Nghiên cứu chế phẩm enzyme chitinase từ Trichoderma sp để phòng trừ nấm hại trên cây cà chua

Tài liệu nghiên cứu Luận văn nghiên cứu tạo chế phẩm enzyme chitinase thô từ chủng trichoderma sp phòng trừ vi nấm gây, tổng hợp lý thuyết và thực hành, cung cấp kiến thức chuyên

• Tác giả: Phạm Thị Lịch
• Người hướng dẫn: TS. Trần Thanh Thủy
• Trường học: Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Sinh học
• Đề tài: Chế phẩm enzyme chitinase từ Trichoderma sp: Giải pháp phòng trừ nấm hại cây cà chua
• Loại tài liệu: Luận văn
• Năm xuất bản: 2013
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CÁM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• Lí do chọn đề tài
• Đối tượng nghiên cứu
• Ý nghĩa của đề tài
• Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Nấm Trichoderma spp.
• 1.2. Vị trí phân loại
• 1.3. Đặc điểm sinh học
• 1.4. Cấu trúc của Trichoderma spp.
• 1.5. Các cơ chế đối kháng của Trichoderma với nấm gây bệnh cây trồng
• 1.6. Vai trò - tiềm năng ứng dụng của Trichoderma spp.
• 1.7. Chitin và hệ enzyme chitinase
• 1.8. Định nghĩa - Phân loại enzyme chitinase
• 1.9. Đặc tính cơ bản của hệ enzyme chitinase
• 1.10. Nguồn thu nhận enzyme chitinase từ vi nấm
• 1.11. Các phương pháp nuôi cấy NS thu nhận enzyme chitinase
• 1.12. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chitinase của Trichoderma spp.
• 1.13. Tình hình nghiên cứu và sử dụng chế phẩm enzyme chitinase
• 1.14. Vi nấm gây hại trên cà chua
• 1.15. Đặc điểm sinh thái cây cà chua
• 1.16. Các tác nhân vi nấm gây hại chủ yếu trên cây cà chua (giai đoạn cây con)
• 1.17. Biện pháp phòng trừ vi nấm trên cây cà chua
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Hóa chất - Nguyên liệu
• 2.3. Thiết bị và dụng cụ
• 2.4. Các MT nghiên cứu đã sử dụng
• 2.5. Phương pháp nghiên cứu
• 2.6. Xác định họat tính sinh enzyme ngoại bào của NS bằng phương pháp khuếch tán trên MT thạch
• 2.7. Phương pháp bảo quản mẫu bằng dầu khoáng
• 2.8. Phương pháp quan sát hình thái NS
• 2.9. Xác định hàm lượng glucosamine theo phương pháp so màu với thuốc thử DNS
• 2.10. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme chitinase
• 2.11. Phương pháp nuôi cấy NS thu nhận chitinase trên MT bán rắn
• 2.12. Phương pháp tách chiết dịch và thu nhận chế phẩm enzyme thô từ MT nuôi cấy
• 2.13. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của tác nhân tủa đến hoạt độ enzyme chitinase của CPE
• 2.14. Phương pháp thẩm tích CPE bằng màng cellophane
• 2.15. Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và hoạt độ chitinase của NS
• 2.16. Phương pháp nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến các đặc tính lí hóa của CPE chitinase
• 2.17. Phương pháp khảo sát khả năng kìm hãm sự tăng sinh khối vi nấm gây bệnh bởi CPE chitinase và các tác nhân kháng nấm khác
• 2.18. Phương pháp khảo sát khả năng làm giảm độ nảy mầm của BT vi nấm gây bệnh cây trồng bởi CPE và các tác nhân kháng nấm khác
• 2.19. Gây nhiễm nấm bệnh vào cây cà chua bằng phương pháp nhân tạo [6]
• 2.20. Xác định mật độ BT bằng phương pháp đếm KL [19]
• 2.21. Xác định mật độ BT bằng phương pháp đo mật độ quang [14]
• 2.22. Phương pháp xử lí CPE chitinase từ Trichoderma sp. phòng vi nấm gây hại trên cây cà chua
• 2.23. Phương pháp xử lí số liệu thống kê
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
• 3.1. Kết quả tuyển chọn chủng Trichoderma có hoạt độ chitinase cao
• 3.2. Ảnh hưởng của MT và các điều kiện nuôi cấy đến hoạt độ chitinase của chủng Trichoderma BL2
• 3.3. Ảnh hưởng của MT lên men bán rắn
• 3.4. Ảnh hưởng của nguồn cơ chất cảm ứng
• 3.5. Ảnh hưởng nồng độ cơ chất cảm ứng
• 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ MT nuôi cấy
• 3.7. Ảnh hưởng pH ban đầu của MT nuôi cấy
• 3.8. Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu của MT nuôi cấy
• 3.9. Động thái quá trình sinh tổng hợp chitinase của chủng Trichoderma BL2
• 3.10. Chiết tách dịch enzyme và thu nhận CPE chitinase thô từ chủng Trichoderma BL2
• 3.11. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các tác nhân tủa đến hoạt tính của CPE
• 3.12. Quy trình thu nhận CPE chitinase thô từ chủng Trichoderma BL2
• 3.13. Ảnh hưởng của các yếu tố lí hóa đến hoạt độ enzyme chitinase của CPE
• 3.14. Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng
• 3.15. Ảnh hưởng của pH phản ứng
• 3.16. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng
• 3.17. Ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ bảo quản đến hoạt độ chitinase của CPE
• 3.18. Kết quả khảo sát khả năng đối kháng của CPE chitinase thô từ chủng Trichoderma BL2 phòng trừ vi nấm gây bệnh cây trồng
• 3.19. Khả năng kìm hãm sự tăng sinh khối vi nấm gây bệnh
• 3.20. Khả năng làm giảm độ nảy mầm của BT vi nấm gây bệnh
• 3.21. Kết quả việc sử dụng của CPE chitinase từ Trichoderma BL2 và các tác nhân kháng nấm khác trong phòng trừ vi nấm gây hại trên cây cà chua
• 3.22. Ở các lô gây nhiễm Phytophthora sp
• 3.23. Ở các lô gây nhiễm Fusarium sp
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• MỞ ĐẦU
• 1.1. Lí do chọn đề tài

