPs)	10 ppm 20 ppm 30 ppm 40 ppm 50 ppm	Thấp nhất 65,46% 47,52% – 85,00% 69,76% 100,00%	Ở nồng độ 50 ppm ức chế hoàn toàn sự phát triển của tản nấm
Nano Bạc – Đồng	20 ppm 25 ppm 30 ppm 35 ppm 40 ppm	34,58% – 82,00% 25,00% – 42,11% Kìm hãm mạnh 45,89% 100,00%	Nồng độ tối ưu 40 ppm đạt hiệu lực ức chế tuyệt đối (100%)

Bảng tổng hợp hiệu lực ức chế sự nảy mầm bào tử P. nicotianae (in vitro)

Chế phẩm Nano	Nồng độ tối ưu (ppm)	Tỷ lệ nảy mầm sau 12h	Tỷ lệ nảy mầm sau 24h	Tỷ lệ nảy mầm sau 48h	Hiệu lực ức chế sau 48h ($H_2%$)
Nano Bạc	50 ppm	0%	0%	0%	100,00%
Nano Đồng	50 ppm	0%	0%	0%	100,00%
Nano Bạc – Đồng	40 ppm	0%	0%	0%	100,00%
Đối chứng âm (0 ppm)	0 ppm	100% nảy mầm	100% nảy mầm	100% nảy mầm	0,00%

2. Giải pháp và kiến nghị của tác giả

• Ứng dụng chế phẩm nano bạc (100 ppm), nano đồng (50 ppm) và đặc biệt là phức hợp nano bạc – đồng ở nồng độ thấp (40 ppm) trong việc khử trùng bề mặt, ức chế nguồn nấm bệnh P. nicotianae trên quả cam sau khi thu hoạch.
• Sử dụng phương pháp phun xử lý 2 lần liên tiếp để tạo lớp màng bảo vệ nano trên vỏ quả trước khi lưu kho hoặc đưa vào chuỗi phân phối.

3. Đóng góp khoa học so với các nghiên cứu trước

• Tác giả đã xác định chính xác ngưỡng nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và ức chế hoàn toàn (100%) của ba dạng chế phẩm nano đối với cả hai thể sinh trưởng của nấm P. nicotianae (dạng sợi tản nấm và dạng bào tử sinh sản).
• Chứng minh rõ nét hiệu ứng hiệp đồng vượt trội của dạng phối hợp nano bạc – đồng: chế phẩm bạc – đồng chỉ cần nồng độ 40 ppm để đạt hiệu lực diệt nấm 100%, thấp hơn đáng kể so với khi sử dụng nano bạc đơn lẻ (100 ppm) hay nano đồng đơn lẻ (50 ppm), giúp giảm chi phí nguyên liệu và tăng độ an toàn sinh học.
• Đánh giá trực tiếp hiệu quả phòng bệnh in vivo trên quả cam tươi bằng phương pháp gây nhiễm nhân tạo mô phỏng điều kiện thực tế bảo quản.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế của đề tài:

  • Thử nghiệm in vivo mới dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm (90 quả cam lây nhiễm nhân tạo trong thời gian theo dõi 7 ngày ở điều kiện nhiệt độ phòng), chưa khảo sát trên các quy mô kho bảo quản lạnh thương mại hoặc thời gian lưu trữ kéo dài (1–3 tháng).
  • Chưa tiến hành phân tích định lượng phổ hấp thu nguyên tử (AAS/ICP-MS) để đánh giá mức độ tồn dư, thẩm thấu của các ion bạc và đồng vào các lớp mô bên trong (cùi trắng, múi cam, dịch quả) theo thời gian.
  • Chưa đánh giá ảnh hưởng của chế phẩm nano lên các chỉ tiêu chất lượng cảm quan và hóa sinh của quả cam trong quá trình bảo quản (hàm lượng đường tổng số, độ acid chuẩn độ, hàm lượng vitamin C, tỷ lệ giảm khối lượng tự nhiên).

