Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu
Cây cam (Citrus sinensis (L.) Osbeck) thuộc họ Cam quýt (Rutaceae), là một trong những loại cây ăn quả lâu năm có giá trị dinh dưỡng và hiệu quả kinh tế cao. Trong thành phần thịt quả cam chứa nhiều vitamin (A, B1, C, B9), chất xơ, khoáng chất vi lượng và các hợp chất chống oxy hóa có tác dụng hỗ trợ tim mạch, kháng viêm. Vỏ quả chứa hàm lượng tinh dầu đáng kể, được khai thác trong công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm.
Tại Việt Nam, cây cam được canh tác rộng rãi tại nhiều vùng sinh thái, hình thành các vùng chỉ dẫn địa lý và thương hiệu nổi tiếng như cam Xã Đoài (Nghệ An), cam sành Bố Hạ (Bắc Giang), cam sành Hàm Yên (Tuyên Quang), cam Canh (Hà Nội). Theo số liệu thống kê của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn năm 2011, tổng diện tích cây có múi cả nước đạt 124.057 ha, trong đó diện tích trồng cam chiếm 70.300 ha (xấp xỉ 56%).
Do tác động của điều kiện tự nhiên, khí hậu, thổ nhưỡng và quá trình chọn lọc, các giống cam ở từng vùng địa lý có sự phân hóa di truyền rõ nét. Việc đánh giá đa hình di truyền là cơ sở khoa học quan trọng phục vụ công tác chọn lọc, lai tạo giống và bảo tồn nguồn gen. Phương pháp đánh giá dựa trên chỉ thị hình thái thường bị ảnh hưởng bởi sự tương tác giữa kiểu gen và môi trường. Do đó, việc ứng dụng các chỉ thị phân tử như RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) và ISSR (Inter-Simple Sequence Repeat) với ưu điểm thao tác nhanh, độ chính xác cao và không phụ thuộc vào giai đoạn sinh trưởng giúp xác định chính xác mối quan hệ di truyền giữa các dòng/giống cam.
Mục tiêu nghiên cứu:
Phân tích mối quan hệ di truyền giữa các giống cam nghiên cứu bằng phương pháp RAPD và ISSR.
Nhiệm vụ nghiên cứu (theo văn bản):
- Tách chiết được DNA tổng số từ lá cam, quýt đủ điều kiện để thực hiện phản ứng RAPD và ISSR.
- Phân tích được các phân đoạn DNA của các giống cam nghiên cứu bằng kỹ thuật RAPD và ISSR.
- Phân tích được mối quan hệ di truyền giữa các giống cam nghiên cứu dựa trên sơ đồ phả hệ DNA.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:
- Đối tượng nghiên cứu: 19 mẫu lá cam đại diện cho các dòng/giống khác nhau và 01 mẫu quýt làm đối chứng (ký hiệu Q_KH).
- Phạm vi không gian: Các mẫu lá được thu thập tại các xã Phù Lưu, Yên Lâm và Tân Thành thuộc huyện Hàm Yên, tỉnh Tuyên Quang.
- Địa điểm và thời gian thực hiện: Đề tài được thực hiện trong giai đoạn 2012 – 2016 tại Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử và Công nghệ gene, Viện Khoa học Sự Sống – Đại học Thái Nguyên, thuộc Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.