Tóm tắt

I. Giới thiệu về enzyme chitinase và Trichoderma sp

Enzyme chitinase là một loại enzyme quan trọng trong việc phân hủy chitin, một thành phần chính của vách tế bào vi nấm. Trichoderma sp là một nhóm nấm đối kháng nổi bật, có khả năng sản sinh enzyme này. Việc sử dụng chế phẩm enzyme chitinase từ Trichoderma sp trong nông nghiệp đã được chứng minh là một biện pháp hiệu quả trong việc phòng trừ nấm hại cây. Nghiên cứu cho thấy enzyme này có khả năng phân hủy vách tế bào của các loài nấm gây bệnh, từ đó giúp bảo vệ cây trồng, đặc biệt là cây cà chua. Theo một nghiên cứu, enzyme chitinase từ Trichoderma có thể làm giảm đáng kể sự phát triển của các nấm gây hại như Fusarium và Phytophthora. Việc ứng dụng enzyme này không chỉ giúp tăng cường sức đề kháng cho cây mà còn giảm thiểu việc sử dụng hóa chất độc hại trong nông nghiệp.

II. Cơ chế phòng trừ nấm hại cây của Trichoderma

Nấm Trichoderma hoạt động theo nhiều cơ chế khác nhau để phòng trừ nấm hại cây. Một trong những cơ chế chính là khả năng tiết ra enzyme chitinase, giúp phân hủy vách tế bào của nấm gây bệnh. Ngoài ra, Trichoderma còn có khả năng cạnh tranh dinh dưỡng và không gian sống với nấm gây bệnh, từ đó làm giảm sự phát triển của chúng. Nghiên cứu cho thấy rằng việc sử dụng chế phẩm enzyme chitinase từ Trichoderma không chỉ giúp tiêu diệt nấm bệnh mà còn kích thích hệ thống miễn dịch của cây, làm tăng khả năng kháng bệnh. Điều này đặc biệt quan trọng trong bối cảnh nông nghiệp bền vững, nơi mà việc sử dụng hóa chất cần được hạn chế. Các thử nghiệm thực địa đã chứng minh rằng cây cà chua được xử lý bằng chế phẩm enzyme này có sức đề kháng cao hơn và năng suất thu hoạch tốt hơn.

III. Ứng dụng thực tiễn của chế phẩm enzyme chitinase

Chế phẩm enzyme chitinase từ Trichoderma sp đã được ứng dụng rộng rãi trong nông nghiệp, đặc biệt trong việc phòng trừ nấm hại cây như Fusarium và Phytophthora. Việc sử dụng chế phẩm này không chỉ giúp bảo vệ cây trồng mà còn góp phần cải thiện chất lượng đất và môi trường sinh thái. Các nghiên cứu cho thấy rằng chế phẩm enzyme này có thể làm giảm đáng kể tỷ lệ nhiễm bệnh trên cây cà chua, từ đó nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm. Hơn nữa, việc áp dụng chế phẩm sinh học này còn giúp nông dân giảm thiểu chi phí thuốc bảo vệ thực vật, đồng thời bảo vệ sức khỏe con người và môi trường. Sự phát triển của công nghệ sinh học trong sản xuất chế phẩm enzyme chitinase từ Trichoderma mở ra nhiều cơ hội mới cho ngành nông nghiệp bền vững.