• Hướng nghiên cứu tiếp theo:

  • Mở rộng thử nghiệm xử lý bảo quản quả cam quy mô bán công nghiệp trong điều kiện bảo quản mát kết hợp bao gói màng sinh học.
  • Nghiên cứu hoàn thiện công thức phối chế nano có bổ sung chất bám dính sinh học (như chitosan, alginate) nhằm tăng thời gian lưu giữ hoạt tính trên bề mặt vỏ quả.
  • Đánh giá chi tiết độc tính tế bào và động học phân hủy/tồn dư kim loại trên nông sản phục vụ cấp phép ứng dụng nông nghiệp hữu cơ.

---

Giá trị tham khảo

• Đối tượng thụ hưởng:
  • Sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu sinh thuộc các chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Nông nghiệp, Bảo vệ Thực vật, Khoa học Cây trồng, Công nghệ Sau thu hoạch, và Công nghệ Vật liệu Nano.
  • Các kỹ sư, cán bộ kỹ thuật tại các viện nghiên cứu cây ăn quả, trung tâm khuyến nông và các cơ sở sản xuất chế phẩm sinh học phục vụ nông nghiệp sạch.
• Nội dung có giá trị tham khảo cao:
  • Quy trình thực nghiệm chuẩn để thử nghiệm hoạt tính kháng nấm in vitro (đo đường kính tản nấm trên môi trường PDA đặc và đếm tỷ lệ nảy mầm bào tử trên môi trường lỏng).
  • Phương pháp bố trí thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo in vivo trên quả có múi để sàng lọc hoạt chất bảo quản sau thu hoạch.
  • Số liệu đối sánh cụ thể giữa nano kim loại đơn chất (Ag, Cu) và phức hợp (Ag-Cu) làm cơ sở thiết kế các công thức chế phẩm BVTV thế hệ mới.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Nấm Phytophthora nicotianae gây hại như thế nào trên cây cam và quả cam? Trả lời: Nấm P. nicotianae gây bệnh thối gốc, chảy nhựa, thối rễ trên thân cây và bệnh thối nhũn (thối nâu) trên quả. Bệnh thường tấn công quả già và quả nằm khuất trong tán thiếu ánh sáng vào mùa mưa ẩm. Vết bệnh ban đầu úng nước chuyển màu nâu oliu, mô vỏ mềm nhũn, bốc mùi hôi cay đặc trưng, hình thành lớp tơ nấm trắng bên ngoài và làm rụng quả hàng loạt khi vết thối chiếm 1/3–1/2 diện tích vỏ quả.

2. Nồng độ tối ưu của nano bạc, nano đồng và nano bạc – đồng để ức chế 100% tản nấm in vitro sau 7 ngày là bao nhiêu? Trả lời: Dựa trên số liệu thực nghiệm tại Bảng 4.1, 4.2 và 4.3 trong khóa luận:

• Chế phẩm Nano Bạc đạt hiệu lực ức chế 100% ở nồng độ 100 ppm.
• Chế phẩm Nano Đồng đạt hiệu lực ức chế 100% ở nồng độ 50 ppm.
• Chế phẩm Nano Bạc – Đồng đạt hiệu lực ức chế 100% ở nồng độ 40 ppm.

3. Khả năng ức chế sự nảy mầm bào tử nấm P. nicotianae của các chế phẩm nano diễn ra như thế nào theo thời gian? Trả lời: Tỷ lệ bào tử nảy mầm giảm dần khi nồng độ nano tăng lên. Sau 48 giờ theo dõi, sự nảy mầm của bào tử bị ức chế hoàn toàn (tỷ lệ nảy mầm bằng 0%, hiệu lực ức chế đạt 100%) tại các nồng độ: 50 ppm đối với nano bạc, 50 ppm đối với nano đồng, và 40 ppm đối với nano bạc – đồng.