| STT |
Tên mẫu giống |
Ký hiệu mẫu |
Vị trí thu thập |
| 1 |
Sành Phù Lưu |
S_PL |
Phù Lưu – Hàm Yên |
| 2 |
Sành không hạt ghép gốc mật 1 |
S_KH/M1 |
Yên Lâm – Hàm Yên |
| 3 |
Sành không hạt ghép gốc mật 2 |
S_KH/M2 |
Yên Lâm – Hàm Yên |
| 4 |
Sành không hạt ghép gốc volka 1 |
S_KH/V1 |
Tân Thành – Hàm Yên |
| 5 |
Sành không hạt ghép gốc volka 2 |
S_KH/V2 |
Tân Thành – Hàm Yên |
| 6 |
Mật không hạt ghép gốc mật 1 |
M_KH/M1 |
Yên Lâm – Hàm Yên |
| 7 |
Mật không hạt ghép gốc mật 2 |
M_KH/M2 |
Yên Lâm – Hàm Yên |
| 8 |
Mật không hạt ghép gốc Volka 1 |
M_KH/V1 |
Tân Thành – Hàm Yên |
| 9 |
Mật không hạt ghép gốc Volka 2 |
M_KH/V2 |
Tân Thành – Hàm Yên |
| 10 |
Sành Hàm Yên 1 |
S_HY1 |
Yên Lâm – Hàm Yên |
| 11 |
Sành Hàm Yên 2 |
S_HY2 |
Yên Lâm – Hàm Yên |
| 12 |
Valencia 1 |
V2-1 |
Yên Lâm – Hàm Yên |
| 13 |
Valencia 2 |
V2-2 |
Yên Lâm – Hàm Yên |
| 14 |
Navel 1 |
NV1 |
Tân Thành – Hàm Yên |
| 15 |
Navel 2 |
NV2 |
Tân Thành – Hàm Yên |
| 16 |
Xã Đoài 1 |
XD1 |
Yên Lâm – Hàm Yên |
| 17 |
Xã Đoài 2 |
XD2 |
Yên Lâm – Hàm Yên |
| 18 |
Cam TH32-1 |
TH32-1 |
Tân Thành – Hàm Yên |
| 19 |
Cam TH32-2 |
TH32-2 |
Tân Thành – Hàm Yên |
| 20 |
Quýt không hạt (Đối chứng) |
Q_KH |
Hàm Yên – Tuyên Quang |
Cơ sở lý thuyết và phương pháp
Khung lý thuyết và nguyên lý chỉ thị phân tử
Cây cam, quýt thuộc giới Plantae, bộ Rutales, họ Rutaceae, chi Citrus. Tồn tại hai hệ thống phân loại chính: hệ thống của Tanaka phân loại chi tiết với 160 – 162 loài và hệ thống của Swingle phân chia thành 16 loài.
Trong nghiên cứu đa dạng di truyền thực vật, các chỉ thị phân tử DNA được sử dụng phổ biến bao gồm:
- Kỹ thuật RAPD: Dựa trên phản ứng PCR với các đoạn mồi ngẫu nhiên ngắn (10 nucleotide) có tỷ lệ GC tối thiểu 40%, bắt cặp ngẫu nhiên tại nhiệt độ thấp (34 – 37°C) trên hệ gen mà không cần biết trước trình tự DNA đích.
- Kỹ thuật ISSR: Sử dụng các đoạn mồi tiểu vệ tinh (microsatellite) dài 15 – 30 nucleotide để khuếch đại vùng DNA nằm giữa hai trình tự lặp lại đơn giản có chiều ngược nhau. Kỹ thuật này có độ lặp lại và tính ổn định nhiệt cao hơn RAPD.
- Các kỹ thuật đối sánh: RFLP (đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn), AFLP (đa hình chiều dài đoạn khuếch đại) và SSR (trình tự lặp lại đơn giản).
Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm
Nghiên cứu tiến hành theo các bước thực nghiệm sinh học phân tử chuẩn hóa:
- Tách chiết DNA tổng số: Mô lá cây có múi chứa hàm lượng lớn polysaccharide và polyphenol gây ức chế phản ứng khuếch đại PCR. Tác giả tiến hành thử nghiệm, so sánh và tối ưu qua 3 quy trình tách chiết (dựa trên nguyên lý CTAB và các cải tiến kỹ thuật).
- Kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ DNA:
- Phương pháp quang phổ hấp thụ UV-Vis: Đo độ hấp thụ quang tại bước sóng 260 nm và 280 nm trên máy Biomate 3.
$$\text{Hàm lượng DNA } (\mu\text{g/ml hoặc ng/}\mu\text{l}) = \text{OD}{260} \times 50 \times \text{Hệ số pha loãng}$$
$$\text{Độ tinh sạch} = \frac{\text{OD}{260}}{\text{OD}_{280}} \quad (\text{Khoảng chuẩn tinh sạch: } 1{,}8 - 2{,}0)$$
- Phương pháp điện di gel agarose: Sử dụng gel agarose 1,5% trong dung dịch đệm TAE 1X, nhuộm Ethidium bromide, chạy ở hiệu điện thế 80 – 110V, 100mA trong 35 phút.