IV. Kết luận và triển vọng nghiên cứu

Nghiên cứu về chế phẩm enzyme chitinase từ Trichoderma sp đã chỉ ra tiềm năng to lớn trong việc phòng trừ nấm hại cây. Việc ứng dụng enzyme này không chỉ mang lại lợi ích cho cây trồng mà còn góp phần vào sự phát triển bền vững của nông nghiệp. Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình sản xuất chế phẩm enzyme, cũng như đánh giá hiệu quả trong các điều kiện thực tế khác nhau. Sự kết hợp giữa công nghệ sinh học và nông nghiệp hữu cơ sẽ là hướng đi tiềm năng trong việc phát triển các giải pháp phòng trừ sinh học hiệu quả hơn cho cây cà chua và các loại cây trồng khác.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Vi nấm gây bệnh trên cây trồng là một trong những nguyên nhân chính làm giảm năng suất và chất lượng nông sản, đặc biệt là cây cà chua – loại cây trồng có giá trị kinh tế cao và được trồng phổ biến tại Việt Nam. Theo báo cáo của ngành Bảo vệ Thực vật Lâm Đồng năm 2012, bệnh xoăn lá trên cà chua đã nhiễm trên diện tích gần 600 ha với tỷ lệ hại từ 2,9% đến 20%. Bệnh mốc sương và đốm lá vi khuẩn cũng có mức độ lây lan đáng kể, gây thiệt hại nghiêm trọng cho sản xuất. Việc phòng trừ vi nấm gây hại hiện nay vẫn còn nhiều khó khăn do vi nấm tồn tại lâu dài trong đất và có khả năng kháng thuốc hóa học.

Trong bối cảnh đó, biện pháp sinh học sử dụng vi sinh vật đối kháng như nấm Trichoderma spp. được xem là giải pháp thân thiện, an toàn và hiệu quả. Trichoderma spp. có khả năng ức chế vi nấm gây bệnh qua nhiều cơ chế như kí sinh, cạnh tranh dinh dưỡng, tiết kháng sinh và enzyme ngoại bào, đặc biệt là enzyme chitinase – enzyme phân hủy thành phần chitin trong vách tế bào vi nấm gây bệnh. Nghiên cứu này nhằm tạo chế phẩm enzyme chitinase thô từ chủng Trichoderma sp. để phòng trừ vi nấm gây hại trên cây cà chua, góp phần phát triển nông nghiệp bền vững.

Mục tiêu cụ thể của nghiên cứu bao gồm tuyển chọn chủng Trichoderma có hoạt độ chitinase cao, khảo sát điều kiện nuôi cấy tối ưu để sinh tổng hợp enzyme, thu nhận và tạo chế phẩm enzyme chitinase thô, đánh giá đặc tính lí hóa của chế phẩm và thử nghiệm khả năng phòng trừ vi nấm gây bệnh trên cây cà chua trong điều kiện thực nghiệm. Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 12/2012 đến tháng 8/2013 tại phòng Vi sinh – Sinh hóa, Trường Đại học Sư phạm TP. Hồ Chí Minh. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa khoa học trong việc hiểu rõ cơ chế đối kháng của Trichoderma và ứng dụng thực tiễn trong sản xuất chế phẩm sinh học bảo vệ cây trồng.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nấm Trichoderma spp. thuộc giới Fungi, ngành Ascomycota, họ Hypocreaceae, là nhóm vi nấm phổ biến trong đất với khả năng sinh trưởng ở pH từ 2,5 đến 8 và nhiệt độ tối ưu 25 – 30°C. Trichoderma có nhiều cơ chế đối kháng vi nấm gây bệnh như kí sinh, cạnh tranh dinh dưỡng, tiết kháng sinh và enzyme ngoại bào. Trong đó, enzyme chitinase đóng vai trò quan trọng trong việc phân hủy vách tế bào chứa chitin của vi nấm gây bệnh.

Chitinase là enzyme thủy phân chitin thành các oligomer glucosamine, thuộc nhóm hydrolase, được phân loại dựa trên cơ chế phân cắt (endochitinase, chitobiosidase, exochitinase) và cấu trúc phân tử (họ Glycohydrolase 18, 19, 20). Enzyme này có trọng lượng phân tử dao động từ 30 đến 120 kDa, hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 40°C và pH từ 4 đến 9 tùy nguồn gốc. Chitinase được tổng hợp cảm ứng bởi chitin hoặc các cơ chất liên quan trong môi trường nuôi cấy.

Trong nông nghiệp, enzyme chitinase từ Trichoderma được ứng dụng để phòng trừ các vi nấm gây bệnh như Fusarium, Phytophthora, Botrytis thông qua cơ chế phân hủy vách tế bào nấm bệnh, kích thích cơ chế tự bảo vệ và tăng trưởng của cây trồng. Việc phối hợp enzyme chitinase với các vi khuẩn kháng nấm hoặc các chế phẩm sinh học khác tạo hiệu quả phòng trừ cao hơn.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu nghiên cứu bao gồm các chủng nấm Trichoderma spp. nhận từ Viện Sinh học Nhiệt đới và phòng thí nghiệm Vi sinh – Sinh hóa Trường Đại học Sư phạm TP. Hồ Chí Minh, cùng các chủng Fusarium sp. và Phytophthora sp. từ các viện nghiên cứu chuyên ngành. Các môi trường nuôi cấy được chuẩn bị theo công thức đã được hiệu chỉnh để tối ưu hóa sinh tổng hợp enzyme chitinase.