4. Vì sao chế phẩm phối hợp nano bạc – đồng lại cho hiệu quả tối ưu hơn so với từng loại đơn lẻ? Trả lời: Sự kết hợp giữa nano bạc và nano đồng tạo nên tác động hiệp đồng đa cơ chế: nano bạc tấn công mạnh vào màng tế bào và liên kết với nhóm sulfate enzyme, trong khi nano đồng giải phóng ion tạo gốc tự do phá hủy DNA và liên kết protein carboxyl/amino. Nhờ đó, chế phẩm nano bạc – đồng đạt hiệu lực ức chế tuyệt đối ở nồng độ chỉ 40 ppm (thấp hơn mức 50 ppm của đồng và 100 ppm của bạc), nâng cao hiệu quả kinh tế và an toàn sinh học.

5. Thí nghiệm in vivo trên quả cam được thiết kế và thực hiện theo quy trình nào? Trả lời: Thí nghiệm sử dụng 90 quả cam chín đồng đều, khử trùng bề mặt bằng cồn $70^\circ$, tạo 3 vết thương nhân tạo/quả bằng dao y tế vô trùng, sau đó tra $10\ \mu\text{L}$ huyền phù nấm P. nicotianae ($10^5\text{ tế bào/mL}$) vào mỗi vết thương. Quả được để khô 2 giờ rồi phun chế phẩm nano bạc – đồng (ở các nồng độ 0, 40, 60, 80 ppm) hoặc thuốc Ridomil Gold 68WG 0,3% (phun 2 lần cách nhau 2 giờ) và theo dõi tỷ lệ phát triển bệnh trong vòng 7 ngày ở điều kiện phòng.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Nguyễn Thị Huyên đã chứng minh một cách khoa học và thuyết phục khả năng kháng nấm Phytophthora nicotianae gây bệnh thối nhũn trên quả cam của các chế phẩm nano bạc, nano đồng và nano bạc – đồng trong cả điều kiện in vitro và in vivo. Kết quả chỉ ra rằng chế phẩm nano bạc – đồng ở nồng độ 40 ppm thể hiện hoạt tính kháng nấm cao nhất khi ức chế hoàn toàn (100%) sự phát triển của tản nấm và sự nảy mầm của bào tử sau 48–168 giờ, vượt trội hơn so với sử dụng đơn lẻ từng kim loại. Nghiên cứu cung cấp cơ sở thực nghiệm vững chắc cho việc phát triển các chế phẩm nano sinh học an toàn, thân thiện với môi trường nhằm thay thế thuốc bảo vệ thực vật hóa học trong bảo quản nông sản sau thu hoạch.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Cam có tên khoa học là Citrus sinensis (L.) Osbeck, thuộc họ Cam chanh. Cam là một trong những loại quả có múi phổ biến nhất trên thế giới thuộc loài thực vật thuộc chi cam chanh, thân nhỏ. Quả cam có màu xanh, khi chín chuyển sang màu da cam hoặc vàng. Quả cam có vị ngọt và hơi chua nhẹ, loại trái cây này được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như chế biến thực phẩm, làm thuốc trong Đông y hoặc làm đẹp.

Tuy nhiên trong điều kiện nóng ẩm của nước ta, các vùng trồng cam rất dễ mắc một số bệnh lây từ các loại côn trùng, sâu bệnh hại hay các loài nấm, vi khuẩn. Một số loài sâu bệnh hại thường xuyên được nhắc đến trong việc gây bệnh cho cây cam có thể kể đến như: Sâu vẽ bùa, sâu đục cành, rầy chổng, rệp hại, bọ trưởng thành, ruồi đục quả, nhện đỏ. Đối với mầm bệnh là vi khuẩn, một số loài vi khuẩn hại cam gây thiệt hại cho người trồng cam có thể kể đến như Xanthomonas campestris, Candidatus Liberibacter spp. Ngoài ra các bệnh trên cây cam với nguồn bệnh là nấm như nấm Elsinoe fawcetti gây bệnh sẹo.