- Phản ứng PCR-RAPD và PCR-ISSR:
- Thực hiện với thể tích phản ứng 20 $\mu$l trên máy PCR Applied Biosystems.
- Chu trình nhiệt: Biến tính ban đầu ở 94°C trong 4 phút; tiếp theo là 40 chu kỳ gồm biến tính ở 94°C trong 1 phút, gắn mồi ở 35°C trong 1 phút, kéo dài ở 72°C trong 2 phút; kéo dài cuối cùng ở 72°C trong 7 phút; giữ mẫu ở 4°C.
| Thành phần hóa chất |
Thể tích ($\mu$l) |
Nồng độ / Ghi chú |
| Nước cất khử ion ($H_2O$) |
14,7 |
Dạng tinh khiết sinh học phân tử |
| Đệm Taq polymerase (Buffer) |
2,0 |
Nồng độ 10X |
| Hỗn hợp dNTPs (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) |
0,4 |
Nồng độ 10 mM |
| Mồi (Primer RAPD / ISSR) |
0,8 |
Nồng độ làm việc |
| Enzyme Taq DNA Polymerase |
0,1 |
Hoạt tính 1 UI/$\mu$l |
| DNA khuôn mẫu (DNA tổng số) |
2,0 |
Mẫu tách chiết đạt chuẩn |
| Tổng thể tích phản ứng |
20,0 |
Cho 01 giếng phản ứng |
- Trình tự các đoạn mồi sử dụng trong nghiên cứu:
| STT |
Tên mồi |
Loại mồi |
Trình tự nucleotide ($5' - 3'$) |
| 1 |
OPA-08 |
RAPD |
GTGACGTAGG |
| 2 |
OPB-18 |
RAPD |
CCACAGCAGT |
| 3 |
OPC-08 |
RAPD |
TGGACCGGTG |
| 4 |
OPG-16 |
RAPD |
AGCGTCCTCC |
| 5 |
OPG-17 |
RAPD |
ACGACCGACA |
| 6 |
OPM-13 |
RAPD |
GGTGGTCAAG |
| 7 |
OPA-04 |
RAPD |
AATCGGGCTG |
| 8 |
OPO-04 |
RAPD |
AAGTCCGCTC |
| 9 |
OPQ-18 |
RAPD |
AGGCTGGGTG |
| 10 |
OPT-01 |
RAPD |
GGGCCACTCA |
| 11 |
ISSR-T1 |
ISSR |
(GT)$_6$CC |
| 12 |
ISSR-T2 |
ISSR |
(CT)$_6$TG |
| 13 |
ISSR-T3 |
ISSR |
(AC)$_6$CG |
Phương pháp phân tích và xử lý số liệu
Sản phẩm khuếch đại điện di được đọc và nhị phân hóa: ghi nhận giá trị 1 khi xuất hiện băng DNA (phân đoạn khuếch đại) và giá trị 0 khi không xuất hiện băng DNA tại cùng kích thước tương ứng. Dữ liệu nhị phân được phân tích bằng phần mềm NTSYSpc phiên bản 2.1 (Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System) để tính hệ số tương đồng di truyền và thiết lập sơ đồ cây phả hệ (dendrogram) theo phương pháp nhóm trung bình không trọng số UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean).
Nội dung chính theo từng chương
Phần 1: Mở đầu
Tác giả trình bày tính cấp thiết của việc nghiên cứu nguồn gen cây cam tại vùng sản xuất trọng điểm Hàm Yên, tỉnh Tuyên Quang. Nêu rõ các mục tiêu khoa học, nhiệm vụ cụ thể và ý nghĩa thực tiễn trong công tác chọn giống, bảo tồn nguồn gen bản địa và đánh giá mối quan hệ di truyền ở mức độ phân tử.
Phần 2: Tổng quan tài liệu
Chương này tổng hợp các tài liệu khoa học trong và ngoài nước:
- Nguồn gốc, phân loại học và các giá trị của cây cam quýt: dinh dưỡng (hàm lượng đường saccaroza 3,59%, glucose 1,25%, fructose 1,45%, vitamin C 65 mg/100g múi tươi và 170 mg/100g vỏ tươi), dược liệu, kinh tế và môi trường sinh thái.