Phương pháp nghiên cứu chính là nuôi cấy Trichoderma trên môi trường bán rắn chứa chitin và các nguồn dinh dưỡng bổ sung, thu nhận dịch enzyme thô bằng cách chiết xuất nước, lọc và kết tủa enzyme bằng các tác nhân như ethanol, aceton, sulfat amon. Hoạt độ enzyme chitinase được xác định bằng phương pháp định lượng glucosamine qua phản ứng so màu với thuốc thử DNS, đo mật độ quang ở bước sóng 535 nm.

Nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố môi trường như thành phần môi trường, nguồn cơ chất cảm ứng, nồng độ cơ chất, nhiệt độ, pH và độ ẩm đến hoạt độ enzyme chitinase. Thí nghiệm được lặp lại ít nhất 3 lần, dữ liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm Statgraphics plus và Microsoft Excel.

Khả năng phòng trừ vi nấm gây bệnh trên cây cà chua được đánh giá qua các thí nghiệm in vitro và in vivo, bao gồm khảo sát khả năng kìm hãm sinh khối vi nấm Fusarium sp., Phytophthora sp. và khả năng làm giảm độ nảy mầm bào tử vi nấm gây bệnh. Thí nghiệm gây nhiễm nhân tạo trên cây cà chua con trong điều kiện nhà kính được thực hiện để đánh giá hiệu quả phòng trừ của chế phẩm enzyme chitinase thô.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Tuyển chọn chủng Trichoderma có hoạt độ chitinase cao: Trong 4 chủng khảo sát, Trichoderma BL2 có hoạt độ chitinase cao nhất với giá trị 15,578 ± 0,089 UI/ml và đường kính vòng phân giải chitin 6,1 ± 0,31 cm, vượt trội so với các chủng BL1, BL3 và BL4.

2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy: Trên 3 môi trường bán rắn MT7, MT8 và MT9, chủng BL2 sinh tổng hợp enzyme chitinase với hoạt độ cao nhất trên MT9 (20,609 ± 0,118 UI/ml sau 72 giờ), trong khi MT7 có hoạt độ thấp nhất (9,320 ± 0,177 UI/ml sau 24 giờ). Hoạt độ enzyme tăng nhanh trong 24-72 giờ, sau đó giảm dần đến 168 giờ.

3. Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường: Nhiệt độ nuôi cấy tối ưu là 30-35°C, pH ban đầu của môi trường thích hợp trong khoảng 5-6, độ ẩm môi trường nuôi cấy khoảng 55-65% giúp tăng hoạt độ enzyme chitinase. Nồng độ chitin huyền phù 1-1,5% là mức tối ưu để cảm ứng enzyme.

4. Khả năng phòng trừ vi nấm gây bệnh: Chế phẩm enzyme chitinase thô từ Trichoderma BL2 có khả năng kìm hãm sinh khối vi nấm Fusarium sp. và Phytophthora sp. với hiệu quả tương đương hoặc vượt trội so với các chế phẩm sinh học và thuốc hóa học thông dụng. Khả năng làm giảm độ nảy mầm bào tử vi nấm cũng đạt trên 70% trong các thí nghiệm in vitro.

Thảo luận kết quả

Kết quả tuyển chọn chủng BL2 phù hợp với các nghiên cứu trước đây cho thấy sự đa dạng về khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase giữa các chủng Trichoderma. Môi trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng và có bổ sung chitin giúp tăng cường sinh tổng hợp enzyme, phù hợp với cơ chế cảm ứng enzyme chitinase.

Sự tăng hoạt độ enzyme trong giai đoạn đầu nuôi cấy phản ánh quá trình thích nghi và tổng hợp enzyme để phân giải chitin làm nguồn dinh dưỡng. Sự giảm hoạt độ sau thời gian dài có thể do sự tiêu hao cơ chất hoặc sự phân hủy enzyme. Các điều kiện pH, nhiệt độ và độ ẩm tối ưu phù hợp với đặc tính sinh học của Trichoderma và enzyme chitinase, đồng thời tương thích với điều kiện môi trường canh tác cà chua.