Colletotrichum gloeosprioides gây bệnh thán thư, nấm Furarium solani gây bệnh vàng lá thối rễ, gây thiệt hại nặng nề đến năng suất và chất lượng cam. Các nguồn lây bệnh này thường gây các bệnh ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng của quả cam, làm giảm giá trị thương phẩm của quả, gây thiệt hại về kinh tế. Bệnh thối nhũn hay bệnh chảy gôm được cho là một trong số những nguyên nhân gây tổn hại đến năng suất và chất lượng của cây cam. Bệnh thối nhũn trên quả cam do nấm Phytophthora nicotianae gây ra.

Trong nhóm cây có múi bệnh thường gây hại nặng cho trái quýt đường và cam mật. Trên trái cây, bệnh thường gây hại trên trái già và những trái nằm khuất trong tán cây thiếu ánh nắng mặt trời. Nếu ẩm độ không khí cao, trời âm u ít nắng trên vết bệnh sẽ xuất hiện một lớp sợi tơ nấm màu trắng. Nếu bệnh nặng, chỗ bị bệnh chiếm khoảng 1/3 đến 1/2 diện tích vỏ trái, trái sẽ bị rụng (Báo bạn của nhà nông, 1 2020).

Một số biện pháp phòng trừ có thể kể đến đối với bệnh là tỉa cành tạo tán hàng năm sau thu hoạch, khử trùng dụng cụ bằng nước Javel hoặc cồn 900 khi tỉa cành để tránh lây bệnh qua cây khác, đối với vườn thoát nước tốt trong mùa mưa hoặc khi thấy xuất hiện bệnh thối trái, có thể phối một số thuốc sau đây: Mexyl-MZ 72WP + Anlisa 102WP, Alpine 80WG + Tiêu khuẩn. Ngoài ra gần đây vật liệu nano như nano đồng và nano bạc, nano bạc đồng được sử dụng như một chất kháng khuẩn để tiêu diệt mầm bệnh và khử khuẩn hiệu quả. Xuất phát từ thực trạng trên, nano là loại chất kháng khuẩn hiệu quả cao, thân thiện với môi trường và có tác dụng kháng tốt đối với nấm Phytophthora nicotianae. Các nghiên cứu gần đây cho thấy nano bạc có hiệu quả diệt khuẩn cao, lại an toàn đối với con người.

Chính vì thế tôi thực hiện đề tài:“Đánh giá khả năng ức chế nấm Phytophthora nicotianae gây bệnh thối nhũn trên quả cam của chế phẩm nano” 1. Mục đích và yêu cầu 1. Mục đích Xác định được nồng độ nano và thời gian xử lý thích hợp cho việc ức chế nấm Phytophthora nicotianae gây bệnh thối nhũn trên quả cam trong điều kiện in vitro. Xác định được nồng độ nano thích hợp để sử dụng trong bảo quản cam sau khi thu hoạch.

Yêu cầu Đánh giá hiệu lực ức chế bệnh thối nhũn do nấm Phytophthora nicotianae của nano trong điều kiện in vitro. Đánh giá khả năng phòng trị bệnh thối nhũn trên quả cam do nấm Phytophthora nicotianae của chế phẩm nano bằng phương pháp lây nhiễm trực tiếp. 2 PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Giới thiệu về cây cam 2.

Nguồn gốc, phân bố, lịch sử phát hiện và phân loại cam., 1973), (Wakana A Kira, 1998), (Walter Reuther at el, 1978) cho thấy các loại cây ăn quả, cùng với cây nho, cây cam quýt có lịch sử trồng trọt lâu đời nhất. Phần lớn kết quả nghiên cứu đều thống nhất cam quýt có nguồn gốc ở miền Nam châu Á, trải dài từ Ấn Độ qua Himalaya, Trung Quốc xuống vùng quần đảo Philippin, Malaysia, miền Nam Indonecia hoặc kéo đến lục địa châu Úc. Cây cam được biết đến rất lâu khoảng 2200 năm trước công nguyên tại Trung Quốc nhưng một số người lại cho rằng cam có nguồn gốc từ Himlayas (Ấn Độ). Cam được trồng rất phổ biến tại Ấn Độ, sau đó lan rộng về phía Đông đến cả vùng Đông Nam Á.