- Tình hình sản xuất cam quýt trên thế giới (diện tích toàn cầu năm 2010 đạt trên 8,64 triệu ha) và tại Việt Nam giai đoạn 2006 – 2010.
- Nguyên lý, ưu điểm và nhược điểm của các chỉ thị phân tử RAPD, ISSR, SSR, RFLP, AFLP.
- Tổng hợp các công trình nghiên cứu đa hình di truyền trên chi Citrus trên thế giới (Machado 1996, Bastianel 1998, Coletta Filho 2000, Abkenar 2003, Mariniello 2005, Dehesdtani 2007, Baig 2008, Rima El-Mouei 2011, Malik 2012, Naz 2014) và tại Việt Nam (Nguyễn Hữu Hiệp 2004, Nguyễn Thanh Nhàn 2004, Trần Thị Oanh Yến 2004, Nguyễn Bá Phú 2011, Vũ Văn Hiếu 2015).
Phần 3: Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu
Trình bày chi tiết thông tin 20 mẫu vật liệu nghiên cứu thu thập tại Hàm Yên – Tuyên Quang, danh mục hóa chất (hãng Thermo Scientific, Merck, Bioneer), hệ thống thiết bị phân tích (máy PCR, máy đo quang phổ Biomate 3, tủ an toàn sinh học cấp 2 Nu-425-400E, máy chụp gel Gel Logic 1500 của Kodak). Chi tiết hóa 3 nội dung nghiên cứu, quy trình phản ứng PCR, danh sách 10 mồi RAPD và 3 mồi ISSR, cùng quy trình tính toán ma trận nhị phân trên phần mềm NTSYSpc 2.1.
Phần 4: Kết quả và thảo luận
Chương này tập trung vào 3 nội dung kết quả chính:
1. Tối ưu hóa quy trình tách chiết DNA tổng số từ mô lá cam quýt
Tác giả đã tiến hành thử nghiệm và so sánh 3 quy trình tách chiết để loại bỏ polysaccharide:
| Thông số kỹ thuật |
Quy trình 1 (Doyle & Doyle, 1987) |
Quy trình 2 (Cải tiến 1) |
Quy trình 3 (Quy trình tối ưu) |
| Nghiền mẫu bằng nitơ lỏng |
Không (nghiền trong đệm) |
Không |
Có (nghiền mịn trong nitơ lỏng) |
| Bổ sung $\beta$-mercaptoethanol |
Không |
Có ($2%$ so với đệm CTAB) |
Có ($2%$ so với đệm CTAB) |
| Nhiệt độ và thời gian ủ mẫu |
55°C trong 30 phút, vortex 10 phút/lần |
65°C trong 1 giờ, vortex 10 phút/lần |
65°C trong 1 giờ, lắc nhẹ 20 phút/lần |
| Tốc độ ly tâm thu pha trên |
10.000 vòng/phút trong 5 phút |
10.000 vòng/phút trong 10 phút |
12.000 vòng/phút trong 10 phút |
| Dung dịch hỗ trợ kết tủa DNA |
$CH_3COONH_4$ và cồn tuyệt đối |
$CH_3COONa$ và isopropanol |
NaCl 5M và isopropanol (tỷ lệ 1:1) |
| Dung dịch hòa tan DNA |
Nước cất vô trùng |
Đệm TE 1X |
Đệm TE 1X (ủ 80°C trong 10 phút) |
Đánh giá kết quả:
- Quy trình 1: Không thu được vệt băng DNA do polysaccharide gây cản trở và phân hủy mẫu.
- Quy trình 2: Thu được DNA nhưng bị đứt gãy nhiều (vệt smear kéo dài trên bản gel điện di), khi thử phản ứng PCR với mồi OPM-13 không khuếch đại được sản phẩm.