Khả năng phòng trừ vi nấm gây bệnh của chế phẩm enzyme chitinase thô được củng cố bởi cơ chế phân hủy vách tế bào chứa chitin, làm giảm sinh trưởng và nảy mầm của vi nấm gây bệnh. So sánh với các chế phẩm sinh học khác và thuốc hóa học, chế phẩm enzyme chitinase thể hiện ưu điểm về tính an toàn, thân thiện môi trường và hiệu quả bền vững.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ hoạt độ enzyme theo thời gian nuôi cấy trên các môi trường khác nhau, bảng so sánh hiệu quả kìm hãm sinh khối vi nấm giữa các chế phẩm và biểu đồ tỷ lệ giảm độ nảy mầm bào tử vi nấm.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Phát triển quy trình sản xuất chế phẩm enzyme chitinase thô: Áp dụng môi trường nuôi cấy bán rắn giàu dinh dưỡng (MT9) với nồng độ chitin huyền phù 1-1,5%, nhiệt độ 30-35°C, pH 5-6 và độ ẩm 55-65% để tối ưu hóa hoạt độ enzyme trong vòng 72 giờ. Chủ thể thực hiện: các cơ sở nghiên cứu và doanh nghiệp sản xuất chế phẩm sinh học. Thời gian: 6-12 tháng.

2. Ứng dụng chế phẩm enzyme chitinase trong phòng trừ vi nấm gây bệnh cà chua: Sử dụng chế phẩm enzyme chitinase thô phối hợp với các chế phẩm sinh học khác hoặc thuốc hóa học giảm liều để tăng hiệu quả phòng trừ và giảm thiểu tác động môi trường. Chủ thể thực hiện: nông dân, doanh nghiệp sản xuất nông nghiệp. Thời gian: vụ mùa tiếp theo.

3. Nâng cao nhận thức và đào tạo kỹ thuật sử dụng chế phẩm sinh học: Tổ chức các khóa tập huấn, hội thảo cho cán bộ kỹ thuật và nông dân về lợi ích, cách sử dụng và bảo quản chế phẩm enzyme chitinase. Chủ thể thực hiện: các viện nghiên cứu, trung tâm khuyến nông. Thời gian: liên tục hàng năm.

4. Mở rộng nghiên cứu và phát triển các chế phẩm enzyme chitinase từ các chủng Trichoderma khác: Khảo sát đa dạng chủng, cải tiến công nghệ thu nhận enzyme tinh khiết, đánh giá hiệu quả trên nhiều loại cây trồng khác nhau. Chủ thể thực hiện: các tổ chức nghiên cứu khoa học. Thời gian: 2-3 năm.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành nông học, vi sinh vật: Nghiên cứu cơ chế đối kháng của Trichoderma, kỹ thuật nuôi cấy và thu nhận enzyme chitinase, ứng dụng trong bảo vệ thực vật.

2. Doanh nghiệp sản xuất chế phẩm sinh học: Áp dụng quy trình sản xuất chế phẩm enzyme chitinase thô, phát triển sản phẩm mới thân thiện môi trường.

3. Nông dân và cán bộ kỹ thuật nông nghiệp: Hiểu rõ về biện pháp sinh học phòng trừ vi nấm gây bệnh cà chua, cách sử dụng chế phẩm enzyme chitinase hiệu quả.

4. Cơ quan quản lý và hoạch định chính sách nông nghiệp: Đánh giá tiềm năng và thúc đẩy ứng dụng công nghệ sinh học trong sản xuất nông nghiệp bền vững, giảm thiểu sử dụng thuốc hóa học.

Câu hỏi thường gặp

1. Enzyme chitinase là gì và vai trò của nó trong phòng trừ vi nấm?
   Enzyme chitinase là enzyme thủy phân chitin – thành phần chính của vách tế bào vi nấm gây bệnh. Nó phân hủy vách tế bào, làm giảm khả năng sinh trưởng và phát triển của vi nấm, từ đó giúp phòng trừ bệnh trên cây trồng.

2. Tại sao chọn Trichoderma spp. để sản xuất enzyme chitinase?
   Trichoderma spp. là nấm đối kháng phổ biến, có khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase cao, dễ nuôi cấy và an toàn với môi trường, được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất chế phẩm sinh học bảo vệ thực vật.

3. Điều kiện nuôi cấy nào tối ưu để sinh tổng hợp enzyme chitinase?
   Môi trường bán rắn giàu dinh dưỡng, bổ sung chitin huyền phù 1-1,5%, nhiệt độ 30-35°C, pH 5-6 và độ ẩm 55-65% là điều kiện tối ưu giúp tăng hoạt độ enzyme chitinase.

4. Chế phẩm enzyme chitinase thô có thể sử dụng như thế nào trong thực tế?
   Chế phẩm có thể được phun hoặc tưới vào đất trồng cà chua để kìm hãm vi nấm gây bệnh, phối hợp với các chế phẩm sinh học hoặc thuốc hóa học để tăng hiệu quả phòng trừ.

5. Hiệu quả của chế phẩm enzyme chitinase so với thuốc hóa học ra sao?
   Chế phẩm enzyme chitinase có hiệu quả kìm hãm vi nấm tương đương hoặc cao hơn một số thuốc hóa học, đồng thời an toàn, thân thiện môi trường và không gây tồn dư độc hại.