Vào khoảng thế kỷ III trước Công nguyên, cam được đưa vào Châu Âu và nó lan ra đến cả vùng Địa Trung Hải. Sau đó cây cam được Columbos mang đến Châu Mỹ. Những năm sau đó những người làm vườn tại Châu Âu và Châu Mỹ mang cam đến Châu Úc và Châu Phi, ngày nay cây cam được trồng phổ biến ở rất nhiều nơi trên thế giới (Ngô Lâm Tuấn Anh, 2013). Cam đã trở thành loại trái cây được trồng phổ biến nhất trên thế giới.

Nó là một loại cây trồng quan trọng ở Biển Đông, các nước Nam Phi, Úc, khắp khu vực Địa Trung Hải, và các khu vực cận nhiệt đới của Nam Mỹ và Caribe. Hoa Kỳ dẫn đầu về sản lượng thế giới, chỉ tính riêng Florida, đạt sản lượng hàng năm hơn 200 triệu hộp xuất khẩu hàng năm. Các nhà sản xuất lớn khác là Brazil, Tây Ban Nha, Nhật Bản, Mexico, Ý, Ấn Độ, Argentina và Ai Cập. Ở Brazil, cam được trồng khắp nơi ở đồng bằng ven biển và cao nguyên nhưng nhiều nhất là ở các bang Sao Paulo và Rio de Janeiro, nơi văn hóa cam tăng mạnh trong những năm ngay sau Thế chiến thứ hai và vẫn đang tiếp tục phát triển.

Trong các nghiên cứu nhằm mục đích nghiên cứu thị phần cam trên thị trường nước ngoài và các yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến nhu cầu bên ngoài của cam cho 3 thấy cam là một trong những loại cây xuất khẩu quan trọng trên thế giới. Theo thống kê của FAO, năm 2000 tổng sản lượng cam quýt trên thế giới là 85 triệu tấn và phần tiêu thụ khoảng 79,3 triệu tấn, tăng trưởng hàng năm 2,85%. Tiêu thụ sẽ tăng lên ở các nước đang phát triển và giảm ở các nước phát triển. Dự báo trong những năm của thập kỷ 2000 mức tiêu thụ quả có múi của thị trường thế giới tăng khoảng 20 triệu tấn.

Các nước xuất khẩu cam quýt chủ yếu đó là: Tây Ban Nha, Israel, Maroc, Italia. Các giống cam quýt trên thị trường được ưa chuộng là: Washington, Navel, Valenxia Late của Maroc, Samouti của Isarel, Maltaises của Tunisia, và các giống quýt Địa trung hải như: Clemention, quýt Đỏ Danxy và Unshiu được rất nhiều người ưa chuộng (Nguyễn Thị Ngân, 2008). Một số bệnh về cam phổ biến Có nhiều cách để phân loại bệnh về cam hay cây có múi và một cách phân loại thường được sử dụng là phân loại theo nguồn lây nhiễm bệnh với 3 tác nhân chính là bệnh do sâu hại, bệnh do vi khuẩn và bệnh do nấm. Bệnh do vi khuẩn Bệnh loét vi khuẩn trên cây cam, bệnh do vi khuẩn Xanthomonas axonopodis pv.citri (tên cũ là Xanthomonas campestris pv.citri) gây hại.