- Quy trình 3: DNA thu được có độ nguyên vẹn cao, băng sáng rõ, không bị lẫn tạp chất polysaccharide. Khi thực hiện phản ứng PCR kiểm tra với mồi OPM-13 trên mẫu số 10 và 20, sản phẩm khuếch đại hiện rõ băng đặc hiệu, chứng minh DNA đạt tiêu chuẩn cho phản ứng RAPD và ISSR.
2. Phân tích đa hình DNA bằng kỹ thuật PCR-RAPD và PCR-ISSR
- Điện di kiểm tra toàn bộ 20 mẫu DNA tổng số tách theo Quy trình 3 cho thấy nồng độ đồng đều, chất lượng tinh sạch.
- Thực hiện phản ứng PCR-RAPD với 10 đoạn mồi ngẫu nhiên (OPA-08, OPB-18, OPC-08, OPG-16, OPG-17, OPM-13, OPA-04, OPQ-18, OPT-01, OPO-04) và PCR-ISSR với 3 mồi (ISSR-T1, ISSR-T2, ISSR-T3). Các mồi cho sản phẩm khuếch đại rõ nét với các phân đoạn đồng hình và phân đoạn đa hình đặc trưng cho từng mẫu giống.
3. Phân tích mối quan hệ di truyền dựa trên sơ đồ phả hệ DNA
Dữ liệu nhị phân từ các băng DNA được nhập vào phần mềm NTSYSpc 2.1. Cây phả hệ phân tử mô tả mức độ tương đồng và khoảng cách di truyền giữa 19 mẫu cam và 01 mẫu quýt đối chứng, chỉ ra sự phân nhóm rõ ràng giữa các dòng cam sành, cam mật ghép trên các gốc ghép khác nhau (gốc mật, gốc Volkameriana) và các giống cam nhập nội (Valencia, Navel, TH32, Xã Đoài).
Phần 5: Kết luận và đề nghị
Đưa ra kết luận khẳng định tính hiệu quả của quy trình tách chiết DNA cải tiến và giá trị phân loại của 13 chỉ thị phân tử (10 RAPD, 3 ISSR). Nêu các kiến nghị ứng dụng vào công tác chọn lọc và nhân giống cây ăn quả có múi.
Kết quả và đóng góp
Kết quả chính
- Xây dựng quy trình tách chiết DNA tối ưu gồm 10 bước:
- Bước 1: Cân 0,5 g lá non, rửa sạch bằng nước cất.
- Bước 2: Cắt nhỏ mẫu lá và nghiền thành bột mịn trong nitơ lỏng.
- Bước 3: Chuyển bột lá vào ống Eppendorf chứa 1 ml đệm CTAB (đã làm ấm ở 65°C) bổ sung 2% $\beta$-mercaptoethanol, ủ ở 65°C trong 1 giờ (đảo trộn nhẹ sau mỗi 20 phút).
- Bước 4: Ly tâm 6.000 vòng/phút trong 5 phút.
- Bước 5: Hút 700 $\mu$l dịch nổi sang ống mới, bổ sung 700 $\mu$l hỗn hợp Chloroform : Isoamyl alcohol (24:1), đảo trộn đều, giữ ở nhiệt độ phòng 5 – 7 phút; ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút (lặp lại bước này 2 lần).
- Bước 6: Thu 350 $\mu$l pha trên, bổ sung Isopropanol lạnh theo tỷ lệ 1:1 cùng 50 $\mu$l NaCl 5M, ủ kết tủa qua đêm ở -20°C.
- Bước 7: Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút, loại bỏ dịch nổi, thu cặn tủa DNA.
- Bước 8: Bổ sung 1 ml cồn 70% lạnh để rửa tủa, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút (lặp lại 2 lần).
- Bước 9: Hút bỏ cồn, làm khô cặn tủa tự nhiên trong tủ cấy vô trùng.
- Bước 10: Hòa tan tủa DNA trong 50 $\mu$l đệm TE 1X (pH 8,0), ủ ở 80°C trong 10 phút để hòa tan hoàn toàn và bảo quản ở -20°C.
- Khuếch đại thành công chỉ thị phân tử: Đã xác lập điều kiện phản ứng PCR chuẩn cho 10 mồi RAPD và 3 mồi ISSR, tạo ra các phân đoạn DNA đa hình có tính lặp lại cao trên 20 mẫu nghiên cứu.