Kết luận

• Đã tuyển chọn thành công chủng Trichoderma BL2 có hoạt độ enzyme chitinase cao nhất trong số các chủng khảo sát.
• Môi trường nuôi cấy bán rắn giàu dinh dưỡng với chitin huyền phù 1-1,5%, nhiệt độ 30-35°C, pH 5-6 và độ ẩm 55-65% là điều kiện tối ưu để sinh tổng hợp enzyme chitinase.
• Chế phẩm enzyme chitinase thô thu nhận từ Trichoderma BL2 có khả năng kìm hãm sinh trưởng và nảy mầm của vi nấm gây bệnh Fusarium sp. và Phytophthora sp. trên cây cà chua.
• Nghiên cứu góp phần phát triển chế phẩm sinh học thân thiện môi trường, giảm thiểu sử dụng thuốc hóa học trong nông nghiệp.
• Đề xuất mở rộng ứng dụng và nghiên cứu sâu hơn về enzyme chitinase và các chủng Trichoderma khác trong bảo vệ thực vật.

Áp dụng quy trình sản xuất chế phẩm enzyme chitinase thô trong quy mô công nghiệp, triển khai thử nghiệm thực địa và đào tạo kỹ thuật cho người sản xuất, nông dân. Đẩy mạnh nghiên cứu phối hợp enzyme chitinase với các chế phẩm sinh học khác để nâng cao hiệu quả phòng trừ bệnh hại cây trồng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Nấm Trichoderma spp. Vị trí phân loại Trichoderma được xem là nhóm vi nấm gây nhiều khó khăn trong phân loại vì các đặc điểm cần thiết cho việc phân loại chưa được phân tích đầy đủ. Trước đây, người ta cho rằng Trichoderma thuộc lớp Deuteromycetes, bộ Moniliales, họ Moniliaceae [64].

Hiện nay, dựa vào việc phân tích trình tự một số gen đặc trưng như ITS, tef, rpb, ech24, Druzhinina và cộng sự (2006) đã phân loại Trichoderma như sau [30]: Giới Fungi Ngành Ascomycota Lớp Euascomycetes Bộ Hypocreales Họ Hypocreaceae Chi Trichoderma 1. Đặc điểm sinh học Trichoderma spp. được tìm thấy nhiều trong MT tự nhiên, đặc biệt trong MT đất. Chúng phát triển trên nhiều loại cơ chất khác nhau (sáp, gỗ, các loài nấm khác).

là nhóm vi nấm phổ biến ở đất (pH = 3 – 8) như đất nông nghiệp, đồng cỏ, rừng, đầm muối và đất sa mạc…[33], [63]. Phần lớn Trichoderma spp. pseudokoningii có thể chịu độ ẩm cao hơn so với những loài khác. Tuy nhiên, các loài Trichoderma spp.

thường không chịu được độ ẩm thấp vì thế số lượng Trichoderma giảm đáng kể trong nơi có độ ẩm thấp [60]. Đa số các chủng Trichoderma phát triển trong đất có độ pH từ 2.5; pH tối thích là từ 4. Nhiệt độ tối ưu thường là 25 – 30oC. Một vài dòng phát triển tốt ở 35oC, một số ít phát triển ở 40oC [64].

KL nấm có màu trắng hoặc từ trắng đến lục, vàng xanh, lục xỉn đến lục đậm. Các chủng Trichoderma có tốc độ phát triển nhanh, KL có thể đạt đường kính từ 4 – 9 cm sau 4 ngày nuôi cấy ở 25oC. 10 Hình thái KL và BT của Trichoderma khác nhau khi ở những điều kiện nhiệt độ khác nhau. Ở 35oC chúng tạo ra những KL rắn, dị thường với sự hình thành BT nhỏ và mép KL bất thường, ở 37oC không tạo ra BT sau 7 ngày nuôi cấy.

Hầu hết các loài Trichoderma không có giai đoạn sinh sản hữu tính, chúng sinh sản vô tính bằng BT đính từ khuẩn ty. Khuẩn ty của Trichoderma không màu, cuống sinh BT phân nhánh nhiều. Ở cuối nhánh phát triển thành một khối tròn mang các BT trần không có vách ngăn, thường không màu. BT có dạng hình cầu, hình trứng hoặc hình trụ ngắn.

Sợi nấm có đường kính từ 0,5 – 10 µm, được bao bọc bởi thành tế bào. Thành tế bào không chứa cellulose như thực vật mà chứa chitin và một số thành phần khác như polysaccharide, lipit, protein, hexozamin, chất màu. Màng tế bào chất dày khoảng 7 µm chứa lipit (40%) và protein (38%) [62]. có thể sinh tổng hợp được nhiều loại enzyme ngoại bào như chitinase, glucanase, xylanase, pectinase, cellulase…để phân hủy các nguồn xác bã hữu cơ thực vật và vách tế bào nấm bệnh [13].