Vi khuẩn có thể xâm nhiễm qua vết thương hay khí khổng ở các bộ phận của cây. Lá, cành non, trái thường bị nhiễm qua khí khổng khi có sương hay mưa làm ướt vết bệnh, vi khuẩn trong vết bệnh sẽ ứa ra và từ đó gió, nước mưa, côn trùng (sâu vẽ bùa) sẽ làm lây lan bệnh. Trong các lá bệnh rơi rụng, vi khuẩn có thể tồn tại đến 6 tháng và là nguồn bệnh lây lan quan trọng. Các vườn trồng dày, thiếu chăm sóc hoặc các vườn ươm cây con; bón nhiều phân đạm là điều kiện tốt cho bệnh phát triển.

Bệnh vàng lá greening hay còn gọi là bệnh vàng lá gân xanh là bệnh phổ biến của các loài thực vật thuộc chi Cam chanh do vi khuẩn Gram-âm chưa rõ đặc tính Candidatus Liberibacter spp. tấn công mạch dẫn của cây, lây lan qua mắt ghép. Biểu hiện đầu tiên là trái có quầng đỏ từ dưới đít trái lên trên đến 4 khoảng nửa trái thì rụng, khi bổ ra sẽ thấy tâm lệch qua một bên và hạt bị thối. Bệnh vàng lá do cây thiếu kẽm thì lá và gân chuyển màu vàng, biểu hiện đồng loạt trên tất cả các cây hay ở một hướng hoặc một thửa nào đó trong vườn, triệu chứng giống nhau, không có nhánh bị nặng hay nhẹ.

Mức độ diễn biến rất chậm, có thể kéo dài trong nhiều năm sau cây mới chết tuỳ theo điều kiện chăm sóc (Trần Thị Hoài Thương, 2016). Bệnh do sâu hại (Lê Hòa, 2019) Sâu vẽ bùa: Sâu đục dưới lớp biểu bì lá thành những đường ngoằn ngoèo. Sự phá hại của sâu làm cho lá co cúm, quăn queo, hạn chế quang hợp. Ngoài ra, các vết thương do sâu to nên trên lá, chồi tạo điều kiện cho bệnh loét phát triển.

Sâu vẽ bùa gây hại kéo theo theo vi khuẩn Xanhthomonas citri xâm nhiễm qua đường sâu đục, làm lá nhanh rụng. Rầy chổng cánh: Rầy non và rầy trưởng thành chủ yếu sống ở cánh lá non. Rầy chích hút dịch cây, làm héo và rụng lá non. Nhiệt độ 18 – 25oC (mùa xuân và mùa thu) rầy phát triển mạnh.

Ấu và thành trùng chích hút dinh dưỡng lá, đọt non làm phiến lá nhỏ và xoăn, đọt non lụi dần, sần sùi. Chất thải của rầy thu hút nấm bồ hóng ảnh hưởng đến quang hợp. Ngoài tác hại trực tiếp, rầy chổng cánh còn là môi giới truyền bệnh vàng lá greening, bệnh nguy hiểm nhất hiện nay trên cam. Rệp hại: Từ đầu mùa xuân, khi lộc non của cam bắt đầu phát triển thì rệp cái có cánh từ nơi cư trú bay đến đẻ ra rệp non.

Những rệp non phát triển trong 7 -10 ngày thì đa số trở thành rệp cái dạng không cánh. Dạng này có sức sinh sản rất mạnh, mỗi con 1 ngày đêm có thể đẻ được 20 -25 rệp non do đó mà tập đoàn rệp phát triển rất nhanh. Chúng ít di động, chỉ tập trung ở ngọn non, chích hút dịch cây, làm lá và chồi non cong queo. Rệp lan sang cây khác nhờ kiến.

Ngoài gây hại trực tiếp, rệp cam còn là môi giới truyền bệnh Tristcza virus, chất bài tiết của rệp cũng là môi trường thích hợp cho nấm đen phát triển, gây hại cho cây. 5 Sâu đục cành: Bọ trưởng thành xuất hiện từ cuối tháng 4 đến giữa tháng 7 phần nhiều vào buổi sáng. Con cái đẻ trứng vào nách lá, trên trứng có lớp sáp bảo vệ, sâu non nở ra gặm vỏ cành để sống.