- Phân tích quan hệ phả hệ: Thiết lập ma trận hệ số tương đồng di truyền và cây phân loại phát sinh chủng loại bằng phần mềm NTSYSpc 2.1, xác định sự sai khác di truyền giữa các giống cam địa phương và giống cam nhập nội.
Giải pháp và đề xuất của tác giả
- Ứng dụng quy trình tách chiết DNA cải tiến (Quy trình 3) cho các nghiên cứu sinh học phân tử trên các đối tượng cây ăn quả thân gỗ chứa nhiều hợp chất thứ sinh và polysaccharide.
- Sử dụng bộ chỉ thị RAPD và ISSR đã khảo sát để kiểm định độ thuần của giống, phân biệt cây đầu dòng và giám định con lai trong các chương trình chọn tạo giống cây có múi tại địa phương.
Đóng góp khoa học
- Cung cấp dẫn liệu phân tử về nguồn gen cam quýt tại huyện Hàm Yên, tỉnh Tuyên Quang.
- Chứng minh khả năng ứng dụng phối hợp giữa kỹ thuật RAPD và ISSR trong phân tích đa hình di truyền thực vật mà không cần đầu tư giải trình tự toàn bộ hệ gen.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
Hạn chế của nghiên cứu
- Số lượng mẫu nghiên cứu tập trung trên 19 mẫu giống cam và 01 mẫu đối chứng trong phạm vi địa bàn huyện Hàm Yên, tỉnh Tuyên Quang, chưa bao quát toàn bộ các vùng trồng cam khác tại miền Bắc.
- Bản chất của chỉ thị RAPD và ISSR là chỉ thị trội (dominant markers), không cho phép phân biệt trạng thái kiểu gen đồng hợp tử và dị hợp tử tại từng locus.
Hướng nghiên cứu tiếp theo
- Mở rộng phạm vi thu thập mẫu trên các vùng sinh thái trồng cam khác ở quy mô liên tỉnh.
- Kết hợp sử dụng thêm các chỉ thị phân tử đồng trội có độ phân giải và tính ổn định cao như SSR (Simple Sequence Repeats) hoặc chỉ thị đơn nucleotide (SNP) và giải trình tự gen đặc hiệu để xây dựng bản đồ di truyền chi tiết.
Giá trị tham khảo
Tài liệu này hữu ích cho:
- Sinh viên, học viên cao học ngành Công nghệ Sinh học, Nông học, Di truyền học và Chọn giống cây trồng: Tham khảo phương pháp bố trí thí nghiệm sinh học phân tử, kỹ thuật PCR-RAPD, PCR-ISSR và quy trình xử lý dữ liệu ma trận nhị phân trên phần mềm NTSYSpc 2.1.
- Nghiên cứu viên làm việc trong phòng thí nghiệm phân tích thực vật: Có thể áp dụng trực tiếp quy trình 10 bước tách chiết DNA tối ưu cho các mẫu lá giàu polysaccharide, polyphenol và tinh dầu nhằm khắc phục hiện tượng ức chế phản ứng khuếch đại enzym Taq polymerase.
- Cán bộ quản lý nguồn gen và khuyến nông: Sử dụng các dẫn liệu về hệ số tương đồng di truyền để định hướng quy hoạch vùng trồng, quản lý nguồn gen cam sành Hàm Yên và các giống nhập nội.
Câu hỏi thường gặp
1. Tại sao quy trình tách chiết DNA truyền thống của Doyle & Doyle (1987) thất bại trên mẫu lá cam và tác giả đã khắc phục bằng cách nào?
Trong mô lá cam chứa hàm lượng rất lớn hợp chất polysaccharide và polyphenol. Khi dùng quy trình truyền thống (Quy trình 1), polysaccharide kết tủa cùng DNA tạo dịch nhầy, gây đứt gãy DNA và ức chế enzyme Taq polymerase trong phản ứng PCR. Tác giả đã khắc phục bằng Quy trình 3: nghiền mẫu trong nitơ lỏng để phá vỡ vách tế bào nhanh và bất hoạt nuclease; bổ sung 2% $\beta$-mercaptoethanol vào đệm CTAB ủ ở 65°C; dùng dung dịch NaCl 5M kết hợp Isopropanol để tăng độ tan của polysaccharide, ngăn chúng kết tủa cùng DNA; và hòa tan tủa trong đệm TE 1X ở 80°C trong 10 phút.