Cấu trúc của Trichoderma spp. Bề mặt tế bào của hầu hết các loại nấm bao gồm 3 lớp: màng nhày, vách tế bào, màng tế bào. Cấu trúc vách tế bào của Trichoderma thuộc dạng chitin-β-glucan. Tuy nhiên, chitin hiện diện ở hệ sợi nấm lại không có ở BT của T.

Vách tế bào của một vài chủng Trichoderma đã được phát hiện chứa galactose và N-acetyl-β -D-galactosimin lectin [43], [66]. có nhân điển hình, được bao quanh bởi một màng đôi. BT đính thường chứa nhiều hơn 1 nhân. có số lượng nhân khác nhau, một số đơn nhân, một số đa nhân.

reesei hình thành nhân nhỏ sau khi xử lý colchicin do sự phân chia nhân bất bình thường. Hàm lượng DNA trung bình của những nhân nhỏ này bằng khoảng 30% của nhân bình thường, gọi là đa bội lệch. Những nhân này có thể hữu ích cho việc vận chuyển những lượng DNA nhỏ vào trong thể nguyên sinh [43], [66]. Nghiên cứu gần đây cho thấy trong tế bào của chúng có tất cả các bào quan của một eukaryote.

Cấu trúc của 1 số bào quan (như thể golgi) thì khác biệt so với eukaryote nhưng vẫn chưa biết rõ những đặc tính về sinh hóa có khác nhau hay không. Một vài loài Trichoderma spp. chứa một lượng lưới nội chất khá lớn và nhiều nhất là ở chủng T. Các cơ chế đối kháng của Trichoderma với nấm gây bệnh cây trồng Nấm đối kháng là những nhóm VSV phổ biến của hệ vi sinh trong đất.

Chúng thường tiết ra các men, kháng sinh gây độc cho nấm gây bệnh hoặc cạnh tranh điều kiện sống với nấm gây bệnh. Nấm đối kháng có thể kìm hãm sự sinh trưởng, phát triển của nấm gây bệnh trên cây và giúp cây hồi phục, sinh trưởng phát triển. Trichoderma cũng là một trong những giống nấm có khả năng ức chế một số nấm gây bệnh như: Sclerotium rolfsii, Phytophthora, Fusarium, Pythium, Rhizoctonia… gây bệnh trên nhiều loài cây trồng. Sự đối kháng của nấm Trichoderma thông qua nhiều cơ chế  Cơ chế kí sinh Vào năm 1932, Weinding đã mô tả hiện tượng nấm Trichoderma ký sinh nấm gây bệnh và đặt tên cho hiện tượng đó là “Giao thoa sợi nấm” [68].

Hiện tượng giao thoa gồm ba giai đoạn như sau: Giai đoạn 1: Sợi nấm Trichoderma hướng về sợi nấm gây bệnh (nấm kí chủ). Hiện tượng này là đặc tính hướng hóa của Trichoderma spp., chúng sẽ hướng về nơi có chất hóa học do nấm chủ tiết ra. Khi tơ nấm Trichoderma đến gần tơ nấm kí chủ, chúng có xu hướng tiếp xúc và cuộn xung quanh sợi nấm chủ, sau đó hình thành cấu trúc móc hoặc ép sát sợi nấm kí chủ và phát triển song song với nấm kí chủ [68]. Giai đoạn 2: Sau khi vây quanh, sợi nấm Trichoderma sẽ thủy phân vách nấm kí chủ bằng cách tiết ra các enzyme ngoại bào như: chitinase, glucanase, cellulase [68].

Giai đoạn 3: Cuối cùng sợi nấm Trichoderma đâm xuyên làm thủng màng sinh chất của tế bào nấm kí chủ, làm cho chất nguyên sinh trong nấm kí chủ bị phân hủy và dẫn đến nấm bệnh bị chết [68].  Cơ chế cạnh tranh Một cơ chế khá phổ biến đã được nghiên cứu nhiều trong những năm gần đây là sự cạnh tranh của nấm đối kháng với nấm bệnh tại vùng rễ. có thể biểu hiện tính đối kháng thông qua việc cạnh tranh với nguồn gây bệnh cây về dinh dưỡng, nơi cư trú. Nấm Trichoderma thường định cư trước so với các nguồn gây bệnh cây.

Do đó, chúng chiếm chỗ định cư cũng như dinh dưỡng của nguồn gây bệnh [27].  Cơ chế tiết kháng sinh 12 Một số chất như trichozianine, trichothecene, trichotoxin A, viridin, ergokonin A… là kháng sinh có hoạt tính kháng nấm được phát hiện nhiều ở loài T.  Cơ chế tiết enzyme Cơ chế quan trọng giúp Trichoderma đối kháng hiệu quả với nấm gây bệnh cây trồng là nhờ vào khả năng tiết ra nhiều loại enzyme. Các loại enzyme do Trichoderma tiết ra gồm có: Endochitinase, glucanase 1,3-β- glucosidase, chitobiosidase, trypsin, chymotrypsin, cellulase, protease, N-acetyl- β - glucusaminidase (NAGase).

Cơ chế tác dụng của hệ enzyme chitinase Trichoderma phổ biến hiện nay là dựa vào vị trí thủy phân, gồm 3 nhóm: Endochitinase phân cắt ngẫu nhiên trong nội mạch của chitin và chitooligomer tạo thành sản phẩm là một hỗn hợp các polymer có trọng lượng phân tử khác nhau, nhưng chiếm đa số là các diacetylchitobiose (GlcNAc)2 do hoạt tính của endochitinase không thể phân cắt thêm được nữa [46]. Chitin 1,4-β-chitobiosidase phân cắt chitin và chitooligomer [(GlcNAc)n, n>3] từ đầu không khử và chỉ phóng thích diacetylchitobiose (GlcNAc)2 [46]. Ngoài ra, để khảo sát kiểu phân cắt, người ta sử dụng N-acetyl-chito-oligosaccharide làm cơ chất. Các oligsaccharide thường được thủy phân bên trong, trên một vài vị trí xác định hoặc một cách ngẫu nhiên.

Một số enzyme chitinase có khả năng thủy phân trisaccharid, một số khác thì không. Có hai dạng chitinase thủy phân pentasaccharide: một phân cắt bên trong tạo disaccharid và trisaccharid; một phân cắt bên ngoài tạo các monosaccharid và tetrasaccharid. Tóm lại chitinase thực chất là enzyme cắt ngẫu nhiên [50], [54]. Endochitinase, chitobiosidase và β-N-acetylhexosaminidase có thể hoạt động trên cơ chất là dịch huyền phù chitin, vách tế bào nấm, chitooligomer và hoạt động kém hơn trên chitin thô thu từ vỏ tôm.

Chitin và vách tế bào nấm chứa chitin là những cơ chất thích hợp cho endochitinase hơn là chitobiosidase và β-N-acetylhexosaminidase. Chitooligomer (GluNAc)3 và cao hơn nữa là sợi chitin đều là cơ chất của cả 3 loại enzyme trên nhưng β-N- 13 acetyl hexosaminidase thì hoạt động chậm hơn trong việc làm giảm độ đục của huyền phù chitin. (GlcNAc)2 là cơ chất tốt nhất của β-N-acetyl hexosaminidase nhưng không là cơ chất của endochitinase hay chitobiosidase. Chính vì thế, có thể sử dụng (GlcNAc)2 để phân biệt hoạt tính giữa endochitinase, chitobiosidase và β-N-acetyl hexosaminidase.

Sản phẩm sau cùng của sự phân cắt là N-acetyl glucosamine [54]. Như vậy, nhờ sự kết hợp của cơ chế tiết các enzyme ngoại bào và các cơ chế đối kháng khác mà Trichoderma spp. đã thể hiện khả năng đối kháng với vi nấm gây bệnh một cách tối ưu, hiệu quả. Vai trò - tiềm năng ứng dụng của Trichoderma spp.

 Kích thích cơ chế tự bảo vệ của thực vật Trong trường hợp này, Trichoderma spp. đóng vai trò là những nhân tố mẫn cảm với rễ, kích thích hệ thống miễn dịch chủ động và bị động ở thực vật. Khả năng đề kháng của thực vật tăng khi tăng: nồng độ của chất chuyển hoá; các enzyme liên quan đến cơ chế tự bảo vệ (phenylalanine ammonio-lyase, chalcone synthase); các enzyme liên quan tới sự tổng hợp phytoalexin, chitinase và glucanase. Sự có mặt các chất trao đổi của Trichoderma kích thích sự tổng hợp phytoalexin ở thực vật.

Đây là những protein liên quan đến sự kháng bệnh của cây. Nhờ đó, hệ thống gen thực vật có thể chủ động phản ứng lại các tác nhân gây bệnh và các nhân tố kích thích khác.Cơ chế tự bảo vệ thực vật có thể hoạt động mà không nhất thiết đòi hỏi sự kích thích của các sinh vật sống [41]. Ví dụ, lúa mạch có sức đề kháng với sự nhiễm Fusarium tăng lên khi có mặt của endochitinase từ T. Thuốc lá và khoai tây mang gen mã hóa chitinase từ T.

harzianum có sức chịu đựng cao hơn với điều kiện bất lợi của MT và hoàn toàn kháng lại nấm bệnh Alternaria alternate, Alternaria solani, Botrytis cinerea trên lá và với nấm bệnh từ đất như Rhizoctonia solani. Những kết quả tương tự đã đạt được với enzyme chitinase trong dâu tây; chitinase và β-1,6-glucanase trong dưa và cây cà chua. Sự kích hoạt các phản ứng tự bảo vệ thực vật sử dụng các nhân tố kích thích có thể là một chiến lược có giá trị như một thay thế cho việc sử dụng các thực vật biến đổi gen, để bảo vệ thực vật chống lại tác nhân gây bệnh [8].