2. Thành phần và điều kiện chu trình nhiệt của phản ứng PCR trong khóa luận được thiết lập như thế nào?
Mỗi phản ứng PCR có tổng thể tích 20 $\mu$l gồm: 14,7 $\mu$l $H_2O$, 2,0 $\mu$l Buffer 10X, 0,4 $\mu$l dNTP (10 mM), 0,8 $\mu$l mồi, 0,1 $\mu$l Taq polymerase (1 UI/$\mu$l) và 2,0 $\mu$l DNA khuôn. Chu trình nhiệt gồm: biến tính ban đầu ở 94°C trong 4 phút; 40 chu kỳ lặp lại gồm biến tính 94°C trong 1 phút, bắt cặp mồi ở 35°C trong 1 phút, kéo dài 72°C trong 2 phút; kết thúc bằng giai đoạn kéo dài 72°C trong 7 phút và giữ mẫu ở 4°C.
3. Tập mẫu nghiên cứu gồm những giống cam nào và được thu thập tại đâu?
Nghiên cứu khảo sát 19 mẫu cam và 01 mẫu quýt đối chứng (Q_KH) thu thập tại 3 xã (Phù Lưu, Yên Lâm, Tân Thành) thuộc huyện Hàm Yên, tỉnh Tuyên Quang. Danh sách gồm: Cam sành Phù Lưu, Cam sành không hạt ghép gốc mật (2 mẫu), Cam sành không hạt ghép gốc Volka (2 mẫu), Cam mật không hạt ghép gốc mật (2 mẫu), Cam mật không hạt ghép gốc Volka (2 mẫu), Sành Hàm Yên (2 mẫu), Valencia (2 mẫu), Navel (2 mẫu), Xã Đoài (2 mẫu) và Cam TH32 (2 mẫu).
4. Danh sách các mồi RAPD và ISSR được sử dụng trong đề tài gồm những mồi nào?
Nghiên cứu sử dụng 10 đoạn mồi ngẫu nhiên RAPD (OPA-08, OPB-18, OPC-08, OPG-16, OPG-17, OPM-13, OPA-04, OPO-04, OPQ-18, OPT-01) và 3 mồi ISSR (ISSR-T1: $(GT)_6CC$, ISSR-T2: $(CT)_6TG$, ISSR-T3: $(AC)_6CG$).
5. Phương pháp nào được sử dụng để xử lý dữ liệu điện di và xây dựng cây phả hệ di truyền?
Tác giả sử dụng phương pháp nhị phân hóa kết quả điện di: mã hóa sự xuất hiện của phân đoạn DNA là 1 và không xuất hiện là 0. Toàn bộ ma trận số liệu nhị phân được xử lý trên máy tính bằng phần mềm chuyên dụng NTSYSpc phiên bản 2.1, áp dụng thuật toán UPGMA để tính toán hệ số tương đồng di truyền và vẽ sơ đồ phả hệ (dendrogram).
Kết luận
Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Trần Thị Thu Thủy đã hoàn thiện quy trình tách chiết DNA tổng số chất lượng cao từ lá cây cam quýt giàu polysaccharide bằng phương pháp CTAB cải tiến có bổ sung nitơ lỏng, 2% $\beta$-mercaptoethanol và NaCl 5M. Đề tài đã ứng dụng thành công 10 mồi RAPD và 3 mồi ISSR để phân tích các phân đoạn DNA đa hình trên 20 mẫu giống thu thập tại huyện Hàm Yên, tỉnh Tuyên Quang. Kết quả xử lý số liệu trên phần mềm NTSYSpc 2.1 đã xác lập sơ đồ phả hệ phản ánh mối quan hệ di truyền rõ ràng giữa các dòng cam sành, cam mật và các giống cam nhập nội, cung cấp cơ sở khoa học phục vụ công tác bảo tồn nguồn gen và chọn tạo giống cây ăn quả có múi.
